文摘

从许多药用真菌麦角固醇被证明具有多种药理活性在活的有机体内和在体外。基于浊点萃取新方法已经开发、优化和验证测定麦角固醇的大鼠血浆、尿液和粪便的液相色谱法。非离子表面活性剂Triton x - 114被选为提取溶剂。色谱分离是一个Inertsil ODS-3分析柱的流动相组成的甲醇和水(98:2,v / v) 1毫升/分钟的流量。完全的方法验证。结果表明性能良好的特异性,线性,检测和量化限制,精密度和准确度。该方法成功地应用于药代动力学研究中麦角固醇的老鼠。结果表明,粪便的麦角固醇水平远高于那些在大鼠的血浆和尿液。

1。介绍

麦角固醇是最著名的类固醇之一,广泛存在于许多药用真菌等Polyporus umbellatus,冬虫夏草,比较体外(1- - - - - -3]。我们最近报道了麦角固醇具有利尿活性Polyporus umbellatus(4]。麦角固醇也被报道具有细胞毒性的活动(5和抗炎活性3]。尽管麦角固醇显示多种药理活性,几个这种化合物的药代动力学和生物化学方面尚不清楚。然而,最终的效果的药物在活的有机体内可能会受到许多因素的影响,如身体和/或隔室分布、药物代谢、亲油性,膜透性,蛋白质绑定。这些多种药理活性的麦角固醇值得进行进一步研究药代动力学性质和麦角固醇的消除途径。

许多方法已报告的量化麦角固醇在原材料,如高效液相chromatography-ultraviolet检测(HPLC-UV) [1,6- - - - - -11),高效液相chromatography-tandem质谱(HPLC-MS / MS) (12,13),气相色谱分析-质谱法(gc - ms) [14- - - - - -16]。我们所知,没有信息的量化描述麦角固醇生物样品,如鼠或人工等离子体,尿液和粪便。此外,对麦角固醇的消除途径的影响尚未报道。一般来说,临床前研究包括中药的代谢和药物动力学组件是非常重要的在理解他们的生物效应和安全17,18]。为了调查麦角固醇的药代动力学性质和消除途径,一个简单的和可再生的分析方法,量化的麦角固醇鼠血浆、尿液和粪便是必需的。最近,浊点萃取(CPE)方法已引起关注作为一个方便的替代传统的提取系统。与传统有机溶剂相比,它提供了安全的优点,成本低、高浓度效率,容易处理的表面活性剂,毒性低,环境污染少,和简单的过程。CPE已越来越多地应用各种分析物的选择性萃取的生物和环境样品(蛋白质,维生素,和金属离子)19),但只有少数报告涉及药物的提取从血浆药代动力学研究20.,21]。在这篇文章中,一个简单的、具体的和可再生的HPLC-UV方法用一个简单的蛋白质沉淀过程描述来确定麦角固醇在大鼠血浆、尿液和粪便的第一次。方法验证,并成功地应用于麦角固醇的药代动力学研究在大鼠血浆、尿液和粪便经过口服的麦角固醇的剂量100毫克/公斤。

2。实验

2.1。化学药品和试剂

麦角固醇的标准(图1(一)作者)是孤立的Polyporus umbellatus。分离纯化过程的麦角固醇发表在我们之前的文献[22]。其结构特点是由化学和光谱方法(¹H核磁共振,¹³C NMR, MS)并与文献中发现的(23]。Ergosta-4 6 8 (14), 22-tetraen-3-one(麦角酰胺,图1 (b))被用来作为内部标准(是)的组件之一Polyporus umbellatus纯化纯度为99%的在我们实验室是由高效液相色谱法。HPLC-grade甲醇从贝克公司购买(美国贝克Inc .)。超高纯度的水是由Millipore-Q SAS 67120 MOLSHEIM(法国)。

2.2。准备的标准和质量控制样品

麦角固醇的标准股票的解决方案(5µg /毫升)和麦角酰胺(1、5和100µg /毫升)是由溶解在丙酮和适当数量的纯物质储存在黑暗中在4°C。

粪便样本均质与丙酮比1:10 (g:卷=粪便:丙酮)获得粪便匀浆。高效液相色谱法测定,麦角固醇的校准标准浓度水平的0.09,0.25,0.50,0.75,1.00,2.00,和2.50µg / mL被飙升准备适量的标准解决方案在空白血浆和尿液从健康的老鼠。麦角固醇的校准标准浓度的0.08,0.25,5、25、50、100和125个µg /毫升也由飙升在粪便匀浆中适量的标准解决方案获得健康的老鼠。质量控制(QC)样品分别准备以类似的方式用于校准曲线。浓度的0.25,0.75,和2.00µg / mL被用于血浆和尿液校准标准,而浓度的0.25,25日和100年µg / mL被用于粪便匀浆的低质量,中等质量控制,分别和高质量。

2.3。色谱条件

高效液相色谱法进行水域2695仪器组成的一个四元泵,柱温箱,水域2487双波长吸光度检测器,授权是用于数据收集。色谱分离是一个Inertsil ODS-3分析柱(250毫米×4.6毫米身份证。、5µm、日本)列温度设定为30°C。一个权力平等主义的洗脱甲醇水(A)和(B)是98:2 (v / v) 23分钟。流量为1.0毫升/分钟检测器波长为283 nm(麦角固醇的最大吸收波长),和注射量是20µL。

2.4。提取血浆和尿液样本程序

血浆或尿液准备了浊点萃取方法。1.5毫升的离心管,50µL血浆或尿液就被掺入了15µL(等离子体5µg /毫升,1µg /毫升尿液)工作方案和135µL 0.3 mol / L的氯化钠溶液。内容混合了2分钟,然后紧接着的100µL 5% Triton x - 114 (v / v)水溶液。之后,再次获得的内容很好地混合了5分钟,然后孵化在40°C的恒温浴20分钟。后相分离是由离心10分钟,每分钟5000转surfactant-rich阶段获得了在管的底部去除水的阶段。100年µL surfactant-rich流动相是上升的阶段。然后,内容是混合和离心5分钟,每分钟16000转。大部分的表面活性剂和coextractants如疏水蛋白质沉淀在底部的管,和20µL上清液的注入高效液相色谱系统进行分析。

2.5。粪便样本提取过程

100年µL粪便匀浆量标准或样品被调到1.5毫升离心管,然后30µL正在解决方案是飙升和vortex-mixed 1分钟。70µL丙酮添加到解决方案和漩涡再次2分钟。混合物在10000×g离心10分钟。20µL上层清液的解决方案是注入高效液相色谱进行分析。

2.6。线性、检测极限和量化的下限

HPLC-UV方法申请麦角固醇的量化鼠血浆、尿液和粪便。校准标准七麦角固醇的血浆和尿液浓度(0.09,0.25,0.50,0.75,1.00,2.00,和2.50µg /毫升)和校准标准粪便匀浆(0.08,0.25,5、25、50、100和125年µg /毫升)提取和化验。证实了的线性校准曲线绘制峰面积比值的麦角固醇和麦角固醇含量的三最小二乘线性回归分析。检测极限(LOD)被认为是最终的浓度产生的信噪比3。量化的下限(LLOQ)被认为是最低的浓度在20%精度的校准曲线和准确性是100±20%以内(24]。

2.7。精密度和准确度

的准确性和内部、interday精度的方法测定麦角固醇根据FDA指导生物分析方法验证(24]。测定的准确度和精密度进行了评估质量控制样品在三个浓度水平在三个不同的验证分析。精度计算的百分比不同药物的浓度测量的校准曲线的药物添加到空白血浆,尿液和粪便匀浆。精度是表达的相对标准偏差(RSD)。

2.8。选择性

选择性的方法评估通过分析五个独立来源的空白血浆、尿液和粪便匀浆或等离子体,尿液和粪便匀浆样品掺入了麦角固醇和,和观察的程度从等离子体干扰物质,尿液和粪便匀浆可能干扰分析物或。

2.9。复苏

提取恢复血浆、尿液和粪便匀浆在三种不同浓度的麦角固醇含量进行了测定。分析物/是峰面积比率相比获得的直接注入化合物溶解在同一理论浓度的解决方案。

2.10。稳定

麦角固醇的稳定性和股票的解决方案是评估。短期稳定评估通过分析质量控制等离子体,尿液和粪便匀浆样品在室温下保持6小时,超过了常规样品的准备时间。长期稳定是由分析质量控制等离子体,尿液和粪便样品匀浆后存储在−20°C 30天。冻融稳定性研究三冻结后(−20°C)解冻(室温)周期。

2.11。应用程序的麦角固醇药物动力学

验证方法与实际样品,试验进行确定麦角固醇在健康大鼠的血浆和排泄的样本,是管理的一剂麦角固醇口服药。这项研究是按照规定进行实验动物管理的国家科学技术委员会颁发的中国。所有程序和护理的老鼠都按照制度动物用于研究指南。老鼠被安置在单独的代谢笼在标准实验室食品温度控制的房间里床上用品(22±2°C) 12 h光/暗周期。

男性Sprague-Dawley (SD)老鼠,200±10 g,禁食过夜免费水至少12 h,服用口服填喂法用100毫克/公斤体重的麦角固醇溶解在植物油作为车辆。老鼠被分为三组()基于时间和两个动物的血液抽样。对照组只收到车辆。收集血液样本(大约300µL)从腔orbitalis肝素化管控制和1,2,3,4,5,6、8、10、12、14、16、24、36 h后的管理。样本立即离心机5000 g×10分钟和等离子体是冻结在−20°C和存储,直到分析。麦角固醇的估计所有的样品是在36 h前面描述的采血方法。

在另一个四组(排泄研究基于三种动物的尿液和粪便取样时间。对照组只收到车辆。大鼠被安置在个人自由获取食物和水代谢笼,除了最后一个前12 h口服100毫克/公斤的麦角固醇(水随意在实验)。粪便和尿液收集后政府在不同时期(0 - 2、2 - 4、4 - 6、6 - 8、8 - 10,10 - 12,12 - 14,14 - 16,16 - 24岁),和24-36 h)。粪便和尿液收集的数量在每个周期记录,分别,然后尿液和粪便储存在−20°C到分析。

药物动力学分析是由noncompartmental方法借助软件DAS 2.0(国家食品药品监督管理局颁发的中国药代动力学研究)和制药参数得到。

麦角固醇的百分比消除与积累的麦角固醇消除粪便计算在所有时间除以政府数量(麦角固醇消除每一段计算使用的粪便量乘以麦角固醇的浓度)。

3所示。结果与讨论

3.1。¹H NMR和¹³麦角固醇的C NMR数据

麦角固醇的特点¹H NMR (CDCl₃,500 MHz) 3.63 (1 h, m, H-3), 5.39 (1 h, m,货币供应量),5.58 (1 h, m,第7),0.63 (3 h, s, H-18), 0.95 (3 h, s, H-19), 1.04 (3 h, d,赫兹,H-21), 5.18 (1 h,弟弟,8.0赫兹,H-22), 5.22 (1 h,弟弟,8.0赫兹,H-23)、0.83 (3 h, d,赫兹,H-26), 0.84 (3 h, d,赫兹,H-27), 0.92 (3 h, d,赫兹,H-28);¹³C NMR (CDCl₃,125 MHz) 38.3(颈- 1),32.1 (c - 2), 70.6(颈),40.8 (c - 4), 139.9 (c - 5), 119.7(其他),116.4(即),141.5 (8),46.4 (C-9), 37.1 (C-10), 21.3 (C-11), 39.0(技术),42.8 (c13), 54.7(碳14),23.1 (C-15), 28.4 (C-16), 55.8 (c - 17), 12.2 (C-18), 17.7 (C-19), 40.5 (C-20), 21.2 (c - 21), 135.5 (C-22), 132.1 (C-23), 42.9 (C-24), 33.2 (C-25), 19.8 (C-26), 20.1(印度),16.4 (C-28)。质谱的数据发表在我们之前的文章(25,26]。

3.2。优化色谱条件和样品制备

色谱进行了高效液相色谱条件的优化对流动相条件(甲醇-水或acetonitrile-water),固定相(Inertsil ODS-3列,250毫米×4.6毫米身份证。5µm或Diamonsil C18柱,250毫米×4.6毫米身份证。、5µm)、温度(30或35°C)和峰值形状。测试结果表明,麦角固醇的峰形状是提高了甲醇和水的溶剂系统。

前面提到的方法演示了通过比较色谱六个独立的生物样本(血浆、尿液和粪便匀浆)空白的老鼠,每个空白样本和样本飙升。麦角固醇的色谱,是显示在图2(a1) -2(a3),2(b1) -2(b3),2(c1) -2分别(c3)。数据2(b1) -2(b3)表明没有明显干扰麦角固醇和保留时间的。麦角固醇和保留时间的18.8和15.7分钟,分别总运行时间少于23分钟。系统适用性参数方法如下:麦角固醇的理论板块,是4900年和5400年,分别。尾矿因素是小于1.1为所有麦角固醇和解决在麦角固醇和超过1.5。麦角固醇被选为是由于其相似性分析物对极性、高恢复,和合适的保留时间。

3.3。线性

麦角固醇的校准曲线线性浓度范围的0.09 - -2.50µg /毫升血浆和尿液和粪便匀浆0.08 -125µg / mL。典型的方程是(等离子体),(尿液),(粪便匀浆。=(麦角固醇/)和峰面积比例=麦角固醇的浓度。在常规分析,包括每个分析运行一套校准样品,一组QC样品,和未知。麦角固醇的LOD鼠血浆、尿液和粪便匀浆是42岁,50岁和49 ng / mL。麦角固醇的定量限大鼠血浆、尿液和粪便匀浆是90年,90年和80年分别ng / mL。

3.4。准确度和精密度

表1显示了内部和interday精密度和准确度的麦角固醇生物矩阵QC样品。内部和interday精度测量低于9.6%和7.8%,分别相对回收率从95.1%到103.6%。结果表明,该方法显示良好的精密度和准确度。

3.5。选择性

证明了该方法的选择性比较五个独立的生物样品的色谱图(血浆、尿液和粪便匀浆)空白的老鼠,每个空白样本和样本飙升。图2表明没有明显干扰麦角固醇和保留时间的等离子体,尿液和粪便样本。保留时间的麦角固醇,分别为18.8和15.7分钟,分别。

3.6。提取复苏

麦角固醇的复苏意味着提取血浆、尿液、粪便匀浆是90.9±2.9%,92.4±2.6%,分别和93.7±3.3%。平均相对恢复为94.5±3.2% ()。恢复数据如表所示2。结果表明,该方法显示出高度的复苏。

3.7。稳定

表3显示了短期的结果,长期和冻融稳定性的麦角固醇在等离子体中,尿液和粪便。麦角固醇被发现是稳定的冷冻血浆、尿液和粪便经过三冻融循环。相对标准偏差在±15%。长期稳定的研究麦角固醇三鼠矩阵显示明显的稳定在30天。此外,麦角固醇在三个老鼠矩阵被发现在室温下稳定一段6 h。所有的结果满足稳定性测量的标准。

3.8。应用程序的方法

麦角固醇的利尿剂活动被报道在我们之前出版4]。这种药物的药代动力学研究是重要的进行进一步的生物和生化研究和未来的临床试验。单一口服后麦角固醇(100毫克/公斤)老鼠,麦角固醇的浓度在等离子体中,尿液和粪便匀浆测定HPLC-UV方法。图3显示政府之后意味着麦角固醇的血浆浓度时间曲线。药代动力学参数表中列出4。

麦角固醇被发现在大鼠血浆、尿液和粪便样本收集从0到36 h后口服。结果表明,粪便中麦角固醇的含量远高于那些在血浆和尿液的老鼠(图4(一))。几乎62.5%的负荷剂量累积在粪便后36小时内口服剂量的剂量100毫克/公斤(图4(一)),但低水平的麦角固醇尿液中被发现(图4 (b))。

4所示。结论

浊点萃取技术已成功申请第一次作为一个有效的提取方法和预浓缩的麦角固醇鼠血浆样品。结果表明,该方法适用于分析大鼠血浆样品中麦角固醇收集的药代动力学研究。HPLC-UV方法是简单的,具体的,可再生的麦角固醇的定量测定大鼠血浆、尿液和粪便。所需的少量的生物矩阵(0.3毫升/决心)使这个方法适合常规分析在临床前药代动力学研究中,方法是有用的在临床药代动力学研究。它也可以用作参考麦角固醇的治疗药物监测。

利益冲突

没有利益冲突声明。

作者的贡献

Dan-Qian陈和Jun-Min co-first作者的贡献本文。

确认

本研究在一定程度上支持中国的国家自然科学基金(J1210063号、81001622和81073029)和中国博士后科学基金会(2012 m521831)和创新研究团队在中国教育部大学(没有。IRT1174)。在这项工作中,药物动力学参数分析了DAS 2.0的软件。甲醇从贝克公司购买。Dan-Qian陈和Jun-Min co-first作者