利血平的同时测定,瑞西那明,育亨宾在人血浆Ultraperformance液相色谱串联质谱分析

文摘

一个敏感和选择性UPLC-MS / MS方法的开发和验证的决心三indolic生物碱(利血平、瑞西那明和育亨宾)在人血浆使用罂粟碱作为内部标准(是)。与乙腈一步蛋白质沉淀后,使用C18柱进行分离(50×2.1毫米,身份证。1.7μm)和组成的流动相乙腈:水:甲酸(60:40:0.1%,v / v / v)泵的流量0.2 mL / min。进行了质谱测定使用积极的电喷射接口操作模式多反应监测(MRM)模式。的前体离子的过渡产品m / z609.32 > 195.01,m / z635.34 > 221.03,m / z355.19 > 144,m / z340.15 > 202.02被选为利血平的量化,瑞西那明,育亨宾,分别是。分析反应被发现的线性范围0.36 -400年,-300年0.27,和0.23 -250 ng / mL量化的下限为0.36,0.27,和0.23 ng / mL,利血平瑞西那明,分别和育亨宾。验证了后官方指南。该方法使可重复的结果,因此可能对药代动力学和毒理学分析是可靠的。

1。介绍

萝芙木属serpentina(家庭:夹竹桃科)是一种很重要的药用价值草通常被称为印度蛇根。在阿育吠陀药物已经使用了几个世纪,因为他们有价值的治疗行为尤其是在治疗高血压和精神疾病如精神分裂症、焦虑、失眠、精神错乱,等等1,2]。萝芙木属serpentina也被用于治疗皮肤癌、烫伤、湿疹、和蛇咬3,4]。Rauvolfia verticillata是另一个中国传统药用植物,也属于同样的夹竹桃科的家庭,也被用于高血压和心脏疾病(5]。这两个萝芙木属蛇和Rauvolfia verticillata含有药物活性indolic生物碱,即利血平,瑞西那明和育亨宾(它们的化学结构如图1)[5,6]。

各种分析方法已经报道了利血平的决心,瑞西那明,和育亨宾的植物提取物、医药制剂和生物液体。两种方法基于高效液相色谱法(HPLC)分析报告萝芙木属蛇是一个使用吸收光度检测光电二极管阵列检测器(确定利血平)7),另一个使用花期检测(确定瑞西那明和利血平)8]。除此之外,两个液相色谱方法与紫外吸收光度检测也报道了测定植物树皮和育亨宾的商业准备(9或与利血平Rauvolfia verticillata准备(10]。育亨宾(效果方法11瑞西那明[]和磷光方法12和利血平13)也可用在文学制剂的决心。测定生物体液、利血平的三种分析方法的报告。第一个采用高效液相色谱法(14]分析马等离子体而另外两个使用串联质谱法检测分析在马15和老鼠16血浆。一个LCMS方法也是在药代动力学研究中报道的育亨宾马等离子体(17]。

为了更好地使用治疗相关的药草,有必要研究其主要活性成分的药物动力学。没有分析方法在文献中报道的同时测定利血平,瑞西那明,育亨宾在生物体液。因此,一个方法以最小的样品处理过程需要这些生物碱在等离子体的同时测定。

目前在生物分析技术,ultraperformance液相色谱(UPLC)近年来获得了相当大的关注,已经成为制药和生物医学分析卓越的分析工具。范德姆特方程表明,随着粒径减小,小于2.5μ米,有一个显著的改善效率不会降低流动相流速的增加。因此,UPLC利用1.7μ米粒子产生的色谱峰窄比通过传统的高效液相色谱法(18]。通过使用多反应监测(MRM)检测女士,UPLC-MS / MS方法可以提供一个更为敏感和选择性检测,适合在治疗剂量药代动力学研究。本研究描述了一个敏感UPLC-MS / MS方法使用一个步骤样品制备过程对利血平的同时测定,瑞西那明,育亨宾人血浆中可以应用的药代动力学研究。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

利血平(99%纯度)和育亨宾(纯度≥98%)得到从丙烯酰胺和默克公司(德国),分别。瑞西那明(98%)和罂粟碱(纯度99%,结构如图1从穿越有机物获得的)。HPLC-grade乙腈和甲醇来源于Winlab实验室,英国。甲酸是英格兰从BDH实验室获得。其他试剂均为分析纯。水解决方案都是准备使用水从Milli-QR梯度A10超提纯单元(微孔、法国)。

2.2。设备和操作条件

2.2.1。液相色谱法

色谱法是一个ACQUITY UPLC系统(水Corp .,米尔福德,妈,美国)。UPLC系统,包括由第四纪溶剂经理,二元泵、脱气装置,autosampler和柱温箱。分离进行Acquity UPLC本·C18柱(50×2.1毫米,身份证。,1.7μ米,水域,美国)保持在40°C。的流动相乙腈和水的混合物组成的酸化与甲酸(60/40/0.1,v / v / v)泵的流量0.2 mL / min。育亨宾,被筛选了0.64分钟,而瑞西那明和利血平筛选了0.74分钟的总运行时间2分钟。注射量是5μL在部分循环模式和autosampler的温度保持在15°C。

2.2.2。质谱条件

triple-quadrupole串联质谱仪(Micromass Quattro微水公司,米尔福德,妈,美国)配备电喷雾电离(ESI)接口是用于分析检测。ESI电离源是在积极的模式。量化了使用多反应监测(MRM)模式。的转换m / z609.32 > 195.01,m / z635.34 > 221.03,m / z355.19 > 144,m / z340.15 > 202.02被选为利血平的量化,瑞西那明,育亨宾,分别是。优化的电离条件如下:毛细管电压3.3 kV,锥电压64 V, 150°C,源温度和反溶剂温度350°C。氮作为反溶剂和锥气体流量在650和50 L /人力资源,分别。氩作为碰撞气体的流量0.10 mL / min。利血平的碰撞能量,瑞西那明,育亨宾和是48 eV, 34 eV, 30 eV,和28 eV,分别与0.077秒的停留时间。质量猞猁软件(版本4.1,视交叉上核714)是用于控制UPLC-MS / MS系统使用TargetLynx程序和数据收集和处理。

2.3。校准标准和质量控制样品

利血平的标准储备溶液,瑞西那明,育亨宾,被溶解在甲醇准备给最后一个500的浓度μ克/毫升。解决方案被保存在冰箱里,可以被用作之日起15天准备。利血平的原液,瑞西那明,育亨宾是用于校准标准和质量控制(QC)样本,分别。利血平的标准股票的解决方案,瑞西那明和育亨宾当时连续稀释的甲醇:水(50:50%,v / v)提供标准工作溶液的浓度范围:3.6 - 4000 ng / mL(利血平),2.7到3000 ng / mL(瑞西那明)和2.3到2500 ng / mL(育亨宾)。一个20μL整除的工作解决方案添加到空白的人血浆中产生有效的校准标准从0.36到400 ng / mL(利血平),0.27到300 ng / mL(瑞西那明)和0.23到250 ng / mL(育亨宾)。的有效血浆浓度低(LQC),中等(MQC)和高(认证机构)QC样品准备以同样的方式对利血平(0.96、24和300 ng / mL),瑞西那明(0.80、20和250 ng / mL),和育亨宾(0.64,16日和200 ng / mL),分别。分析物在等离子体用于校准的标准和质量控制样品被保存在−80°C到化验或用于验证试验程序。正在解决方案(1μ常规使用g / mL)是由稀释了罂粟碱原液在甲醇:水(50:50%,v / v)。

2.4。样品制备

血浆样本存储在−80°C被解冻,留给1 h,涡30年代在室温提取,以确保一致性。到200年μ20 L空白血浆样本μ工作标准溶液和10 LμL (1μ克/毫升)的添加(空白样品除外)。样本vortex-mixed大约30年代和770μL(乙腈是补充道。样本再次涡混合1.5分钟,然后轻轻在10000 rpm cold-centrifuged 12分钟。离心后,600μL(上清液转移到液相色谱瓶,5μL卷(部分循环与针填充模式)的样本被UPLC-MS / MS进行分析。

2.5。方法验证

一套完整的方法验证了根据指导方针由美国食品和药物管理局(US-FDA)和欧洲药品局(EMEA)指南(19,20.]。执行本程序的验证人血浆为了评估方法在选择性方面,线性响应,准确、精度、复苏,在短期样品处理过程中分析物的稳定性和长期存储。

2.5.1。选择性和特异性

矩阵方法的选择性对内源性等离子体组件,代谢物和组件在人血浆药物进行了评估。批样品分析中,人血浆样品表现出不显著干扰分析物的保留时间(LLOQ级别),(50 ng / mL)被选为标定矩阵和QC矩阵。这些样本进行分析,未发现相关干扰分析物的保留时间和罂粟碱。

2.5.2。量化的线性响应和限制

方法的线性响应是由8分的评价分析曲线:0.36到400 ng / mL(利血平)0.27到300 ng / mL(瑞西那明)和0.23到250 ng / mL(育亨宾)。精密度和准确度分析曲线从接受三个验证方法被用来建立线性。分析曲线被绘制使用最小二乘线性回归模型加权,,在这的峰面积比(分析物/是),分析曲线的斜率,是设在拦截的分析曲线是分析物(利血平、瑞西那明和育亨宾)浓度。利血平的浓度、瑞西那明和育亨宾从每个分析曲线和计算结果计算参数被用来确定这些质量控制样品中分析物的浓度。确定系数是理想的分析曲线。的最低浓度分析曲线被接受作为量化(LLOQ)的下限,如果分析物的反应至少5倍以上的药物免费(空白)提取血浆和最高浓度是被接受作为量化(ULOQ)的上限。此外,分析物的峰值LLOQ样本应该是可识别的,离散的,可再生的准确性在±20%,精度≤20%。偏差的标准除LLOQ标称浓度不应超过±15.0%。

2.5.3。精密度和准确度

精密的分析方法描述了彼此亲密的两个或两个以上的测量而亲密的分析方法描述的准确性意味着测试结果的方法分析物的真正价值(浓度)。内部,interday精度表示为一个百分比的偏离各自的标称值。测定的精度测量的百分比变动系数(% CV)在人血浆三种不同浓度。日内精密度和准确度进行评估通过分析六个复制的质量控制样品在三个不同的层次(利血平(0.96、24和300 ng / mL),瑞西那明(0.80、20和250 ng / mL),和育亨宾(0.64,16日和200 ng / mL))在一个单一的分析。同样interday精度和准确性进行评估通过分析18复制的质量控制样品在不同浓度水平的精密度和准确度通过三个批次运行验证连续3天。每个浓度水平的偏差将会从标称浓度≤15.0%精密而平均精度不应偏离±15.0%。

2.5.4。提取复苏和基体效应

利血平的复苏,瑞西那明,育亨宾三个质量控制水平决定通过比较indolic生物碱的峰面积比率分析物前后血浆样品进行提取的分析物。计算矩阵的影响是由比较indolic生物碱的比例从分析物信号上升等离子体与一个从水溶液中获得相同的indolic生物碱的浓度。最大的偏差分析物浓度的15%被认为是可接受的,符合当前EMEA指南(19]。提取复苏和基体效应也同时使用相同的计算方法。

2.5.5。稳定

利血平的稳定性、瑞西那明和育亨宾在等离子体是评估通过分析六个复制的QC样品在低和高各种存储和处理条件下浓度。桌上型稳定性评估暴露后血浆样品室温~6小时,这超过了停留时间的样本处理程序。冻融稳定性评估后接受三个冻结(−80°C左右)解冻(室温)周期。处理过的样品稳定性是由存储重组QC样品~48 h autosampler条件下(维持在15°C)之前进行了分析。长期稳定的后评估存储测试样品在−80°C 30天。样品被认为是稳定的等离子体在每个浓度的平均偏差计算浓度稳定质量控制样品在±15%。

3所示。结果与讨论

3.1。优化色谱条件

初步可行性实验各种混合物的有机溶剂,如乙腈和甲醇与纯净水,均在0.1%甲酸以及改变流速(范围0.20 - -0.4毫升/分钟),进行优化的有效色谱分辨率利血平,瑞西那明,育亨宾,。流动相含有甲醇和水有0.1%甲酸没有产生令人满意的分离结果。乙腈与水有0.1%甲酸是尝试从50:50比改变流量范围从0.2到0.4毫升/分钟。结果是令人满意的和最好的解决高峰是实现权力平等主义的流动相洗脱的由乙腈:水:甲酸(60:40:0.1,v / v / v)在0.2毫升/分钟的流量,C18柱(50×2.1毫米,身份证。1.7μ米)。选择的条件是适合使用电喷射足够的分析物的反应。

UPLC-MS / MS操作参数优化的吲哚生物碱的决心很仔细,。标准的解决方案(200 ng / mL)的利血平,瑞西那明,育亨宾,直接注入随流动相进入质谱仪ESI作为电离源。质谱仪调谐最初在正面和负面电离模式为吲哚生物碱和罂粟碱。这是观察到的信号强度正离子比负离子更强烈得多。参数,如毛细管和锥电压、反溶剂温度、ESI源温度、反溶剂气体和锥气体流量,优化得到的最佳强度deprotonated吲哚生物碱分子和量化的罂粟碱。在参数中,毛细管电压,特别是锥电压是重要的参数。前体离子强度显著增加当锥电压逐渐增加。最后,分析物产生最强的离子信号当锥电压在64 V。锥电压超过64 V时,离子信号迅速下降。碰撞能量研究从10到50电动车来优化产品的反应离子,和最好的值被选为每个产品离子。 The MS spectra (parent ion) and MS/MS spectra (daughter ion) for reserpine, rescinnamine, yohimbine, and papaverine are shown in Figures2和3,分别。

3.2。优化的样本处理

蛋白质沉淀在本研究用于样品制备。蛋白质沉淀可以有助于产生一个干净的样品和避免内源性物质在等离子体分析物和女士是在列,系统。清洁样品是至关重要的减少离子抑制和基体效应UPLC-MS / MS分析。两个有机溶剂,甲醇和乙腈,甲酸的存在与否。最后甲醇被发现是最优的,它能产生一个清洁对空白血浆样品的色谱图和产量最高的复苏从人血浆分析物。

3.3。方法验证

3.3.1。选择性

选择性的方法评估通过比较thechromatograms人类空白血浆与相应飙升LLOQ样本。只有那些很多根据验收标准(< 20%相比飙升LLOQ和< 5%相比,选择区域)。这个推断,没有潜在的重要的内源性物质在等离子体干扰分析物的峰和。这样的方法似乎是选择性够决心利血平,瑞西那明,育亨宾,在等离子体。代表MRM色谱从空白获得等离子体显示没有干扰分析物的保留时间和图所示4。代表色谱在LLOQ ULOQ水平数据所示5和6,分别。

3.3.2。量化的线性响应和限制

方法是由一个加权的线性最小二乘回归分析的标准情节与8标准曲线。分析曲线生成通过绘制面积比(分析物/是)作为分析物浓度的函数。分析曲线是线性范围的0.36 -400 0.27 -300年,-250年和0.23 ng / mL利血平,瑞西那明,育亨宾,分别在人血浆。决定系数()都大于0.995的过程中验证。LLOQs值测定为0.36,0.27,和0.23 ng / mL利血平,瑞西那明,育亨宾,分别在等离子体。代表LLOQ足够敏感,调查这些分析物在等离子体的药代动力学行为样本。

3.3.3。精密度和准确度

表1总结了国际米兰,盘中QC样品的精密度和准确度值在人血浆。利血平的内部——interday精度≤8.3,而内部和interday精度在89.8 - -111.1%的范围。瑞西那明,内部和interday精度≤9.6,而内部和interday精度在91.2 - -108.1%的范围。同样,育亨宾,内部和interday精度≤9.8,而内部和interday精度在91.1 - -110.4%的范围。这些结果表明,该方法具有良好的精密度和准确度也适合样品中分析物浓度的水平并验收极限内≤15%,±< 15%,精密度和准确度,分别19,20.]。

3.3.4。复苏和基体效应

复苏百分比(平均数±标准差)的利血平,瑞西那明,和育亨宾从等离子体在三种不同浓度水平(利血平(0.96、24和300 ng / mL),瑞西那明(0.80、20和250 ng / mL),和育亨宾(0.64,16日和200 ng / mL)) 69.3到72.9%,64.9到81.7%,分别为69.8和75.8%。罂粟碱的平均回收率(是)在使用浓度为76.9%。这一结果表明,利血平的提取效率,瑞西那明,和育亨宾使用蛋白质沉淀方法是令人满意的,一致的,和浓度无关。电离抑制或增强效果之间的±15%,表明没有相对基体效应。

3.3.5。稳定

利血平的稳定性,瑞西那明,育亨宾调查在两个浓度的QC样品(低和高浓度)期间预期条件分析,存储,和处理的所有样本,其中包括各种稳定运动,像桌上型的稳定性数据冻结/解冻,处理样品,和长期稳定性测试。稳定的结果总结表2表明,利血平、瑞西那明和育亨宾钟情于人血浆在室温下稳定至少6.0 h,至少48小时最终提取15°C autosampler存储条件下和在三个冻融循环时存储在−80°C和解冻到室温。

4所示。结论

一个高效、可靠和小说UPLC-MS / MS方法成功开发的同时测定indolic生物碱(利血平、瑞西那明和育亨宾)在人血浆样品。发达的方法是根据官方指南进行验证。方法是有利的敏感性,样品制备一步,和短运行时(2.0分钟),因此适合高通量分析。本文提供的分析方法将有用的定量调查这些indolic生物碱的药代动力学和毒理学分析。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

作者扩展他们的感谢院长以来在沙特国王大学科学研究的资助工作通过研究小组项目。以序列- vpp - 203。

引用

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