修改后的o以EDTA-NaOH为缓冲液的天然水体中痕量铵的-邻苯二醛荧光分析方法

摘要

在存在适量的乙二胺四乙酸二钠（EDTA）中，即使样品溶液调整为强碱，也不会在海水和其他天然水中发生沉淀，即使样品溶液调节到强碱，和NH_3.在最佳pH范围内- opa -亚硫酸盐反应可用于天然水体中铵的测定。在此基础上，进行了修改o建立了天然水体中痕量铵的-苯二醛荧光分析方法。在单变量实验设计的基础上，对试剂浓度、pH、反应时间、EDTA影响等实验参数进行了优化。结果表明，最适pH范围为10.80 ~ 11.70。EDTA对荧光强度无明显影响。该方法的线性范围为0.032-0.500µ0.250 - -3.00 mol / Lµ-20.0 mol / L和1.00µmol/L分别在激发/发射狭缝为3 nm/5 nm、3 nm/3 nm和1.5 nm/1.5 nm处。方法检测限为0.0099 µmol / L。与传统的OPA方法相比，该方法具有灵敏度高、不富集的优点。

1.介绍

氨氮由氨(NH)组成_3.)及铵()。pH < 8.75时以铵为主，大于9.75时以氨为主[1］.铵是大多数天然水域pH值范围内的主要物种，也是水生生态系统的一种必需养分[2］.在大多数大陆水和沿海海水中，铵的浓度通常超过微摩尔，甚至由于环境污染而达到毫摩尔[3.］.然而，在海水中，它低于微摩尔，甚至低至纳米摩尔[4］.铵态氮浓度的准确测量是了解水生生态系统中氮生物地球化学的基础。测量淡水和海水中铵含量最常用的方法是靛酚蓝法[5，6] 和o-邻苯二醛(OPA)荧光测定法[7- - - - - -15］.这o- 酞甲醛（OPA）荧光法比靛酚蓝方法更敏感。它引起了科学家的大量关注。1971年，首先报道了OPA可以与氨基酸和铵在存在的巯基乙醇中反应，以产生强荧光化合物[7］.1989年，Genfa和Dasgupta用亚硫酸盐代替硫醇对反应进行了修饰，有机胺类化合物不干扰测定，并开发了一种对铵具有更高灵敏度和选择性的OPA荧光测定方法[8］.然后，进一步修饰该方法以确定海水中铵的[9- - - - - -11]，并采用流动喷射技术在船上开发[12- - - - - -14］.近年来，荧光检测与流动分析、固相萃取相结合，进一步显著提高了OPA法测定海洋表层水的灵敏度[15］.表中列出了上述OPA方法的主要分析参数1．表中所列的定量下限(LOQ)为相应文献中工作范围的最低浓度。表格1结果表明，采用流动注射、自主批处理和固体萃取等先进技术，方法的灵敏度逐渐提高，定量限逐渐降低。

NH的荧光反应_3.- 发现硫酸盐依赖于普遍报告的工作。2008年Amornthammarong和Zhang据报道，最佳pH值为11 [12］.而当pH值大于10.4时，由于天然水样中金属离子的存在，容易发生沉淀。为了避免金属离子的沉淀，必须用四硼酸钠溶液作为缓冲液，将pH值控制在9.3左右[9，10，14，15］.根据报道的数据，该方法在pH = 9.3时的灵敏度比pH = 11时的灵敏度低几倍。因此，认为改变反应的ph值也可以证明方法的灵敏度_3.描述了以EDTA-NaOH为缓冲液的- opa -亚硫酸盐反应。在EDTA适量存在的情况下，即使将溶液调到强碱度和NH，也不会在天然水中发生沉淀_3.在最佳pH条件下- opa -亚硫酸盐反应可用于天然水体中氨的测定。在此基础上，进行了新的修改o建立了-苯二醛荧光分析方法。该方法对不富集的天然水体中铵的测定具有较高的灵敏度。

2.实验

2．1．试剂和解决方案

除另有说明外，本研究使用的所有化学试剂均为分析级，由中国阿拉丁化学试剂有限公司提供。所有溶液均在超纯水(电阻率18.2 MΩ)中制备厘米)。

标准解决方案。铵标准储备溶液（1000mg N / L）购自Aladdin Chemical Regent Co.铵标准终止溶液（10mmol/L)，每月用超纯水稀释。在不使用的情况下，库存和子库存溶液在4°C的冰箱中存储。铵工作溶液(0.1 mmol/L)，将1.0 mL底液用超纯水稀释至100 mL。

荧光试剂溶液(R₁）.将2.65 g OPA溶于50 mL甲醇(HPLC级)中，用超纯水稀释至250 mL，制得10.6 g/L OPA溶液(试剂A)。将1.25 g钠溶解制成2.5 g/L亚硫酸钠溶液(试剂B)₂所以_3.在500ml超纯水中加入0.20 mL HCHO以防止溶液被氧化。为减少试剂空白，荧光试剂溶液(R₁)，每天将等量的试剂A与试剂B混合，在室温下放置至少2小时，然后以3.0 mL/min的流速通过OASIS HLB 6cc / 200mg cartridge (Waters Corp, Millford, MA)。

EDTA-NaOH缓冲溶液(R₂)和氢氧化钠溶液。EDTA-NaOH缓冲溶液(R₂)，将46.6 g乙二胺四乙酸二钠(EDTA, ACS级)和8.75 g NaOH (ACS级)溶于500 mL超纯水中制备。氢氧化钠溶液(右_3.)， 10.0 g NaOH (ACS级)溶于500 mL超纯水。四硼酸钠缓冲溶液(R₄)，溶解3.75 g Na₂B₄O₇ 10 h₂O在500毫升超纯水。将上述三种溶液分别煮沸10分钟，以除去氨，直至溶液最终体积减少到原来体积的一半，立即在水浴中冷却，并密封在聚丙烯瓶中。这些瓶子在不使用时使用聚乙烯袋进行双层包装。

实验中使用的所有容器都先用1mol溶液浸泡l⁻¹HCl浸泡12小时以上，用RO水清洗，然后用1mol浸泡l⁻¹使用前用超纯水彻底清洗。

2．2.分析方法

2.2.1。该方法

20ml标准铵溶液或样品溶液，浓度范围为0.032-15.0μmol/L被精确地测量到聚丙烯瓶中。适量荧光试剂(R₁)和缓冲(R₂)加入溶液中。最终溶液中OPA、亚硫酸钠和EDTA浓度分别为0.691 g/L、0.163 g/L和5.77 mmol/L。通过加入适量的氢氧化钠溶液(R_3.）.加入所有试剂后，将混合溶液密封，室温下反应50分钟。至少可以同时测定10个样品。荧光强度(FI)在荧光分光光度计(RF-5301PC, SHIMADZU Co.， Ltd, Japan)上测量，激发波长为361 nm，发射波长为423 nm。

2.２.２.经典的OPA方法

基于的方法[10，15]， 20 mL标准铵溶液或样品溶液，浓度范围为0.250-2.00μmol/L被精确地测量到聚丙烯瓶中。两种3 mL荧光试剂(R₁)和5 mL四硼酸钠缓冲液(R₄)加入溶液中。加入所有试剂后，将混合溶液密封，室温下反应60分钟。反应溶液的pH约为9.3。荧光强度(FI)是在同一仪器测量与提出的方法。

3.结果与讨论

3.1。参数优化

的OPA-NH_3.-亚硫酸盐反应可能受参数OPA和亚硫酸钠浓度、反应时间和ph的影响。这些参数经过大量的工作优化[7- - - - - -10］.但由于加入了EDTA-NaOH缓冲溶液，反应体系与之前的工作有所不同，因此再次基于单变量实验设计进行优化。

3.1.1。反应产物的光谱特性

0.25μ在EDTA-NaOH缓冲液的存在下，允许mol/L标准铵溶液与OPA和亚硫酸钠反应2．2.1．反应产物的激发光谱和发射光谱如图所示1．

该产品具有最大激发波长()，最大发射波长()，显示与Genfa和Dasgupta(1989)报道的相似的光谱特征。结果表明，EDTA对其光谱特性没有影响。完成opa -亚硫酸盐- nh所需的时间_3.在此条件下，在室温下反应约50 min。激发波长为361 nm，发射波长为423 nm，反应时间为50 min。

3.1.2。pH对OPA-NH反应的影响_3.亚硫酸盐

据报道，OPA-NH_3.- 锍反应可以是pH依赖性并形成荧光异吲哚络合物[16］.Kuo等报道的最适pH为10-10.5 [17据amnthammarong和Zhang报道，11岁[12］.不同文献报道的最佳pH范围并不完全一致，但一致认为pH对荧光异吲哚配合物的形成有明显的影响。在本工作中，研究了pH从9.5到12.0的影响。如图所示2，荧光强度（FI）随着第9.5至10.80的9.5增加而增加，在pH范围为10.80-11.70的pH范围内，然后在pH高于11.70时减少。最大fi大约是pH = 9.5的三倍。变异趋势和最佳pH范围类似于Amornthammarong和张[12］.采用EDTA-NaOH缓冲溶液将溶液pH控制在11.0-11.4范围内，以获得更好的方法灵敏度。本节详细讨论了EDTA效应3.1.4．

3.1.3。OPA和亚硫酸钠浓度的影响

在0.115-0.913 g/L范围内研究了OPA浓度对荧光反应的影响3.）.荧光强度随着OPA浓度的增加而增加，0.115至0.457g / L，当OPA浓度为0.457和0.913g / L时保持稳定。因此，选择最终溶液中的OPA浓度为0.691g / L的所有后续实验。

亚硫酸钠在0-10 g/L范围内的影响如图所示4．当亚硫酸钠浓度从0增加到0.081 g/L时，荧光强度迅速增加，并在0.081 ~ 0.326 g/L范围内保持不变，当亚硫酸钠浓度大于0.326 g/L时，荧光强度缓慢下降。因此，本工作选择的最终溶液亚硫酸钠浓度为0.163 g/L。

在这项工作中，发现OPA和亚硫酸钠是试剂空白的主要来源。为了减少试剂空白，将OPA和亚硫酸钠溶液按照本节的描述混合在一起2.1并通过HLB药盒。在混合溶液中，试剂中的铵与过量的OPA和亚硫酸钠反应生成异吲哚络合物。用HLB柱萃取异吲哚配合物，去除溶液中的铵。溶液中的大部分OPA和亚硫酸钠通过色谱柱。通过的溶液作为荧光试剂。在冰箱4°C下可稳定保存一周，但由于周围空气的影响，试剂空白会缓慢增加。为降低试剂空白，本工作每天配制混合溶液。

3.1.4。EDTA的影响

EDTA是一种强金属离子络合剂。在适当数量的EDTA存在下，即使将溶液调至强碱性，也不会发生沉淀。当3 mL EDTA-NaOH缓冲溶液(R₂）在这项工作中加入20mL海水样品中，溶液的pH可以在11.0-11.4的范围内调节，并且不会出现沉淀。最终溶液中EDTA的浓度为5.77mmol / L.该剂量也适用于测定淡水样品。为了研究EDTA的效果，在EDTA的存在或不存在中分别确定不同浓度标准铵溶液的FI。结果列于表中2．EDTA存在与不存在的FI信号没有明显差异，说明EDTA对铵的荧光测定没有明显影响。在该方法中，EDTA可用于防止金属离子沉淀。

3．2.校准曲线、灵敏度、重现性和方法检测限

在上述选择的最优条件下，根据Section确定了典型的校准曲线2．2.1．结果列于表中3.．线性范围为0.032-0.500、0.250-3.00、1.00-20.0μmol/L分别在激发/发射狭缝为3 nm/5 nm、3 nm/3 nm和1.5 nm/1.5 nm处。根据水样中铵的浓度，标定曲线可用于典型样品的分析，线性范围不同。

在与所提出的方法相同的实验环境下，根据截面确定经典OPA方法的校准曲线2．2.2和为FI =+ 60.7时，激发/发射狭缝为3 nm/5 nm3.）.所提出的方法的斜率为1237.6，是经典OPA方法的4倍。这照亮了所提出的方法比经典方法更敏感。

采用5次重复性测定，回收率为0.250μMol / L铵标准溶液。相对标准偏差为3.2％。在3nm / 5nm的激发/发射狭缝确定11个空白溶液，平均fi为45.71，标准偏差为4.09。方法检测限估计为空白标准偏差的三倍，为0.0099 μmol / L。

3．3.方法的验证

3.3.1。复苏

在桂林瑶山风景区采集了淡水、地下水和山泉水样本。在南海采集表层海水样品，并进行一年的老化处理。为了检验该方法的回收率，这三个样品添加了一系列的铵浓度(0,0.125,0.250,0.500,1.000)μmol/L)，并结合标定曲线进行分析。矩阵峰电位曲线及相应校准曲线的线性方程如表所示4．由于室温和不同日子的其他环境参数的轻微差异，校准曲线的斜率并不完全相同。为了避免实验环境的影响，同时确定基质尖刺曲线和相应的校准曲线。掺入样品中的铵的回收表示为基质尖峰曲线的斜率与相应校准曲线的比率[18］.淡水和海水基质中铵的平均回收率为97.60% ~ 103.83%，说明水样中其他胺对铵的测定没有干扰。该方法适用于淡水和海水。

3.3.2。与经典OPA方法的比较

利用该方法对南海两个典型海水样品进行了分析2．2.1．同时，使用根据部分的经典OPA方法测定铵浓度2．2.2．对比结果见表5．使用配对的学生的t-检验在95%置信水平，以检验两种方法之间的差异，计算t-值低于临界值t价值。这说明本文提出的方法与经典OPA方法没有统计学上的显著差异。

3.3.3。应用程序

华坚河位于桂林市境内，流经桂林电子科技大学华坚校区。2013年12月27日采集华涧河23个地表水样品，按0.45过滤μ收集后尽快过滤。过滤后的水样在4℃下冷藏后测定。样品分别用本方法和靛酚蓝法进行分析[5在24小时内。当水样中铵的浓度小于15μmol/L时，根据本节测定水样的FI2．2.1，并在适当的线性范围内校准曲线3.用于定量铵的浓度。否则，在测定前应将水样稀释。图中的结果5在0.44 ~ 38.25范围内，两种方法具有很好的一致性μmol / L。花涧河铵态氮的空间变化如图所示6．在GUET下游约500 m的河流中，铵的浓度较高。上游的铵态氮浓度较低，并随着离GUET距离的增加而逐渐降低。这说明GUET的排放可能是河流中铵的主要来源。

4.结论

建立了一种以EDTA-NaOH为缓冲液测定天然水体中痕量铵的改进的OPA荧光分析方法。在这个方法中，NH_3.在最佳pH条件下- opa -亚硫酸盐反应可用于天然水体中铵的测定。该方法与经典OPA方法的结果无显著统计学差异。结果表明，该方法与靛酚蓝法的测定结果基本一致。与传统的OPA方法相比，该方法的主要优点是在最优pH条件下通过增加反应量来提高灵敏度。它不需要富集就能定量测定纳米级铵。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

基金资助:国家自然科学基金资助项目(no。41206077)。感谢厦门大学袁东兴教授小组提供的海水样品。

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