几个亲和标签常用于色谱净化

文摘

亲和标签已成为强大的工具从基本的生理结构和功能蛋白质组学研究。他们被广泛用于促进蛋白质的纯化和检测,以及蛋白复合物的分离。在这里,我们主要讨论一些亲和力的优缺点或抗原决定基标签频繁使用,包括hexahistidine标记,标记标签,喉炎II标签,streptavidin-binding肽(SBP)标签,calmodulin-binding肽(CBP)、谷胱甘肽S-transferase(销售税)maltose-binding蛋白(MBP) S-tag, HA标签,原癌基因标记。在某些情况下,一个大型亲和标签,如销售税或MBP,可以显著影响融合伴侣蛋白的结构和生物活性。所以它通常需要切除蛋白酶的标签。最常用的肽链内切酶肠激酶,因素Xa、凝血酶、烟草腐蚀病毒和人类鼻病毒3 c蛋白酶。描述这些蛋白酶的蛋白质水解特性以提供一般指导的蛋白水解去除亲和标签。

1。介绍

重组蛋白的表达和纯化越来越常见的描述近年来蛋白质的结构和功能。需要净化获得足够感兴趣的蛋白质浓度与纯度高、其功能之前,可以研究与其他蛋白质结构和交互。各种方法已经被用来丰富蛋白质的原油生物提取的兴趣。最有效的方法是亲和纯化,感兴趣的蛋白质丰富由于其特定的绑定属性到一个固定配体功能的类似于antibody-antigen交互。亲和力或表位标记肽序列,这是非常强大的工具,通常附加到感兴趣的目标蛋白质。最初设计亲和标签纯化重组蛋白,但现在他们也用于免疫印迹、免疫组织化学(包含IHC),免疫沉淀反应(IP)、流式细胞术(FCM),蛋白质定位,等等。然而,每个标签都有其独特的优点和缺点(1,2],它是重要的考虑最终选择前要使用标签。这取决于应用程序和要求特异性,溶解度、绑定和洗脱条件。

一般来说,标签用于提高重组蛋白的生产可以大致分为净化和溶解度标签(3]。亲和标签包括酶、蛋白质域或小的多肽和大部分高特异性结合一系列基质,如碳水化合物、生物分子小,金属螯合物、抗体,等等,允许快速和高效的纯化的蛋白质。尽管溶解度标签增强蛋白质的正确折叠和溶解度,它们经常用于串联亲和标签来帮助净化。在这种背景下,我们总结几种常见的特点及应用亲和标签可用于原核和真核蛋白表达系统(表1)。

2。亲和标签及其特性

重组蛋白的表达大肠杆菌(大肠杆菌)或哺乳动物细胞融合蛋白与周边亲和标签是一个最受欢迎的方法纯化蛋白质或蛋白质的复杂。亲和标签是人工多肽,通常被嫁接到N -或糖基的靶蛋白通过插入cDNA序列编码标记肽为匹配目标蛋白质的开放阅读框(图1)。除了促进重组蛋白的纯化,亲和标签还可以提高产量,溶解度,甚至折叠的目标合作伙伴2,4]。小型标签(例如,6×,国旗,链锁状球菌二世和CBP)的利益最小化对结构的影响,活动,和重组蛋白的特性,因此通常不需要删除。大型标签,包括MBP,销售税,有积极影响蛋白质溶解度和表达效率,但细胞的免疫原性和更多消费overexpressing细胞能量代谢的主要缺点是较小型标签。

hexahistidine标签(6×他)是最常用的亲和标记蛋白质浓缩。His-tagged蛋白质纯化容易的螯合金属离子亲和配体。亲和纯化的基础称为固定化金属亲和色谱法(IMAC) [5]。他最好可以绑定IMAC在接近中度缓冲条件下树脂(生理pH、离子强度),因此可以筛选了融合蛋白绑定缓冲含有一定浓度的咪唑。如果可能的话,洗脱也低pH值来完成(如0.1 glycine-HCl, pH值2.5)或过度的强大的螯合剂(如乙二胺四乙酸)。6×他有几个优点,包括规模较小,没有电荷,低水平的毒性、免疫原性(3]。His-tagging提供良好的收益率从廉价的融合蛋白,高容量树脂与温和的纯度大肠杆菌从哺乳动物细胞提取物提取但相对贫穷的净化5]。例如,我们表达了重组蛋白fam92a1 - 289融合6×他大肠杆菌使用镍和纯化它^{2 +}带电亲和树脂进一步功能研究(6]。在原核表达系统,大部分的重组His-tagged蛋白质存在于形式的包涵体,最后大约4毫克fam92a1 - 289蛋白获得了高纯度从1 L大肠杆菌文化(6]。

maltose-binding蛋白(MBP)的亲和力标签用于克服问题的目的与融合蛋白的表达和纯化7]。一般来说,重组蛋白标记MBP可以减轻毒性和提高表达水平和蛋白质溶解度(8- - - - - -10]。MBP标签可能产生的重组蛋白的比例高于polyhistidine标签(11,12]。然而,MBP的缺点是亲和标签的大小和免疫原性,任何下游应用程序复杂化。MBP-tagged蛋白质的纯化是通过传统的直链淀粉树脂色谱法。MBP-fused蛋白的洗脱是在中性pH值使用温和maltose-containing缓冲条件(13]。MBP标签是放在氨基或c端结束时有效的目标蛋白质。然而,因为大尺寸的MBP标签上产生很重的代谢负荷宿主细胞,目标蛋白质仍不溶性或MBP时容易聚合标记删除(14]。此外,最近一部小说相扑融合标签似乎提高蛋白表达和溶解度在原核生物和真核生物14,15]。

谷胱甘肽的转移酶(GST)标签是另一个基于亲和力强的亲和标签的销售税固定化谷胱甘肽(16]。消费税标签最好适用于原核表达因为消费税是一家多功能胞质蛋白存在于真核生物,但通常没有发现细菌(17]。类似于将MBP标签,GST标签一直用于提高融合蛋白的溶解度大肠杆菌(18]。GST-tagged蛋白质被固定化的谷胱甘肽,然后筛选了在温和,nondenaturing条件使用减少谷胱甘肽(19]。

Strep-tag是八肽,与链霉亲和素结合20.,21]。链霉亲和素也被优化来提高peptide-binding能力,导致Strep-Tactin的发展。链霉亲和素导数,即Strep-Tactin,导致更高的亲和力喉炎II标签(22- - - - - -24]。喉炎II标签不会干扰折叠或生物活性,不会引起蛋白质聚合。喉炎的融合蛋白可以被Strep-Tactin配体固定在底座上矩阵和纯化一步从原油在生理条件下细胞提取物,因此标签尤其适用于功能蛋白或蛋白复合物的生成(25]。同时,喉炎II标签可能会提供一个可接受的妥协优秀的净化与纯收益价格适中(6]。此外,38-amino酸streptavidin-binding肽(SBP)标记开发,与链霉亲和素结合更紧密比Step-tag二世和本地标签(26]。Strep-tagged或SBP-fused可以从配体分离蛋白质共价结合到琼脂糖树脂洗脱缓冲与生物素或desthiobiotin [27,28]。

发明calmodulin-binding肽(CBP)标记的重组蛋白纯化细菌基于高亲和力与摩尔钙调蛋白亲和力在生理条件下钙的存在(29日]。CBP标签来自人类肌肉肌球蛋白轻链激酶c端片段的,因此不推荐用于纯化的融合蛋白在真核细胞内源性蛋白质会干扰钙调蛋白calcium-dependent的方式(30.]。类似于hexahistidine和喉炎II标签,海关与边境保护局标签有一个微不足道的影响的生物活性或物理特征目标合作伙伴。CBP-fused蛋白质筛选了与一条非常温和的缓冲条件下钙从环境中(例如,2毫米EGTA, pH值8.0)(31日]。

chitin-binding域(CBD)从芽孢杆菌circulans由51个氨基酸组成,这是常用的作为标记亲和纯化的重组蛋白结合self-splicing inteins细菌系统(32]。融合蛋白的亲和选择后一个几丁质矩阵,intein经历特定的乳沟硫醇试剂或pH值和温度变化的释放chitin-bound标记的靶蛋白(3]。

国旗标签是一种亲水八肽抗原决定基的标签,被介绍给净化融合蛋白(33]。它可能位于融合蛋白由于其亲水的表面性质,因此更容易访问抗体。国旗标签结合几个具体anti-FLAG单克隆抗体如M1, M2, M5具有不同的识别和约束力的特点34,35]。标志可以被单克隆抗体融合蛋白calcium-dependent(例如,M2)或calcium-independent方式(32]。特别是,标签附加到融合蛋白的n端与M1 immunoaffinity净化所必需的单克隆抗体,而M2是position-insensitive。执行FLAG-tagged蛋白的洗脱国旗肽(例如,3×标志肽)或低pH值甘氨酸缓冲(如0.1米甘氨酸,pH3.5) (36]。

S-tag系统是基于特定的绑定15-amino酸S-tag和S-protein之间,这两个来自胰核糖核酸酶(核糖核酸酶A)。任何可以方便纯化蛋白质融合S-tag,检测,甚至量化(37- - - - - -39]。然而,S-tagged蛋白的洗脱高度严格的条件下执行的3 M NaSCN, 3 M MgCl₂,或0.2 M柠檬酸(pH值2)。

除了上述亲和标签,HA等其它多肽标签和原癌基因标记特征和高度免疫反应性的标签通常用于标记蛋白质从细胞培养上清液的分离和细胞溶解产物在中性pH值条件下,从而方便的工具coimmunoprecipitation (co-IP),但也容易通过免疫印迹检测。此外,他们都很小,因此不太可能干扰融合伴侣蛋白的生物活性和功能。HA标签来自人类流感病毒血凝素(HA)对应氨基酸98 - 106和强烈免疫反应性的抗原决定基使它流行的孤立,净化,检测和跟踪感兴趣的蛋白质(40,41]。HA-tagged重组蛋白可以被高度特定anti-HA分离单克隆抗体共价固定化在树脂。HA-tagged蛋白可以通过温和的洗脱方法筛选了与HA抗原决定基在TBS 1毫克/毫升。另一方面,三个化学洗脱选项可用:0.1米甘氨酸(pH值2 - 2.8),3 M NaSCN,氢氧化钠或50毫米。

原癌基因标记来源于原癌基因基因产品。原癌基因的重组蛋白标记标签可以被一个知名的高亲和性9 e10抗体(42]。尽管它可以添加糖或蛋白质的n端,不建议直接将原癌基因标签后面的信号肽分泌蛋白质,因为标签可以干扰易位到分泌途径。在任何情况下,原癌基因标记可用于许多不同的化验,如亚细胞定位研究通过免疫荧光或通过免疫印迹检测。在自然条件下,c-Myc-tagged蛋白的洗脱可以通过添加原癌基因标记肽在PBS(0.5毫克/毫升)与重组蛋白相竞争。

3所示。组合标记策略和研究蛋白质相互作用的合作伙伴

蛋白质复合物和蛋白质的相互作用构成了细胞内的生命活动的功能基础。已研制出许多标签组合自串联亲和纯化(TAP)技术出现在1990年代末(43]。TAP-tagging雇佣了两个连续的亲和纯化步骤,可以显著降低污染物洗出液中留存的机会。Double-affinity标签是一种有效的方法纯化蛋白复合物在当地条件下(44,45]。作为一个强大的工具来分离蛋白质相互作用复杂,TAP-tagging策略被广泛用于蛋白质相互作用网络的研究。利用技术的结合与质谱(MS)已经广泛采用一种高效的方法来识别和描述的组件蛋白复合物(46- - - - - -49]。例如,我们开发了一个利用标签系统包含一个国旗和CBP标签净化约束力的合作伙伴与诱饵蛋白14-3-3在哺乳动物细胞中,和一个新的相互作用蛋白HSP70是由两个步骤确定的亲和纯化48]。

各种组合不同的标签已报告到目前为止,如他和旗帜,他和喉炎II,国旗和喉炎II,等等(50,51]。幸运的是,今天许多利用表达向量是商用。完全采用标签开发战略需要仔细确定根据不同标记的优点和缺点和靶蛋白的特征。选择一个有效的组合,通常需要考虑标签的能力,提高产量,提高溶解度,促进融合伴侣的净化。另外,如果亲和标签有可能干扰结构或功能的研究,融合标签必须远离诱饵蛋白如下。

4所示。删除关联标记

使用亲和标签纯化的蛋白在原核和真核表达系统是一种广泛接受的方法。理论上,它不能排除亲和标签,特别是大尺寸,可能有可能干扰蛋白质的结构和功能。如果这种情况发生,措施应该移除它们。任何亲和标签,小型或者大型的,是否可以很容易地删除通过引入特定的蛋白酶识别标记和靶蛋白(图之间的序列1 (b))。最常用的肽链内切酶肠激酶,因素Xa,凝血酶,烟草腐蚀病毒(TEV),和人类鼻病毒3 c蛋白酶。这些肽链内切酶的优点和缺点是彻底讨论以前作品的文学(1,52- - - - - -54]。此外,其他肽链内切酶(如PreScission和Sortase)和外肽酶(如DAPase,气单胞菌属氨肽酶、氨基肽酶M和羧肽酶A和B)详尽描述了从重组蛋白亲和标记的删除1,52]。

6×等小型标签,国旗,喉炎II, CBP通常不需要移除净化后下游应用程序。肠激酶具有trypsin-like活动特别是劈开后规范识别序列(DDDDK赖氨酸残留物↓)[55]。肠激酶有时可能会粘住在其他基本的残留物,这取决于蛋白质的构象衬底(56- - - - - -60]。此外,肠激酶的乳沟效率密切相关的氨基酸残基在下游识别网站(61年,62年]。它不会裂开的识别网站如果识别序列是脯氨酸紧随其后。然而,添加尿素(1 - 4米)可以大大提高肠激酶乳沟特异性和减少外来劈理(63年]。特别是,国旗标签(DYKDDDDK)包含肠激酶的裂解位点(下划线),使净化后的亲和力标签。

肠激酶,凝血酶和因子Xa trypsin-like丝氨酸蛋白酶将裂开的羧基端肽债券基本的氨基酸残基。因素Xa劈开后首选的精氨酸残基裂解位点(i / D-G-R↓在其他网站()和偶尔劈开64年- - - - - -66年]。类似于肠激酶,因素Xa不会裂开在网站之后,脯氨酸和精氨酸。最常见的识别序列(LVPR↓G)或(LVPR↓GS),凝血酶选择性地裂开后精氨酸残基(54]。因此,Xa与肠激酶和因素,凝血酶乳沟可能导致保留一个或两个伴氨基酸残基在蛋白质的兴趣。

TEV蛋白酶是一种高半胱氨酸endoprotease的站点。其最佳E-N-L-Y-F-Q识别序列↓- g / S和谷氨酰胺之间的解理发生和甘氨酸/丝氨酸残基(67年]。

Sortase A是一个原核的硫醇转肽酶,可以水解认识到羧基末端的融合蛋白分拣信号序列(LPET↓G)和裂开threonine-glycine肽键(68年,69年]。酶的乳沟活动可以刺激钙离子(70年),和一个额外的亲和力等列标签删除步骤需要使用固定化sortase [71年]。

PreScission蛋白酶是人类鼻病毒(HRV)一个销售税标记类型14 3 c蛋白酶特别是识别氨基酸序列列弗LFQ↓全科医生或其子集序列包括核心的氨基酸序列(下划线),谷氨酰胺和甘氨酸残基之间的裂开72年,73年]。重组酶是专门设计来促进切除蛋白酶通过允许同时蛋白酶固定化和GST亲和标签的乳沟。

除了上述标签解理方法,删除标记的不使用蛋白酶也是可行的通过引入一种蛋白质元素self-splicing能力转化为各种基于净化系统。这些元素自然self-splicing蛋白质被称为inteins可以切除自己的父母蛋白(74年,75年]。Inteins设计可以在N -或c端接头连接获得裂解的Inteins,可以用来实现裂解各种亲和标签。特定的应用程序已经被其他作者(全面回顾76年- - - - - -78年]。

5。结论

亲和纯化的方法分离生物分子从细胞中提取基于高度特定的抗原和抗体之间的相互作用,以及受体和配体。亲和标签是绝对必要的在生命科学对于许多应用程序,包括蛋白质的纯化。虽然每个标签都有其特定的优点和缺点在净化效率、多才多艺的亲和纯化系统与不同的亲和标签是强大的分离重组蛋白和蛋白复合物。总之,没有统一的亲和纯化系统探索不同诱饵蛋白及其约束力的合作伙伴。到目前为止,它是可行的生成多个净化人类蛋白质或蛋白质亲和大规模蛋白质组学和结构基因组学研究领域到现在(79年]。

确认

这项工作是在经济上支持中国国家重点基础研究计划(2011 cb910703 2013 cb911303),国家863高技术基金会(SS2014AA020608),和中国自然科学基金(30800581,30800581)。本研究也由新世纪优秀人才在大学(ncet - 10 - 0595)和高等教育专业博士学科点科研基金项目(20120181110025)。

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