探索抑制选择性之间的关系和Roscovitine-Treated癌细胞的凋亡

文摘

roscovitine的抗肿瘤活性测试四个宫颈癌细胞:C33A, HCE-1,海拉,SiHa。在ATP roscovitine Lite测定的影响,细胞周期和细胞凋亡进行了评估。的Sub-G₁DNA内容发生巨大的增加,这表明细胞凋亡在海拉细胞诱导迅速,但在其他细胞缓慢。形态学观察结果表明,roscovitine诱导宫颈癌细胞凋亡和细胞死亡。结果显示,roscovitine向4宫颈癌细胞表现出选择性的细胞毒性,细胞显示在同一浓度不同的形态学和凋亡变化。据估计,宫颈癌细胞反应不同roscovitine由于凋亡和遗传背景的差异在不同的宫颈癌细胞。本研究建议roscovitine有可能对宫颈癌是一个化学治疗剂。

1。介绍

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂有可能诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡在肿瘤细胞(1]。Roscovitine、有力和选择性抑制剂Cdk2 Cdc2、证明Cdk酶的选择性抑制了相关的激酶。据报道,roscovitine不仅会导致细胞周期阻滞,但也在癌细胞凋亡(2,3]。在体外研究中,它已经表明,roscovitine对许多人类肿瘤细胞细胞毒性的活动,以及在肿瘤异种移植模型(4,5]。Roscovitine目前正在进行二期临床试验作为治疗nonsmall细胞肺癌和鼻咽癌6,7]。

在这项研究中,我们调查是否roscovitine可以抑制肿瘤的生长,表现出宫颈癌细胞株的细胞毒性:C33A, HCE-1,海拉,SiHa。此外,我们有兴趣阐明细胞凋亡的生物化学roscovitine这些细胞系。我们的数据表明,roscovitine可以抑制肿瘤细胞增殖的剂量和时间在宫颈癌细胞的方式。Roscovitine可以诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡在4宫颈细胞,但表现出选择性的敏感性。我们估计,宫颈癌细胞反应不同roscovitine由于凋亡的差异和遗传背景。这些结果还表明,roscovitine可能对宫颈癌选择性和有效的化学治疗剂。

2。材料和方法

从Sigma-Aldrich Roscovitine购买(美国ca: 186692466)。C33A HCE-1,海拉,SiHa细胞系购买基本医疗科学研究所的中国医学科学院和上海Sanqiang分析公司。杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM),胎牛血清(的边后卫)和胰蛋白酶从Hyclone实验室购买公司(美国)。青霉素和链霉素从σ购买化学公司(美国)。二甲亚砜(DMSO)购买AppliChem GmbH公司(德国)。(3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyl-tetrazolium溴化(MTT)和吖啶橙从Amresco购买公司(美国)。蛋白酶抑制剂的鸡尾酒(1%,猫没有:539134)购买从默克公司(美国)。所有试剂的化学成绩除非另有说明。

2.1。细胞培养和试剂

10更易与L roscovitine股票复合制备在DMSO溶液和不同浓度的稀释。培养基的最后DMSO浓度≤0.3%。四个宫颈癌细胞(C33A HCE-1,海拉和SiHa)维持rpmi - 1640年媒体含10%胎牛血清,2更易/ L谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100克/毫升链霉素。细胞培养在孵化器37°C下5%的股份有限公司₂在空气中。

2.2。细胞生存能力评估(剂量和时间关系)

C33A HCE-1,海拉,SiHa细胞(/)生长在24-well盘子和对待roscovitine (0 30mol / L)或DMSO(0.3%,最终浓度)48和72 h。在细胞被胰蛋白酶和结合不依从细胞释放。离心后,细胞resuspended PBS和处理0.2%台盼蓝。实验在五个独立复制。细胞生长抑制实验,细胞被播种在24-well文化板块的密度/好。后0、2、4、6、12、24和72 h, 20加入一定量mol / L的roscovitine井。细胞数量和细胞生存能力测定使用血球计和台盼蓝染料排除测试。

2.3。MTT试验

C33A HCE-1,海拉,SiHa细胞被播种到96孔板和孵化一夜之间在37°C。Roscovitine加入细胞(5)复制和孵化72 h 37°C。3 - 4,5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)是2毫克/毫升的股票在细胞媒体和过滤消毒。媒体从细胞,然后MTT的解决方案是添加在50岁L /好,在黑暗中孵化在37°C 4 h。麻省理工的解决方案是,50和MTT染色是水溶性的L / DMSO的风潮。在562纳米测量吸光度,然后确定集成电路₅₀(浓度roscovitine抑制细胞生长的50%)。

2.4。流式细胞术

对宫颈癌细胞凋亡的影响roscovitine被流式细胞仪检测。宫颈癌细胞对数生长期/毫升孵化成6-well细胞培养板和培养在37°C孵化器有限公司为5%₂24 h。删除的培养基,2毫升含有20的体积mol / L roscovitine添加到每个。细胞培养在37°C孵化器有限公司为5%₂0、6、12、24、48、72 h,分别收集,分别,然后在2000 g离心5分钟。删除的上层清液,细胞浓度被稀释/毫升。媒体结合试剂与10L AnnexinV-FITC补充道。在黑暗中这些细胞被孵化15分钟和离心机3000 g 5分钟,然后是浮在表面的被移除。0.5毫升的细胞被resuspended绑定缓冲。添加细胞悬液是10Lπ在冰上。这些细胞被受光照和流式细胞术检测出来。

2.5。ATP Lite化验

ATP是细胞生存能力的标志,它存在于所有活细胞的新陈代谢。细胞发生坏死或凋亡,ATP浓度迅速降低。荧光素酶和ATP Lite工具包中包含D-luciferin与ATP产生荧光反应。反应方程式如下: 荧光强度是衡量PerckinElmer 2030 Multilabel读者。100L细胞悬液被播种/毫升于96孔培养板。24小时后,细胞与100年被添加L培养基含有roscovitine 10、20、30、40、50、60分别mol / L。空白组与媒体,和对照组添加DMSO溶液的0.5%。每组5个重复。C33A和海拉细胞培养48 h。温度的ATP Lite缓冲区,细胞溶菌作用的解决方案,和冻干衬底溶液平衡至室温(RT)。ATP Lite缓冲5毫升的量添加到冻干衬底的解决方案。细胞溶菌作用的解决方案与50的体积L添加到每个。混合物是由微振振实的1000 g 5分钟溶解细胞和稳定ATP。准备矩阵解决方案的体积50L添加到每个。混合物在1000 g 5分钟振实,防止光10分钟来衡量其荧光强度。

2.6。形态学观察

C33A的浓度和海拉细胞对数生长期被稀释/毫升。2毫升C33A和海拉细胞悬液置于6-well文化板块和覆盖的滑落。细胞培养在37°C孵化器有限公司为5%₂24 h。然后培养基被移除。20mol / L roscovitine添加到每个好,分别与0.3% DMSO作为对照组。两组为0和培养24小时,分别。盖片与日益增长的细胞被选中,与PBS洗3次取消血清,与95%乙醇固定15分钟,1%乙酸治疗30年代,然后染色mol / L为30 - 60年代,吖啶橙1 mol / L CaCl处理₂30 - 120年代,和洗PBS的3倍。与200年下滑了L甘油都是轻轻的,多余的液体被吸滤纸。这张照片是由共焦显微镜在488 nm的激发波长和发射波长561 nm。

2.7。统计数据

所有实验进行了至少5次。数据表示为±SD方法。一个*值< 0.05被认为是显著,* *值< 0.01被认为是非常重要的。

3所示。结果

3.1。Roscovitine生存和增长的影响

细胞的生长抑制后剂量依赖性的方式接触roscovitine 48 h和72 h范围从0到30mol / L(图1)。海拉细胞是最敏感的。roscovitine的抗效果评估通过测量增长率和处理20mol / L roscovitine。治疗roscovitine造成时间抑制细胞生长期间按照细胞生存能力分析72 h与控制(图2)。

3.2。细胞毒性试验

MTT比色细胞毒性是化验后72 h与roscovitine孵化。的集成电路₅₀值C33A HCE-1,海拉,SiHa细胞,,, 分别mol / L,如图3。

3.3。细胞周期的影响

我们分析了细胞周期的增长宫颈癌细胞系暴露于20mol / L roscovitine。在C33A HCE-1 SiHa细胞系,Sub-G₁DNA含量显著,明显增加在24 - 48 h,表明细胞凋亡发生(图4)。在海拉细胞系,我们发现Sub-G₁DNA内容发生巨大的增加在12 h。结果表明,roscovitine四宫颈癌细胞,诱导细胞凋亡和海拉是roscovitine最敏感。

3.4。ATP Lite化验

了解肿瘤细胞表现出不同的敏感性的原因roscovitine,海拉细胞最敏感和最耐C33A细胞被用作代表ATP Lite和形态学研究。与ATP测定,证实roscovitine显著抑制C33A和海拉细胞的生长。细胞内的atp酶活性显著降低随着roscovitine的浓度增加,如图5。roscovitine在海拉细胞的抑制效果高于C33A细胞系中剂量依赖性的方式。

3.5。形态学观察

C33A和海拉细胞染色与吖啶橙荧光共焦显微镜观察。绿灯的细胞核呈现均匀荧光在凋亡细胞,由于染色质固缩或破碎的片段大小不等,凋亡体形成。他们用吖啶橙染色的,提出了深层和密集的荧光绿色的颗粒状荧光。坏死细胞的荧光减弱甚至消失。C33A和海拉细胞治疗roscovitine照片拍摄于0,24 h,凋亡特性证明显然,如图6。结果表明,细胞治疗roscovitine显示细胞膜泡,细胞收缩和细胞凋亡。这些表明roscovitine诱导细胞凋亡在两个细胞系,roscovitine和海拉细胞更敏感。

4所示。讨论

Roscovitine, olomoucine-related嘌呤类似物来自6-DMAP和isopentenyladenine Cdks与ATP结合位点的竞争,已经开发成一个Cdk抑制剂(8,9]。Roscovitine治疗不仅诱导细胞周期阻滞,但也在各种类型的细胞系凋亡4,10,11]。在这项研究中,我们首次展示了小说CDK抑制剂roscovitine颈抑制肿瘤细胞增殖的剂量和时间的方式,快速诱导细胞凋亡在体外在宫颈癌细胞的机制,涉及细胞凋亡。

我们发现roscovitine表现出选择性对宫颈细胞细胞毒性,细胞显示在同一浓度不同的形态学和凋亡变化。这个观察证实了流式细胞仪和指示roscovitine的凋亡机制。发表论文使用roscovitine头颈部鳞状细胞癌的细胞也显示了两种可能的结果(12- - - - - -14]。首先,细胞可能会同时显示细胞凋亡和细胞周期阻滞。这个意义并不完全清楚,但建议化学敏感性。其次,它显示一个长时间的细胞周期阻滞前细胞凋亡。结果表明roscovitine宫颈癌细胞可能有不同的反应,因为细胞凋亡和细胞周期的机制和关系的逮捕。从我们的研究中,roscovitine可以抑制肿瘤细胞增殖存在剂量依赖的相关性和时间的方式在不同的宫颈癌细胞系表现出不同的细胞毒性。宫颈癌细胞发生细胞凋亡和细胞周期阻滞。因此,roscovitine将选择性和宫颈癌的有效化学敏感性药物治疗。

利益冲突

作者报告没有利益冲突与此相关的工作。

确认

这项工作在北京地区主要实验室完成了肽和小分子药物,高素质人才的引进和开发项目支持的北京市政机构和临床基本关键研究资助(11 jl02)首都医科大学。

引用

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