开发一个单变量的膜基中红外蛋白质定量方法和总脂质含量生物样品的分析

文摘

生物样品呈现出一系列复杂多组分混合物均匀纯化蛋白。准确的资格下游应用程序这样的样品是至关重要的。我们描述的发展米尔spectroscopy-based分析方法同时提供蛋白质定量(0.25 - 5毫克/毫升)和总脂质或洗涤剂物种的分析,以及其他生物分子在生物样本的识别。提示该方法利用亲水聚四氟乙烯膜工程干的水样本格式兼容快速红外分析。与经典的量化技术,报道的方法是氨基酸序列独立,因此适用于复杂的未知样本组成。通过比较现有平台,这个MIR-based方法可以直接量化使用最少的样本体积(2µL);它是适合重复访问和有限的样本大小是至关重要的参数。进一步,可以得到准确的结果没有专门培训或知识的红外光谱。总的来说,简化应用程序和分析系统提供了一个更具成本效益的替代高通量红外系统研究实验室用最小的吞吐量要求。总之,MIR-based系统提供了一个可行的替代当前蛋白质定量方法;它还提供同时资格的其他组件,尤其是脂质和洗涤剂。

1。介绍

正确估计水的生物样品中蛋白质含量是一个重要的步骤在生化研究和制药行业影响下游应用程序从生物标志物研究在biotherapeutics的生产质量控制。测定蛋白质浓度在最受欢迎的分析通过比较完成基于消光系数(紫外线测量)或与一个标准(BCA等传统dye-based吸光度测定,洛瑞,和布拉德福德)(1- - - - - -3]。然而,最近的评论指出,由于assay-specific限制,没有单一的方法控制蛋白质量化(1,3]。虽然基于紫外线的量化是依赖吸光度的色氨酸,酪氨酸,半胱氨酸在280 nm (4,5),一种蛋白质的消光系数可以用序列差异很大。事实上,大于两倍的消光系数计算之间的区别是观察白蛋白和免疫球蛋白g .此外,未知成分的混合物(最明显的是,生物相关样品)不能自信地量化基础上吸收280海里。比色分析深受洗涤剂和其他试剂的存在。此外,氨基酸分析(AAA)的可能是最准确的蛋白质定量(2),但该方法是昂贵的和冗长的周转时间如果样品被发送到第三方进行分析。执行内部,AAA需要耗时的样品操作和专业设备。

红外(IR)光谱是一个强大的和不断增长的分析工具的检测和分析生物医学相关的化合物,如蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸(6- - - - - -9]。Midinfrared (MIR)吸收光谱法是基于近似的辐射范围4000 - 400厘米⁻¹和目前被认为是最有前途的光谱技术应用在生物医学研究和诊断10- - - - - -12]。同时,米尔光谱学被公认为脂质分析的可行方法13- - - - - -16),是一个最古老的和完善的实验技术分析蛋白质和碳水化合物的结构(17- - - - - -21]。衰减全反射(ATR)光谱和透射材料细胞与复杂的最优化结合使用数据分析最近启用快速定量蛋白质分析直接从水溶液样品(22- - - - - -29日]。然而,尽管材料细胞对蛋白质定量允许自动化的示例分析,这些设备都有堵塞的习性,需要频繁,耗时的清洗程序。而ATR细胞更强劲,所需的样品卷(汽车销售μL)可能被认为是重要的,特别是在生物样本的情况下,有限体积和重复访问,进行分析。ATR-based测量需要更少的样品进行干燥样品。然而,由于增强敏感性,多元的方法(例如,偏最小二乘(PLS)分析)通常是应用于数据分析(14,22- - - - - -29日)减少吸引力在生物实验室常规方法的应用,通常缺乏所需的时间和专业知识方法的开发和验证。据我们所知,一个简单、快速、可靠的方法利用ATR和单变量数据分析准确、可复制的蛋白质定量从复杂的生物样本干格式尚未报道。

酰胺带几件物品已经被确认在米尔光谱学使蛋白质的表征和量化。其中,酰胺(1600 - 1690厘米⁻¹)和酰胺二世(1480 - 1575厘米⁻¹)是公认的最具代表性的振动模式(17,18]。酰胺我吸收主要由C = O伸缩振动与未成年人(大约80%)碳氮伸缩振动的贡献(20%),而酰胺二世乐队更同样分离- h弯(60%)和碳氮拉伸(40%)(30.]。直到最近,酰胺I和II吸收区域的分析已经严重阻碍水样品中由于光谱干扰强烈的水吸收带的1500 - 1700厘米⁻¹(25]。虽然ATR的出现和流通型细胞绕过水干扰问题,其效用是有限的,由于实际的缺点包括仪器成本、所需专业知识、时间和方法开发和准确的数据分析。

一个简单的单变量(Beer-Lambert)分析,应用于这里的报道方法,依赖于一体的酰胺我带,使用直接搜索的吸收光谱曲线。报告蛋白由米尔量化,同时基于曲线拟合技术,提出了实质性的优势等当前方法紫外吸光度或比色测定。首先,与紫外吸光度在280 nm, MIR-based蛋白质定量依赖于氨基酸组成要少得多。同时,酰胺结合定量的米尔不受信号干扰许多常见生物缓冲组件(如洗涤剂,减少代理商,螯合剂,展示优势标准比色测定。此外,MIR-based方法使快速、准确肽定量为研究人员提供一个健壮的代替耗时的氨基酸分析。然而,相比,紫外光谱,红外光谱仪器更昂贵,需要专业技术以及耗时的方法开发预防广泛适用性的米尔普通蛋白的量化。因此,乐器或方法,允许简单的样品和更具成本效益的分析,同时结合基于ATR的优点和主要材料的系统,将独特的价值。此外,与紫外线或任何其他已知的蛋白质定量方法,简单,MIR-based分析也可以用于同时分析脂质或洗涤剂14,30.- - - - - -36]。由于其化学成分复杂多样,脂类在许多不同的区域的红外吸收光谱。脂质特征带,如脂肪族组拉伸(3000 - 2800厘米⁻¹)、酯C = O拉伸(约1740厘米⁻¹)或磷酸拉伸(约1235厘米⁻¹)允许脂质含量的定性和定量分析14,31日,32]。由于相似的成分,洗涤剂具有米尔吸收光谱相似,可以分析脂质存在于细胞膜和脂质。这个共性提供研究人员监测手段的效率残留洗涤剂去除lysate-derived样品前下游应用程序。

本文中报告的方法使用一个亲水聚四氟乙烯(PTFE)膜工程示例应用程序和保留。膜是透明的米尔地区用于蛋白质和脂质/洗涤剂分析。示例应用程序的大小点进一步设计为略小于红外光束,确保整个样本的调查。这使简单的约束特性是重要,单变量,定量测量。相比现有技术和仪器(如力量HTS-XT系统光学),这里所描述的方法在技术上不复杂;因此,它是更具成本效益的,特别适合小样本数据的常规分析。同时,考虑到最小体积(2μL)所需的测量,这种方法可以成功地申请了珍贵的材料可用在数量有限的分析。

发表论文提供了一个方法开发的详细描述和比较其他蛋白质定量技术经常用于生物实验室,对所需的样本数量,时间消耗、劳动强度、精度和鲁棒性。除了普通蛋白的量化,同时脂质分析的能力也被调查。解决方案的几个特征纯化蛋白质,蛋白质混合物,和脂质和洗涤剂的例子被用来评估量化限制,动态范围、线性、准确性、报告方法的精度和鲁棒性。进一步为生物样品分析方法的适用性是演示了使用细胞溶解产物和组织匀浆。

2。材料和方法

2.1。试样容器设计

为了避免清洗步骤之间一系列的连续测量,一次性设备示例应用程序设计。从几个调查选项,膜基系统成为最合算的和容易使用,主要是因为它允许快速除水和干燥的样品。各种膜进行测试(数据未显示);最终选择亲水性PTFE-based膜由于其透明度有关米尔地区内,允许量化的蛋白质和脂类。如图1(一),膜光谱包含1100和1300厘米之间的一个强烈的信号⁻¹但米尔地区是透明高于1300厘米⁻¹用于生物样品的分析报告。亲水聚四氟乙烯膜(30μ米厚)是安装在纸板框架,以便更容易处理和提供一个地方记录样本的名字,同时也保证一致的米尔梁表示接受审问。卡配置包含四个分析领域设计的简单应用程序和控制整个样本的红外光束。亲水的示例应用程序(4.5毫米直径;参见图1 (b)和补充图将网上,补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/657079)周围是一个疏水环所产生的机械清除表面亲水;环防止分析物传播促进精确表示整个样本的米尔梁(直径≥6.5毫米)37,38]。样品直接发现膜没有任何额外的准备步骤。报道方法允许两种方法干燥水样品上发现聚四氟乙烯膜。平均而言,2μL膜上的样品放置位置需要10到15分钟左右完全在室温下干燥。样品也可以干在30秒左右,平均而言,加热器和风扇位于试样容器室的专用红外光谱分光计。选用“4-spot”牌的最后配置允许快速分析单个样本一式三份或三个独立的样品相比,一个适当的背景缓冲“现货”。

2.2。数据收集和分析

测量进行了使用直接检测光谱仪(EMD微孔),傅里叶变换(FT)红外系统分析光谱范围500 - 6000厘米⁻¹。所有光谱来自干样品在传输模式。一个经典的单变量量化方法,基于这一事实米尔光谱学nonscattering样本服从比尔定律,应用于数据分析。为每个蛋白质和脂质/洗涤剂测量,一个适当的背景(缓冲)光谱收集。缓冲区执行减法的步骤只有在区域的光谱用于我和/或脂肪族酰胺对称拉伸信号分析。蛋白质是量化使用酰胺我地区(1702 - 1602厘米⁻¹);因此,所有其他地区的米尔频谱不分析的关键。因此,对准确量化蛋白质,足以减去该地区的缓冲(1850 - 1350厘米⁻¹)酰胺我周围区域。同样的程序应用于脂肪族拉伸区域用于脂质/洗涤剂分析。缓冲区执行减法3100至2600厘米⁻¹;其余的米尔光谱没有被利用。缓冲减去光谱区域用于适当的带集成。

酰胺我带集成是由锚定基线固定点1702至1602厘米⁻¹我确定酰胺信号在这些波数之间的最高点的值。两个额外的集成方法(不是这里讨论)占可能缓冲干扰也被开发出来。

脂肪族对称拉伸带集成是由锚定基线2990至2810厘米⁻¹和确定信号强度最高的时候2868至2838厘米⁻¹。

2.3。数据库审讯

比较各种定量方法的理论变化,检查蛋白质数据库。例如,消光系数在280 nm理论是基于数量的色氨酸,酪氨酸和半胱氨酸残基的蛋白质(5]。MIR-based分析依赖于酰胺债券的数量,这不仅将氨基酸链接在一起但也存在于侧链的天冬酰胺,谷氨酰胺。自动化数据库的检查,Visual Basic应用程序(VBA)计划是写给Excel(微软)检查所有20233蛋白质在人类蛋白质数据库(2012 _10 Uniprot释放,39])(1)总数的氨基酸,谷氨酰胺数量(2),(3)天,(4)数量的色氨酸,总分子量(5),(6)理论摩尔消光系数在280海里。理论摩尔消光系数估计通过总结蛋白质中的色氨酸数量乘以5690,酪氨酸的数量到1280年,120年和半胱氨酸的数量。这个摩尔消光系数转换为质量系数除以分子量的蛋白质,获得消光系数与单位的盟毫升毫克⁻¹厘米⁻¹。每个残留估计的平均质量除以分子量蛋白质氨基酸的数量。酰胺的数量取决于添加天冬的数量和谷氨酰胺的氨基酸和总数减去一个。平均质量/酰胺测定分子量除以酰胺的数量。注意,转译后的修改并没有考虑。

2.4。蛋白定量

样品蛋白质浓度测定参照校准曲线;方法需要前一代的一个可重用的标准曲线来源于系列稀释蛋白质的引用。对所有实验报告,系统校准使用牛血清白蛋白(BSA)的国家标准与技术研究院(NIST)稀释在磷酸盐(PBS)。一系列的十个浓度点(0.125 - 5毫克/毫升)被用来生成蛋白质的校准曲线。使用2所有报告测量进行了一式三份μL每膜样品溶液的位置。从试点实验(不是这里讨论),2μL选择所需最小样本容量之间的权衡和可接受的定量结果。虽然小批量可以被应用到膜,人为错误如此之低的卷吸量的会引入额外的变异性,因此没有进一步考虑。

性能的方法,在标准curve-defined动态范围,评估使用纯蛋白质以及蛋白质混合物的解决方案。纯蛋白质与溶菌酶随着解决方案准备在PBS Milli-Q水和蛋白质。蛋白质混合物由BSA,细胞色素C,酒精脱氢酶,人类的转铁蛋白,伴刀豆球蛋白A,溶菌酶,ϒ从兔子球蛋白,蛋白质在PBS,用于两个不同的浓度。

供参考的目的,所有检测蛋白质的浓度的解决方案是由氨基酸分析(AAA)。获得1毫克/毫升溶液分析MIR-based定量,溶菌酶样品(AAA决心在68毫克/毫升)和PBS稀释1/68比率。蛋白质(AAA决心在52毫克/毫升)被稀释,也与PBS, 1/13获得4毫克/毫升样品。蛋白质混合物(AAA决心在1.98毫克/毫升)的AAA估计浓度以及1/8稀释。

潜在干扰洗涤剂,减少代理商,已知影响布拉德福德和洛瑞蛋白质的测定分析,研究了利用已知浓度的BSA在PBS(从0.25到2毫克/毫升)中掺入添加剂越来越多的调查。渐变20和特里同x - 100对蛋白质定量测试0.1 - -5%的范围内洗涤剂。β巯基乙醇(BME)和DL-dithiothreitol(德勤)分析了高达150毫米和50毫米,分别。可能妨碍蛋白质量化由于存在的十二烷基硫酸钠(SDS)进行了分析使用缓冲区包含多达1%的洗涤剂。在所有调查洗涤剂,减少代理米尔光谱产生,没有在该地区用于蛋白质吸收量化(1700 - 1600厘米⁻¹)。

2.5。脂质和洗涤剂分析

经验值测定样品浓度从校准曲线插值为每个脂质或洗涤剂开发进行了分析。乐队的报道方法依赖强度的振动产生的脂肪组织(3000 - 2800厘米⁻¹)。对于这里的实验报告,系统在氯仿和校准使用tetracosanoic酸3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] 1-propanesulfonate在PBS(家伙)。一系列的7个浓度(0.25 - -1.75毫克/毫升)被用来为tetracosanoic酸生成校准曲线。皮套裤,校准曲线也来自7个浓度点(0.25 -4%)。未知的脂质混合物分析完全基于米尔信号的强度。

2.6。单步蛋白质和脂质分析复杂生物样品

调查是否可以量化蛋白质和脂质在复杂的生物样品,同时组织溶解产物,来自乳腺癌组织,进行了分析。外科冰冻组织,来自人类乳腺导管癌,从分析生物获得服务公司和分成两个相等的样本(115毫克)。组织了2毫升1 x里帕缓冲区(EMD微孔;最后的作文:50 mM Tris-HCl pH值7.4,150毫米氯化钠,脱氧胆酸0.25%,1% NP-40, 1毫米EDTA)或CytoBuster蛋白质提取试剂(EMD微孔;作文不是可用),补充了一种抑制剂鸡尾酒和破坏玻璃组织均质器。液体分数从均质和细胞溶解组织转移到独立的管(分数1,补充图),而其余部分组织满是新鲜的体积相应的裂解缓冲和均质(分数2,补充图)。所有的样品都在10000×g离心10分钟。离心分离导致小颗粒与双层浮层。蛋白质含有分数(底部的上层清液层(P1a和P2a))进行了分离和分析,使用MIR-based方法,对蛋白质和脂质含量。顶部层保存为未来的脂质分析。删除大量的脂质检测到在这两种蛋白质分数,一个额外的离心步骤(15000 g×10分钟)。结果层,顶部脂质分数(L1b和L2b),和底部蛋白质分数(P1b和P2b)进行了分析,使用MIR-based方法,对蛋白质和脂质含量。蛋白质分数被进一步利用下游immunodetection乳腺癌生物标记。

溶菌产物从MCF-7准备(写明ATCC HTB-22)乳腺癌细胞(1.4×10⁶细胞/样本)1毫升1 x里帕缓冲区或CytoBuster蛋白质提取试剂,同时补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒,同质化的几秒钟,手持均质器随后在15000×g离心10分钟。MIR-based方法被用来衡量两个上层清液的蛋白质和脂质含量。MIR-based蛋白质数据相比,获得的结果用BCA蛋白质化验设备(热科学)。乳腺癌生物标记中使用的浮在表面的进一步分析。

3所示。结果

3.1。样本卡片设计准确MIR-Based生物样品的分析

MIR-based生物样品的分析是通过2的应用μL水样本到亲水聚四氟乙烯膜和表示干样品米尔梁。虽然奈米米尔光谱学和氟化钙是常用的,他们浪费一次性应用程序。同时,方法的意图是为了避免沉积窗口每次使用后的清洗和PTFE-based一次性卡允许这样的应用程序。聚四氟乙烯膜显示强烈的信号1100至1300厘米⁻¹(图1(一));然而,相对惰性其余米尔光谱,包括酰胺我地区用于蛋白质定量和脂肪族组拉伸区域用于脂质和洗涤剂测量。

在开发期间,很明显,精确的重叠的示例应用程序和米尔梁对定量准确性至关重要。为了达到高度可再生的示例演示米尔梁,介绍了疏水环通过机械膜亲水表面的沉重和删除。介绍的这枚戒指允许精确监禁中的应用示例指定位置。今后所有测量,膜“现货”被疏水浮雕(图包围1 (b))防止分散的水样本在应用程序和干燥。“现货”设计显著提高米尔梁强度剖面之间的重叠,被发现的中心地区最强的,和干样本区域,从而促进更高的检测精度。因为比较测量进行干燥样品,因此用电量,可再生的和精确的沉积的2μL在薄膜是至关重要的。所有研究结果都获得使用手工吸管(Rainin Pipet-Plus R2)锁触发机制和愿望速度控制器,不同样本特性,提高精度和操作员地。

3.2。蛋白质分析

为了使一个快速,节省成本,和简单的分析方法,运用单变量量化。尽管多元量化程序可以提供更好的灵敏度,当应用于复杂样品的分析,他们需要红外技术。这里描述的方法适用于一般蛋白质快速和容易non-IR专家量化,更简单的单变量方法是追求。

蛋白质二级结构的影响在酰胺我消光系数(酰胺我乐队的确切位置)已经被很好地记录下来了(17,18,40]。酰胺我区域内的不同光谱区域分析和普通蛋白的最佳结果量化了该地区1702至1602厘米⁻¹。干扰,另外,考虑到可能的缓冲区缓冲信号(例如,来自缓冲盐沉积和干膜)减去从蛋白质的信号。调查各种光谱区域考虑缓冲信号减法交付最有前途的结果为该地区1850至1350厘米⁻¹。减法后,剩余的力量酰胺我估计信号被用来插入蛋白质浓度从一个已知的标准曲线。

在标准条件下,含水样品发现了亲水材料,包括聚四氟乙烯膜,干燥形成一个“咖啡环效应”,大多数样品优先沉积的边缘点(41]。“咖啡环”的分布强烈影响样品的性质缓冲区。最明显的“咖啡环效应”是显示在水(补充图),而使用缓冲区,如PBS,减少了水的张力让更多统一的样本分布在膜表面(补充图)。在洗涤剂,效果是减少或完全消除(补充图)。buffer-dependent干样本分布的差异是高度可再生的但需要一代的一个可重用的校准曲线和确认每个矩阵的线性,以确保最准确的结果。

3.2.1之上。注意事项和校准曲线生成蛋白质的选择标准

紫外线/ Vis-based蛋白质定量的一个主要限制条件是严格依赖氨基酸成分,尤其是色氨酸和酪氨酸的存在。酰胺之间比较分析我得到信号在280 nm和UV / Vis吸收了BSA浓度范围,兔免疫球蛋白,和蛋白质(图2)。与UV / Vis MIR-based分析的影响蛋白质氨基酸组成的巨大差异或大小。

回顾人类的蛋白质数据库(表1),很明显,许多蛋白质性质,如蛋白质长度和质量,特定氨基酸的数量,甚至预测消光系数在280海里,从蛋白质的蛋白质差异很大。然而,平均质量往往是相当一致的考虑到个体残留的贡献的范围可以从57为甘氨酸186 Da Da色氨酸。此外,由于酰胺债券的数量在一个蛋白质或肽只有一个不到残留物的数量,加上天冬和谷氨酰胺的数量,质量/酰胺债券也非常一致,即使是短的蛋白质和多肽。人能因此假定米尔吸光度(在质量的基础上,而不是一个摩尔)将是非常一致的,单个蛋白质可以作为一个可靠的参考其他蛋白质或肽,假设其平均残渣质量没有显著偏离的典型110 Da /残留(如聚甘氨酸或polytryptophan会偏离)。

为了测试MIR-based蛋白质定量方法,FTIR光谱仪校准使用NIST BSA PBS稀释。一系列的十稀释(一式三份),跨越范围0.125 - 5毫克/毫升,被用来准备一个校准曲线。酰胺我信号强度由每个浓度点回归线拟合,最终用于确定蛋白浓度分析样品(图3)。

3.2.2。动态浓度范围和测量精度

MIR-based浓度估计的准确性是决定使用单一蛋白的解决方案以及蛋白质混合物。集中值被从BSA参考曲线插值,推导出氨基酸分析(AAA)相比,目前公认的黄金标准方法估算蛋白质浓度。首先,1毫克/毫升样品溶菌酶在PBS,由1/68稀释68毫克/毫升的样品(浓度由AAA)由米尔方法被发现毫克/毫升。接下来,蛋白质(由AAA 52毫克/毫升)和PBS稀释1/13获得4毫克/毫升的解决方案。分析了米尔时,集中毫克/毫升。最后,一种蛋白质混合物由AAA(1.98毫克/毫升)是量化毫克/毫升;1/8稀释相同的样本(预计0.25毫克/毫升)的浓度MIR-based毫克/毫升时,分析的方法。

总体而言,该方法显示出很好的准确度和线性响应样本之间0.25毫克/毫升和5毫克/毫升。测量精度为样本低于0.25毫克/毫升显著降低;因此,0.25毫克/毫升的限制被选为这个方法。关于上面的检测极限,少量的样本100毫克/毫升成功测量(数据未显示)。然而,正如预期的应用这个方法是珍贵的样本的分析,如此高的样品浓度没有分析在本文的上下文中。

3.2.3。再现性和精度

样品卡准备使用蛋白质混合物,在0.25和1.98毫克/毫升(各一式三份;共有9点/样本),多次进行分析来确定测量的重现性。每张卡片(3蛋白质点+ 1控制现货)测量四次,为每个职位获得的浓度以及整个卡进行比较。确保正确和完整的沉积的样品到膜上,平均浓度为0.277毫克/毫升(CV 4.9%)和1.942毫克/毫升(CV 1.5%),分别为。在每个卡位置测量,精度与CVs的1.3和0.3%,分别在2的位置。位置3交付数据与CVs的1.2和0.1%,尽管CVs位置4分别为2.3和0.1%,分别。更为集中的更精确发现样品与之前的发现是一致的。

3.2.4。蛋白质定量缓冲区包含干扰分量,洗涤剂,减少代理

这里报道蛋白质定量方法依赖于MIR-based评价生物样本(从原始缓冲区)发现和干膜上。因此,测量的缓冲盐含有酰胺键,如尿素、可能会影响结果的准确性。在大多数情况下,干扰从缓冲的缓冲盐占减法的步骤;然而,由于该方法依赖于一个简单的单变量方法,高浓度的干扰组件仍然可以压倒蛋白质信号和排除适当的测量。

减少代理和洗涤剂已知干扰比色蛋白质定量方法(42]。阐明这些代理是否也会干扰MIR-based测量,蛋白质定量进行的各种添加剂。研究结果表明,可以实现精确的MIR-based蛋白质定量的50 mM二硫苏糖醇(DTT)(图4(一))和150毫米β巯基乙醇(谱图中未显示)。此外,红外吸收模式的十二烷基硫酸钠(SDS);分析与蛋白质1%)没有重叠区域允许无偏蛋白质定量的洗涤剂(图4 (b))。方法的性能也改变了高达5%的存在渐变20(数据未显示)或Triton x - 100(图4 (c))。同时,酰胺含有洗涤剂的存在,像,例如,家伙,可能妨碍或阻止蛋白质定量准确。也,因为清洁剂被绑定到蛋白质不同亲和力,减去缓冲区的贡献并不总是足够的精确分析。例如,在案例分析蛋白质绑定大量的洗涤剂,绑定洗涤剂将很有可能不会占的空白影响浓度测定的准确性。

3.3。脂质和洗涤剂分析

3.3.1。校准曲线的一代

由于它能够探测光谱吸光度乐队对许多结构实体,MIR-based方法不仅限于分析蛋白质的物种。鉴于大量lipid-associated吸收带,应用量化描述方法的脂质生物分子也被调查。在脂质乐队中,脂肪族碳氢键拉伸区域(2850 - 2870厘米⁻¹)提供了一个理想的候选人的分析脂质和洗涤剂。而单一蛋白标准可以用来量化一个广泛的蛋白质和肽样本,由于巨大的脂质和洗涤剂中存在的复杂性和可变性,这是猜测,每个定量需要使用特定物种的标准曲线的生成问题。实验使用各种脂类,包括脂肪酸(补充图)、磷脂、甘油三酯、liposaccharides和许多洗涤剂,表现出高度的变化检测的限制和使用校准曲线的斜率,从而确认要求个性化的校准的每个分析脂质和洗涤剂。

为了验证兼容性MIR-based定量方法对脂质和洗涤剂分析、红外光谱仪最初校准使用tetracosanoic酸(氯仿)或皮套裤(PBS)。执行两个浓度范围(一式三份),横跨0.25 - -1.75毫克/毫升(tetracosanoic酸)和0.25 - -4%(家伙),被用来推导脂质和洗涤剂校准曲线(补充图)。对称的碳氢键的强度振动为每个浓度是回归线拟合。

3.3.2。脂质和清洁剂量化的准确性

浓度估计的准确性已建立的动态范围内tetracosanoic酸和皮套裤是评估使用0.8毫克/毫升tetracosanoic酸和1.8%的家伙。结果表明,对于一个定义良好的校准范围内,该方法能够评估脂质和洗涤剂浓度较低的错误。保证精确移液应用样本时,MIR-based tetracosanoic酸的定量样本返回毫克/毫升(2.4% CV)和皮套裤样本被量化%(2.3%的简历)。

3.4。单步蛋白质和脂质分析复杂生物样品

裂解缓冲的实验使用几个配方,像里帕和CytoBuster蛋白质提取试剂,上升与已知浓度的BSA和测量,以及磷脂的存在(数据未显示),证明了报道方法允许精确的蛋白质定量从裂解缓冲。确定报告的方法可以进一步应用于更复杂的生物样品,蛋白质含量在各种准备的乳腺癌细胞系(MCF-7)溶菌产物测定和比较值来自BCA蛋白测定。样品中总蛋白质含量得到使用CytoBuster蛋白质提取试剂估计在2.4毫克/毫升(BCA试验)或2.7毫克/毫升(MIR-based方法)。蛋白质浓度在细胞溶解样品里帕缓冲估计在3.4毫克/毫升(BCA试验)或4.6毫克/毫升(MIR-based方法)。使用BCA化验结果都低于(10%和26%,resp) MIR-based方法。两个方法,估计蛋白质浓度的差异很可能是由于以下因素:存在各种洗涤剂(记录影响BCA测定的准确性43在裂解缓冲),记录BCA本机蛋白质分析的误差(44),一个错误与BSA作为标准比色分析(2),这一事实准确量化的肽BCA化验不能实现没有额外的样品操作与生物材料(不兼容45]。MIR-based量化的可能性是夸大了信号从核酸在细胞溶解产物排除因为核酸的量通常出现在这样的混合物(46)明显低于检测水平的报告方法。这里的报告的结果是一致的与以前的报告,MIR-based方法被用来量化蛋白质含量原油人类皮肤细胞溶解产物[癌46]或调整蛋白质浓度在质谱和核磁共振分析(47,48]。

这里描述的方法能够检测和研究蛋白质和脂质含量的分析样品同时选择性地(图5(一个)),在与传统的紫外光谱等分析技术。这种双重功能的监测可以使解放总脂质含量和蛋白质产量的变化,从而简化和改进分析过程。MIR-based的疗效分析用于下游样本资格评估在一个简短的研究乳腺癌细胞溶解产物分离和生物标志物检测。乳房组织被选中,因为它是记录有高脂肪含量((%)49]。在报道的研究中,乳腺组织溶解产物是准备使用缓冲区里帕和CytoBuster蛋白质提取试剂。后组织均匀化,去除脂肪的效率和总蛋白解放离心萃取过程监控使用MIR-based方法(见附加图分离流程图)。收集到的光谱数据用于确定蛋白恢复在离心分数(图5 (b))和检查的效率逐渐去除脂肪从这些样本(图5 (c))。信息由MIR-based分析是进一步利用样本操作促进更快和更一致的immunodetection调查乳腺癌生物标记物的研究进展。

4所示。讨论

快速和准确量化的蛋白质从复杂含水生物样品如血浆、脑脊液、或细胞/组织溶解产物仍然是一个挑战。关键的理解结果从下游应用程序通常依赖于适当的准备和准确的资格申请样品。经典的蛋白质定量方法,如紫外线和比色测定,允许纯化蛋白浓度的精确估计,但时不可靠应用于复杂混合物的分析。虽然米尔是一个很有前途的技术允许精确量化在复杂样品,现有技术MIR-based蛋白量化要求定期耗时的清洗程序(主要材料细胞),更大的样本体积(ATR细胞),或技术方法开发干样品(ATR),因而阻碍他们是否适合快速分析在一个典型的研究实验室。虽然高通量米尔采样和分析技术市场上已经可用,他们更适合大制药实验室需要反复重复的样本集和分析具有必要的有效chemometrics-based方法开发的分析技巧。目前可用的仪器往往过于昂贵或需要某些红外技术很容易适应普通蛋白量化non-IR精明的人员在小规模的实验室或学术界。所述方法开发和依赖于一个简单的,具有成本效益的方法允许精确的量化结果基于一个单变量的样本分析技术,它不需要先进的红外技术。

系统依赖于一个膜,透明的大多数米尔地区,允许水样本的鲁棒分析干格式。报道的方法也兼容常用有机溶剂在肽和脂质研究。为了实现准确的定量结果,严格遵守与样品一致的装载体积控制是必需的。虽然可以使用一般的校准曲线,该方法更精确的具体校准曲线时准备每个缓冲区被利用。基于实验数据,一般低量化范围设置为0.25毫克/毫升;对于一些样品,检出限低至0.1毫克/毫升。因为发达的方法只关注小卷和生物相关的样品,检测上限不做深入调查。然而,从狭窄的一组实验结果,这些限制可以超过100毫克/毫升。尽管一些缓冲盐可能不符合报告的技术,在PBS,之间的一般线性标定方法允许开发0.25毫克/毫升和5毫克/毫升。报告方法的准确度和精密度,线性范围内,与通过氨基酸分析结果具有可比性,为研究人员提供一个快速和具有成本效益的替代其他蛋白质定量工具。

由于化学和结构变化观察内脂质和洗涤剂,米尔信号强度显示相当大的可变性;出于这个原因,一个普遍的标准为所有脂质和洗涤剂不能被识别。因此,脂质和洗涤剂的定量需要发展为每个单独的标准曲线分析化合物。此外,混合物或未知化合物的定性分析可以执行使用“相对吸光度”模式的方法提供的信息强度米尔信号没有任何比较已知的标准。

总之,这里报道MIR-based方法使同步量测总蛋白质的复苏和监控除脂肪细胞溶解样品。这种技术也成功应用于复杂样品分析在外科乳腺组织的小规模的调查处理和分离。MIR-based促进更深入的分析样本特征和提供高质量控制样品制备过程。鉴于其无偏生物分子检测液体样品功能和顺从,更多的应用程序很容易设想这个方法。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

补充材料

引用

1. j·p·d·戈德林”,蛋白质定量方法来确定蛋白质浓度在电泳前,”蛋白质电泳b . t .那些和r·h·斯科菲尔德。,pp. 29–35, Humana Press, New York, NY, USA, 2012.视图:谷歌学术搜索
2. j . e .高贵,A . e .骑士,A . j .原因,A . di Matola和m·j·A·贝利”比较蛋白质的定量分析对于生物制药应用程序,”分子生物技术,37卷,不。2、99 - 111年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. j . e .高贵和m·j·贝利”定量的蛋白质。”方法酶学卷,463年,第95 - 73页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. h . Edelhoch“光谱测定色氨酸和酪氨酸蛋白”,生物化学》第六卷,没有。7,1948 - 1954年,1967页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. c·吉尔和p h·冯·希普尔”计算蛋白质消光系数从氨基酸序列数据,”分析生物化学,卷182,不。2、319 - 326年,1989页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. d·瑙曼”,FT-infrared FT-Raman光谱在生物医学研究中,“应用光谱学评论,36卷,不。2 - 3、239 - 298年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. c·约翰和诉Sergo生物医学的应用拉曼和红外光谱诊断组织,”光谱学,20卷,不。5 - 6,195 - 218年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. c . Petibois和g . Deleris“化学肿瘤恶化的映射通过红外成像:对分子组织病理学,”生物技术的发展趋势,24卷,不。10日,455 - 462年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. c . Petibois和b . Desbat红外光谱成像的临床应用:新的希望的原因,“生物技术的发展趋势,28卷,不。10日,495 - 500年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. j·杜布瓦和r·a·肖,”红外光谱学在临床和诊断应用程序中,“分析化学,卷76,不。19日,页。360 - 367 a, 2004。视图:谷歌学术搜索
11. b . Van Eerdenbrugh l·s·泰勒,“不仅应用中光谱的表征制药系统”国际制药学杂志,卷417,不。1 - 2,3-16,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. l . Wang和b . Mizaikoff多元数据分析技术应用到生物医学诊断基于中红外光谱,”分析和分析化学,卷391,不。5,1641 - 1654年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. c .皮约翰g .很,r·马尔科维奇,“傅里叶变换红外测定脂质体脂质”,分析生物化学,卷181,不。1,28-32,1989页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. Dreissig, s . Machill r·沙尔茨和c·约翰,”量化的脑脂质通过红外光谱和偏最小二乘回归,”Spectrochimica Acta-Part答:分子和生物分子光谱学,卷71,不。5,2069 - 2075年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. f . Jamme j。诉Mechin Vindigni, t . Cherifi t . Chardot和m . Froissard“单细胞同步加速器红外显微镜显示中性脂质之间的联系和储存碳水化合物通量在酿酒酵母,”《公共科学图书馆•综合》,8卷,不。9篇文章ID e74421 2013。视图:谷歌学术搜索
16. a . Derenne t克莱森斯、c .圆锥和e . Goormaghtigh“红外光谱学的膜脂质”百科全书的生物物理学艾德·g·k·罗伯茨,页1074 - 1081,施普林格,柏林,德国,2013年。视图:谷歌学术搜索
17. t . Miyazawa和e . r .块状石英的红外光谱在各种构象多肽:酰胺I和II乐队,”美国化学学会杂志》上,卷83,不。3、712 - 719年,1961页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. 香港和美国,“傅里叶变换红外光谱分析蛋白质的二级结构,”Biochimica et Biophysica学报,39卷,不。8,549 - 559年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. 盾,j . m . Malecki l·李,j·f·卡彭特和j·c·李,“Ligand-induced构象和结构动力学的变化大肠杆菌环腺苷酸受体蛋白。”生物化学第41卷。。21日,第6667 - 6660页,2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. h .苏西Timasheff、l·史蒂文斯:“红外光谱在水溶液和蛋白质构象。I我乐队的酰胺H₂O和维₂O解决方案。”生物化学杂志,卷242,不。23日,第5466 - 5460页,1967年。视图:谷歌学术搜索
21. j . Kuligowski g .别墅,b . Lendl”与在线双量子级联激光器高效液相色谱检测测定的碳水化合物、醇类和有机酸在葡萄酒和葡萄汁,”应用物理B:激光和光学,卷99,不。4、833 - 840年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. g . Janatsch j . d . Kruse-Jarres r·马尔巴赫和h . m .接着,“多元校正在临床化学分析用人类血浆的衰减全反射红外光谱,”分析化学,卷61,不。18日,第2023 - 2016页,1989年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. c . a . Sellick r·汉森r·m·贾维斯et al .,“快速监视重组抗体生产的哺乳动物细胞培养使用傅里叶变换红外光谱和化学计量学,”生物技术和生物工程,卷106,不。3、432 - 442年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. r·a·肖s Low-Ying m . Leroux和h . h . Mantsch”向reagent-free临床分析:定量的尿液尿素、肌酐和血清总蛋白干尿中红外光谱的电影,”临床化学,46卷,不。9日,第1495 - 1493页,2000年。视图:谷歌学术搜索
25. f .学员、美国Garrigues和m . de la Guardia”定量分析,红外,”分析化学的百科全书约翰·威利& Sons,纽约,纽约,美国,2012年。视图:谷歌学术搜索
26. 明白,r . Skudas h . Kolmar, b . Stanislawski“宿主细胞蛋白量化通过傅里叶变换红外光谱(FT-MIR),中期”生物技术和生物工程,卷110,不。1,第259 - 252页,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. 明白,r . Skudas b Stanislawski, h . Kolmar”过程中基体效应监测的抗体和宿主细胞蛋白质利用衰减全反射光谱,”生物技术进展卷,29号1,第274 - 265页,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. c . Petibois k . Gionnet m . Goncalves a . Perromat m·摩恩,g . Deleris”分析表演的傅立叶变换红外光谱法以及成像在生物体液浓度测量,细胞和组织,”分析师,卷131,不。5,640 - 647年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. g . Deleris和c Petibois”,应用傅立叶变换红外光谱法对等离子体内容的分析和监控,“振动光谱,32卷,不。1,第136 - 129页,2003。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. m·杰克逊和h·h·Mantsch”的使用和滥用红外光谱在蛋白质结构的确定,”生物化学和分子生物学的关键评论,30卷,不。2、95 - 120年,1995页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. d·查普曼,“脂类物质的红外光谱,”美国石油化学家协会杂志》上,42卷,不。5,353 - 371年,1965页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. a·m·a·皮斯托瑞斯w . j . DeGrip和t . a . Egorova-Zachernyuk”监测微生物来源的生物质成分通过傅立叶变换红外光谱,”生物技术和生物工程,卷103,不。1,第129 - 123页,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. l·k·塔姆和s . a . Tatulian“红外光谱学的蛋白质和肽脂质影响,”生物物理学的季度评估,30卷,不。4、365 - 429年,1997页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. m·杰克逊和h·h·Mantsch“红外光谱学、生物膜结构”Spectrochimica Acta评论卷。15日,53 - 69年,1993页。视图:谷歌学术搜索
35. r n a·h·刘易斯和r . n . McElhaney“傅里叶变换红外光谱学研究水分脂质和脂质双分子层膜,”生物分子的红外光谱、h·h·Mantsch和d·查普曼。,pp. 159–202, Wiley-Liss, New York, NY, USA, 1996.视图:谷歌学术搜索
36. r . Miglio s Palmery m . Salvalaggio l . Carnelli f . Capuano和r .重组、“微藻内容通过红外光谱的甘油三酯、”应用藻类学杂志,25卷,不。6,1621 - 1631年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. d . r . Gagnon r·m·派普和j . e . Aysta光谱样品持有人,“美国专利US005764355A, 1998年。视图:谷歌学术搜索
38. e . Chernokalskaya诉乔希,p .克拉克,c . Utzat r·阿马拉和t .骑士”设备和基于红外(IR)的量化方法的生物分子,”美国临时专利申请号61/475434,2001。视图:谷歌学术搜索
39. UniProt财团”活动普遍蛋白质资源(UniProt)”核酸的研究,42卷,不。D1, D191-D198, 2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. h·h·j . de Jongh大肠Goormaghtigh和人类。Ruysschaert”的不同摩尔吸收率酰胺我地区的二级结构类型:一个衰减全反射红外研究球状蛋白质,”分析生物化学,卷242,不。1,第103 - 95页,1996。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. r·d·Deegan o . Bakajin t·f·杜邦·g·胡贝尔,s·r·内格尔和t·a·威滕”毛细管流环从干液体污渍滴的原因,“自然,卷389,不。6653年,第829 - 827页,1997年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. b . j . Olson和j . Markwell“化验测定蛋白质浓度,”当前协议在蛋白质科学第三章,单位3.4,约翰威利& Sons, 2007。视图:谷歌学术搜索
43. c . v .苏木木材、r . l . Lundblad和n c价格,“蛋白质比色测定技术,”生物技术和应用生物化学卷,29号2、99 - 108年,1999页。视图:谷歌学术搜索
44. m . Fountoulakis j . f . Juranville和m . Manneberg”考马斯亮蓝的比较,bicinchoninic酸和洛瑞定量分析,使用non-glycosylated和糖基化的蛋白质,”生物化学和生物物理方法杂志》上,24卷,不。3 - 4、265 - 274年,1992页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. k . n . Kapoor d . t . Barry r·c·里斯et al .,“估计修改bicinchoninic酸肽浓度的分析,“分析生物化学,卷393,不。1,第140 - 138页,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. j .温l·a·勒让德j . m .欢迎和j·p·兰德斯,“核酸纯化的微流控设备,”分析化学,卷80,不。17日,第6479 - 6472页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. n . Havarushka k . Fischer-Schrader t . Lamkemeyer g·施瓦兹,“结构性基础摩押钨代数余子式合成蛋白质的热稳定性海床furiosus”,《公共科学图书馆•综合》,9卷,不。1,文章ID e86030, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. d . Sahu m . Bastidas s a不以为意,“产生核磁共振化学位移作业使用carbon-detected内在无序蛋白质核磁共振方法,”分析生物化学,卷449,不。1,17-25,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
49. r . c .波士顿,m . d . Schnall s a Englander j·r·兰迪斯和p . j .说有人在莫亚特,“估计在乳房组织脂肪和实质内容的使用核磁共振T1直方图和幽灵,”磁共振成像,23卷,不。4、591 - 599年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2014 Ivona Strug等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。