文摘
一个简单、高效的HPLC-DAD(225海里)同时测定方法的开发和验证的柠檬苦素和六个关键生物碱(evodiamine、rutaecarpine 1-methyl-2-undecyl-4 (1 h)喹诺酮,evocarpine, 1-methy-2 - [(6 z, 9 z)] 6 9-pentadecadienyl-4——(1 h)喹诺酮和dihydroevocarpine)吴茱萸(法律)。Benth,它已经被广泛地应用于中药之一。海泼斯尔合金的色谱分离进行BDS C18柱,采用梯度洗脱和一个包含乙腈和水的流动相。在18批样品中分析物的内容进行了分析通过超声波提取乙醇和水的混合物(80:20,v / v)其次是高效液相色谱分析。七个分析物的分离实现了60分钟内具有良好的线性度()。RSD的盘中,interday精度低于1.85%。不同浓度的精度是100.49%至97.91的范围内。层次聚类分析进行区分和分类样本基于7个成分的内容。本研究表明的质量控制大肠rutaecarpa可以简化测量四个成分,柠檬苦素,1-methyl-2-undecyl-4 (1 h)喹诺酮,和dihydroevocarpine也应该一起担任化学标记evodiamine的质量控制吴茱萸(法律)。Benth。
1。介绍
的干果吴茱萸(法律)。Benth (大肠rutaecarpa,中文名字,Wu-zhu-yu)已经被用作中药(TCM) 2000多年,正式列入中国药典(1]。已经被证明是有效的治疗胃肠道功能紊乱,头痛、产后出血、闭经,寒意四肢。到目前为止,大肠rutaecarpa含有大量的化合物包括柠檬苦素类似物,indolequinazoline喹诺酮生物碱,精油,羧酸,类黄酮(2]。
被发现以来,已进行了广泛的研究大肠rutaecarpa和许多生物碱的药理作用已被报道。Evodiamine (Evo)和rutaecarpine(常规),两个indolequinazoline生物碱、有益的特征化学成分和负责任的对人类健康的影响。多项研究表明,常规有多种有趣的生物属性,如心血管(3- - - - - -8,抗高血压8- - - - - -11),抗血栓形成的(8,11],antiatherosclerosis [8,12,抗炎8,13],各类典型[8,14,子宫收缩剂活动(15),通过调节药物代谢酶和受体(8,16- - - - - -18]。最近的研究表明,Evo的抗癌活性和诱导细胞凋亡在几种类型的癌症细胞19- - - - - -26]。此外,药理研究表明,喹诺酮生物碱大肠rutaecarpa可以抑制白三烯生物合成在人类粒细胞(27)和核转录因子激活T细胞(28和有高度选择性的抗菌活性幽门螺杆菌(29日]。李等人。30.)发现了三种喹诺酮生物碱作为血管紧张素ⅱ受体阻断剂,调节血压。此外,据报道,柠檬苦素(Lim)抗艾滋病毒(31日,32],antinociceptive,抗炎作用[33,34),它可以抑制22活动和诱发致癌作用[35,36]。
与合成药物,草药有更多复杂的成分。中药的有效性可能归因于所有组件的整体效果,而不是一个单独的组件。此外,不同组件之间的交互作用在不同的草药总是一个问题。因此,中药的质量评价应该包含尽可能多的生物活性成分的信息。
到目前为止,已经有一些初步的定量分析研究大肠rutaecarpa。薄层色谱等分析技术(37,38)、CE (39),高效液相色谱法(40- - - - - -44],UPLC [45),和质46- - - - - -48)已经申请的决心indoloquinazoline和/或喹诺酮生物碱大肠rutaecarpa。气已经被用于检测吴茱萸挥发油的物种(49]。同时,黄等人发现,三种吴萸显示20个主要常见的山峰,和相似的内部转录间隔区(ITS)序列在97%大肠rutaecarpa,但只有Evo和车辙进行了识别和定量分析42]。赵等人开发了高效液相色谱法测定wuchuyuamide-I,槲皮素,Lim, Evo,车辙在55分钟(44]。尽管只有一点点喹诺酮生物碱的药理效应据报道到目前为止,它是可能的,这些化合物可能在综合效果起着至关重要的作用大肠rutaecarpa。喹诺酮生物碱的测定可能为总体质量控制提供额外的信息。周et al。48)开发了一个LC-ESI-MSn方法针对的分析和表征indolequinazoline和喹诺酮生物碱的提取大肠rutaecarpa。虽然15山峰女士被确认的数据,集中在色谱指纹图谱研究方法,不能用于定量测定Lim Evo,墨守成规,是中国药典中定义的内容。
然而,我们所知,没有方法,同时柠檬苦素的定量indolequinazoline,喹诺酮生物碱吴茱萸(法律)。Benth HPLC-DAD现在。因为爸爸可以提供分析物的峰纯度分析和吸收光谱定性分析,这是一个非常有用的工具同时识别不同的化合物。提出本研究旨在开发一个简单的HPLC-DAD柠檬苦素的同时测定的方法,两个indolequinazoline生物碱(Evo和常规),四个喹诺酮生物碱(1-methyl-2-undecyl-4 (1 h)喹诺酮(Q1) evocarpine (Q2) 1-methy-2 - [(6 z, 9 z)] 6 9-pentadecadienyl-4——(1 h)喹诺酮(Q3)和dihydroevocarpine (Q4))在18批大肠rutaecarpa(它们的化学结构如图所示1)。结果,该方法提供了一个快速,简单,准确的同时量化Lim和六个生物碱大肠rutaecarpa可以提供一个更合适的方法,显著提高原材料的质量评价大肠rutaecarpa。
2。实验
2.1。试剂和材料
Lim, Evo和常规标准的购买国家食品和药物控制研究所(中国,北京)。1-methyl-2-undecyl-4 (1 h)喹诺酮(Q1) evocarpine (Q2) 1-methy-2 - [(6 z, 9 z)] 6 9-pentadecadienyl-4——(1 h)喹诺酮(Q3)和dihydroevocarpine (Q4)被孤立的高速逆流色谱(HSCCC)。他们的结构(如图1)证实了光谱分析的基础上,包括紫外分光光度法(UV),1H核磁共振(NMR),13C NMR和电喷雾电离串联质谱谱/女士)。计算出的纯度归一化峰面积的94.3%,95.2%,96.8%,和98.3%,分别。乙腈(ACN)用于高效液相色谱是色谱级(Tedia公司公司,北京),和水使用蒸馏水。其他试剂的解决方案均为分析纯。18批次的样品收集来自不同地区和时间进行调查和验证大肠rutaecarpa(表1)。凭证标本远离光和水储存在密封干燥机使用前为了避免水分和化学变化。
2.2。标准溶液制备
Lim Evo,墨守成规,Q1、Q2,第三季度和第四季度重准确和溶解在ACN 10毫升容量瓶使股票的解决方案(800、250、250、150、250、250年和150年μg / mL,职责)。工作标准的解决方案是从股票的解决方案,准备进一步稀释适当体积的甲醇。这些解决方案是从光存储保护−20°C。
2.3。样品溶液制备
粉样本(120网、0.5克)重精确到100毫升锥形瓶,盖上锅盖,蘸20毫升的包裹(80:20,v / v) 1 h,然后提取超声波浴(35°C, 40 Hz) 1 h。通过0.22提取被过滤μm膜过滤和稀释包裹(80:20,v / v)为分析20毫升。每个样品制备与以前的协议进行高效液相色谱分析。
2.4。仪器及色谱条件
水高效液相色谱仪器配备1525 QuatPump, 2996紫外可见光电二极管阵列检测器,717 autosampler和授权工作站使用。色谱分离进行了在一个海泼斯尔合金BDS C18柱(200毫米×4.6毫米,id 5μ米)受一个警卫保护列(4.0毫米×3.0毫米,id 5μ米)。水的流动相包括(A)和(B)。梯度程序是:0 30分钟,线性梯度B 40 - 50%;30至35分钟,线性梯度50 - 75% B;- 55分钟,线性梯度B 75 - 80%;B则高达55 - min,权力平等主义的80%。列温度维持在25°C。流动相的流速为1.0毫升/分钟。废水监测在225海里的光电二极管阵列检测器。一个典型的注射量是20μl
2.5。层次聚类分析(HCA) 18基于化学标记的样本
HCA的统计方法寻找相对同质的集群情况下基于测量的特点。它始于每一次在一个单独的集群,然后结合集群顺序,减少集群的数量在每一步,直到只剩下一个集群。当有情况下,这涉及到聚类步骤或融合。这个层次聚类过程可以表示为一个树或系统树图,在聚类过程中每一步都是说明了一个联合的树。HCA方法在我们的研究中找到相对同质的集群的18批大肠rutaecarpa基于7个标记作为测量的内容特征,这是一款统计软件15.0软件操作。
病房的方法,这是一个非常有效的方法,集群之间的方差分析,应用,欧几里得距离被选为测量。
3所示。结果与讨论
3.1。选择和标记的识别
生物碱和柠檬苦素类似物的主要活性化合物大肠rutaecarpa。在目前的研究中,所选择的标记,它包含一个limonoid (Lim),两个indolequinazoline生物碱(Evo和常规),和四个喹诺酮生物碱(Q1、Q2、Q3和第四季度),是主要的成分大肠rutaecarpa和有明显的药理效果。在高效液相色谱峰的这七个化学标记被分配通过比较各个峰保留时间和紫外光谱与标准。峰保留时间为10.2,14.7,17.7,43.5,44.9,46.8,和52.8分钟测定Lim, Evo,墨守成规,Q1、Q2,第三季度和第四季度分别(图2)。
(一)
(b)
3.2。色谱条件的优化
色谱条件的优化是由使用11号样品的解决方案。获得良好的分辨率和山峰,不同成分的移动阶段(ACN-water或甲醇-水)和不同的梯度洗脱程序都试过了。结果表明,夏普和对称峰获得通过使用ACN有机阶段。因为极性分析物有很大差别,有机相的比例在30至35分钟迅速改变。根据紫外光谱七标记爸爸全扫描记录的范围从210到400海里,225海里被选为监测七个标记,提供最优的S / N和最高的价值最低的标记内容同时定量分析的所有标记。相比之下,(44,48),使用单波长紫外检测女士而不是多波长和检测至关重要的受欢迎的应用程序的方法。
3.3。提取方法的优化
的组成大肠rutaecarpa可以通过回流提取(41- - - - - -43),超声波水浴(46- - - - - -48),而超临界流体(45]。选择简化提取过程中,超声波提取,提取过程的效率是评价通过使用不同的溶剂,如甲醇,乙醇,乙酸乙酯,氯仿。最好的溶剂被发现包裹,这是更少的有毒和提供最高的价值七个标记的内容。
一个方法涉及four-factor-three-level正交阵列设计(全尺寸)包括萃取剂的合成(包裹70:80:20,90:10,v / v),提取溶剂体积(10、15、20毫升),和持续时间的提取(30、45、60分钟)开发的优化提取。结果表明,浓度的提取方法没有建立过程是足够的和适当的分析。因此,样品制备方法优化”一节2。3。样品溶液的准备。”
3.4。方法验证
特异性研究通过比较混合标准和提取的色谱大肠rutaecarpa(图2)。此外,根据吸光度的三维图中保留时间和波长的函数HPLC-DAD数据样本11号,没有证据表明杂质的峰重叠与标记被发现。
股票的解决方案包含七个标记准备和稀释到适当的浓度范围建立校准曲线。校准图表绘制线性回归后的峰面积与相应的浓度,和良好的线性行为观察的值高于0.999的所有分析物。LOD和确定定量限在3和10 S / N,分别(数据表所示2)。
精度评估解决方案的示例在选定的最佳条件下11号在1天6次盘中变化,一天两次连续3天interday变异。重复性与六种不同的解决方案准备工作从样品确认11号,其中一个是注入装置在0,2、4、8、12、24、36 h评估解决方案的稳定性。所有的结果都表示为标准偏差表所示3。
经济复苏是由添加已知数量的七个标准较低(80%的已知量),中等(已知的数量一样),高(已知数量的120%)的水平。然后上升样本提取、处理和量化按照上面提到的方法。经济复苏以三个层次变化从97.91到100.49%,rsd为1.94%至0.13(数据表所示4)。
比较与先前的研究[42,46,48)表明,我们的方法有许多优点。这是第一次,柠檬苦素,两个indolequinazoline生物碱,和四个喹诺酮生物碱与线性的可接受的性能,同时分析了精度、可重复性和准确性。此外,开发方法可以提供更好的精度(rsd < 1.9%)相比,HPLC-MS方法(46(rsd < 6.6%),所以,它可以是一个经济替代实验的更高程度的敏感性不是必需的。
3.5。7个标记的定量测定
在18批7个标记的内容大肠rutaecarpa测量方法与发达。代表HPLC色谱图的混合标准和提取的大肠rutaecarpa(样品号11)如图2。七个标记的内容从校准曲线获得的回归方程,计算结果如表所示1,表示为药材中每个成分的百分比。在这些标记,这是定义在最新的中国药典Evo和发情的总含量大肠rutaecarpa不应小于0.15%,Lim的内容不应低于1.0%,否则它不会被用作原料,被认为是不合格的草。基于这个定义,所有样品满足中国药典的要求,可以投入生产,但每个标记的内容大大不同,这可能会导致严重的浪费的草药。
此外,八个样本存储数年在环境温度下干燥和良好通风的地方为了评估贮存稳定性。结果表明,在相同样本的相似性很高位置。它证明了稳定的原材料可以存储三年在前面的条件。
3.6。HCA的18个样品根据7化学标记
HCA的系统树图(图生成3),它显示样品之间的关系。使用这种方法,18个样本分为两大类。数字8和17个类别我样品,和其他样本类别II,进一步分为两个集群。样品数量1,3,5在集群,集群和其他人在b .结果表明,样本具有相似化学概要文件可分为一组。
HCA统计方法得到的结果与赵et al。(44),因为我们也发现一些样品可以分类的主要领域。一般来说,18个样品可以分为三组。数字8和17组我样品,高含量的七个标志;样品数量1,3,5是在第二组中,曾Q1的相对含量高;在第三组和其他样本。草药的相似之处是相对于收集地点,但Q1的相对含量显著高三个样本(样本数字1、3和5)来自广西和贵州。这些结果表明,在HCA Q1发挥了重要的作用。贵州省样本显示所有标记的内容相对较高;然而,样本之间的差异来自贵州,和其他省份都不明显。此外,样本数量17发现所有标记的内容特别高,可能由于草的干燥度。
开始时工厂,中药主要成分的内容应该决定为了调整处方的比例,这药的质量可以很容易控制。据赵et al。44),混合的含量低的样品含量高的导电方式节省资源和合理引导草使用。实际上,这不是鼓励混合不同材料行业。因为关键成分的内容可能不具有相同的趋势,混合的结果是很难控制的。因此,应该进一步研究的质量评价大肠rutaecarpa。
3.7。基于Lim HCA的18个样本,Evo,第一季度和第四季度
7个标记的内容被定义为七个变量在分析分析,区分,分类的七个化学成分。
系统树图(图生成4),它揭示了化学成分之间的关系。很明显,七个变量被分成两个主要集群。第一季度在集群,集群中的其他样本二世,再分成两个子组。Lim在子群,和其他人在B组。
如结果所示,Q1和Lim在质量控制必不可少的标记,和Evo,车辙,和第三季度有类似的效果,所以第二季度和第四季度。结果表明,没有需要分析所有标记评估的质量大肠rutaecarpa。然后几个组合都试过了。发现HCA的结果是一致的,从7个标记,当Lim的内容,Evo, Q1,和第四季度被选为标记分析,区分,18个样本进行分类。数字8和17个类别我样品,和其他样本类别II,又被分为两个集群。样品数量1,3,5在集群,集群和其他人在b .相比之下,结果获得来自7个标记(图3),发生在集群有点区别,和其他样品有相同的分类。结果表明,评价质量大肠rutaecarpa可以简化测量Lim Evo, Q1,第四季度,它将在合理的使用应用程序的大肠rutaecarpa。
4所示。结论
在目前的研究中,limonoid Lim, Evo和常规的生物碱,和四个喹诺酮生物碱大肠rutaecarpa同时由发达HPLC-DAD方法。这是第一次,这七个化学成分分析高效液相色谱法与线性的可接受的性能,同时精度、重复性、准确性,和鲁棒性。方便的方法也满足了需求和时间效率评估的标记内容大量的原材料。更重要的是,优化方法已成功应用于分析18批大肠rutaecarpa。HCA是用来区分和18个样本进行分类指导合理的草药使用和控制它的质量更好。进一步研究表明,质量控制大肠rutaecarpa可以简化测量Lim Evo,第一季度和第四季度。提出关键生物标记可能是有用的测定标准采用的质量控制大肠rutaecarpa。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
金融支持提供由中国国家自然科学基金(批准号81173564和81173564)。