潜在的保护Coeloglossum viridevar。Bracteatum提取物对氧化应激大鼠皮质神经元

文摘

本研究的神经保护作用进行了探讨Coeloglossum viridevar. bracteatum提取(CE)在大鼠大脑皮层神经元对氧化应激。CE的结果表明政府抑制氢peroxide-induced神经毒性测试通过MTT, LDH释放和TUNEL检测。我们进一步发现,CE抑制激活caspase-3 (Csp3)引起的过氧化氢。此外,CE发现反氢的差别peroxide-induced对这些活跃的一种蛋白激酶和bcl - 2。然后,我们表明,CE的神经保护效应被添加一种蛋白激酶抑制剂,Ly294002。因此,我们的数据强烈表明,CE发挥了神经保护作用对氧化应激的神经毒性。

1。介绍

Coeloglossum viridevar. bracteatum提取(CE)是从植物中提取的Coeloglossum viridevar. bracteatum,兰科植物家庭。CE被广泛用作中药在中国的西北地区,尤其是在西藏,青海,甘肃,内蒙古,山西[1]。它被描述为中药;CE体液增加生产和生命力是受益人对内存和安静1]。公元2004年,已被确定为四个化合物的混合物(2]。最近,CE已被证明营救在啮齿动物学习和记忆莨菪碱引起的赤字(3]。

阿尔茨海默病(AD)是一种进行性神经退行性疾病,其特征是细胞外老年斑组成的β淀粉样蛋白和胞内神经原纤维缠结(非功能性测试)4]。神经元损失广告被认为是由淀粉样β蛋白毒性(5,越来越多的证据表明,β淀粉样蛋白的毒性是由氧化损伤神经元(4]。大量研究表明,氧化应激的发病机理中起着重要作用。已经观察到患者的大脑氧化应激增加广告(6]。此外,减少抗氧化酶活动包括超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶已经从广告(患者在大脑7,8]。此外,缺乏超氧化物歧化酶D1 (Sod1)小鼠模型的广告导致加速β淀粉样蛋白斑块形成和内存赤字,和现象是由氧化损伤(9]。有趣的是,最近的一项研究发现,一种抗氧化剂MitoQ阻止氧化应激增加,β淀粉样蛋白斑块的形成,增加和高半胱天冬酶在动物模型的广告活动和突触丢失(10]。因此,氧化应激是一种很有前途的治疗目标治疗广告。

在我们目前的研究中,我们调查了角色和CE在神经保护的作用机制与氧化应激。我们的研究结果首次表明,CE激活一种蛋白激酶信号通路可能上调抗凋亡蛋白bcl - 2的表达在压力调解神经保护。

2。材料和方法

2.1。初级皮层神经元文化和治疗

皮质的神经元文化准备如前所述。组织从整个大脑解剖组织的新生SD大鼠(实验动物中心的北京大学健康科学中心,北京,中国)在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)(表达载体)。组织是机械分离,然后用0.25%胰蛋白酶孵化(表达载体)30分钟37°C。混合物是尼龙网过滤获得均匀悬浮。过滤混合后到70年μm灭菌过滤器,主要材料是离心机颗粒细胞。细胞在DMEM resuspended 10%胎牛血清的边后卫,2 g / L玫瑰,青霉素g (100 U /毫升),100 ug /毫升链霉素(所有从英杰公司)。细胞被镀在poly-L-lysine-coated盘子或盖玻片和保持湿润孵化器有限公司为5%₂和95%啊₂在37°C。10μ米阿糖胞苷(σ)补充镀后2 - 4天抑制神经胶质细胞生长。细胞治疗后7 - 8天的文化。CE(李唐博士的礼物,药理学,中国民族大学)和AKT抑制剂Ly294002(细胞信号)添加新鲜培养基在治疗。

2.2。测量细胞死亡:MTT测定,LDH释放试验,隧道试验

各种治疗后细胞的生存能力估计的能力减少染料甲基噻唑基四唑(MTT,σ)蓝色甲瓒晶体。在96孔板细胞培养7天轻轻洗了0.01 PBS。洗后,90μL 10的媒介μL 5毫克/毫升MTT的解决方案是添加到每个好,板保持在37°C 2 - 4小时。然后量化的反应是溶解在DMSO溶液通过测量使用微型板块在570纳米吸收分光光度计(Bio-Rad),代表相对细胞生存能力。

细胞的细胞毒性评价各种治疗后的乳酸脱氢酶(LDH)释放。达到CytoTox 96非放射性细胞毒性试验装备根据制造商的指示(Promega)。

细胞死亡后检查治疗新鲜的4%多聚甲醛固定细胞和4%蔗糖在PBS 20分钟在室温和permeabilized 0.1% triton x - 100和0.1%柠檬酸钠在PBS 2分钟在冰上。终端原位dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色进行使用原位细胞死亡检测装备我所描述的制造商(罗氏)。盖玻片是然后在蒸馏水洗一次5分钟,安装在荧光显微镜下观察玻片。细胞死亡的比例是由TUNEL-positive细胞的数量的比例在100个细胞的总数。5个数的平均值计算神经细胞死亡的比例在一定的治疗。

2.3。西方的屁股

的神经元培养6-well盘子洗了三次0.01 PBS;100年μL细胞裂解缓冲1% phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF)添加到每个细胞与细胞刮刀收获。提取冰30分钟,离心机在14800克15分钟,和上层的收获。变性蛋白质样品稀释与加载缓冲加载同样每个车道和10% sds - page分离,然后涂抹到聚偏二氟乙烯(PVDF微孔)膜。膜培养1小时在阻断缓冲区(无脂肪奶粉tris-buffered盐水含5%)在室温下。膜是孵化在4°C的主要抗体,用trisbuffered盐水洗净Tween-20 (TBST),并再次孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体(杰克逊ImmunoResearch实验室)洗涤紧随其后。包括使用的初级抗体纯化多克隆抗β肌动蛋白抗体(Santa Cruz)单克隆antiactivated Csp3抗体(细胞信号)和多克隆抗体anti-Bcl-2 (Santa Cruz),和单克隆抗体anti-p-AKT(细胞信号)。免疫印迹是在增强化学发光试剂的存在,量化和x射线图像检测到的影片是由光密度扫描用凝胶成像分析系统Gel-Pro 4400(媒体控制论)。

2.4。统计评估

所有数据是作为意味着±S.E.M.统计学意义(或)组间由双尾学生的决定以及。

3所示。结果

探讨CE在初级培养皮层神经元的神经保护作用,我们对车辆的皮层神经元,0.1毫克/毫升CE、1毫克/毫升CE或10毫克/毫升CE 100年缺席或存在M H₂O₂。如图1(一),培养皮层神经元的细胞生存能力明显下降后24 h孵化与h₂O₂与对照组相比,通过MTT试验测试;然而,1毫克/毫升CE或10毫克/毫升CE显著抑制H₂O₂诱导细胞生存能力下降,而独自CE没有显著影响细胞的生存能力主要培养皮层神经元(图1(一))。

确认CE对氧化应激的神经保护作用,LDH释放试验用于测量细胞毒性。结果表明,H₂O₂显著增加神经元的细胞毒性相对于对照组;然而,治疗1毫克/毫升CE或10毫克/毫升CE显著降低细胞毒性引起的H₂O₂独自,而特首没有显著影响神经元的细胞毒性(图1 (b))。

从上述结果表明,CE的神经保护效应高峰在公元10毫克/毫升,这个浓度是用于所有后续实验。TUNEL分析结果进一步证实了CE的神经保护作用的主要培养皮层神经元。如图2后,大脑皮层神经元死亡的数量显著增加治疗H₂O₂相对于对照组;死亡细胞的数量明显减少神经元的孵化与CE。此外,CE独自没有显著影响神经元的细胞死亡。

CE的神经保护作用机制的探讨,我们测试的表达凋亡或凋亡蛋白激酶B(一种蛋白激酶),bcl - 2, Csp3后不同治疗方法。免疫印迹结果表明一种蛋白激酶的磷酸化是H后显著降低₂O₂治疗的对照组相比;然而,孵化的神经元的差别与CE扭转了对这些引起的磷酸化AKT H₂O₂(图3(一个))。此外,如图4(一)凋亡蛋白bcl - 2明显降低,皮质神经元接受H₂O₂相对于对照组;然而,孵化与CE显著抑制H₂O₂bcl - 2相比,神经元的诱导减少H₂O₂治疗组。此外,我们发现,H₂O₂诱导激活与CE Csp3被孵化。

确认的规定所需的一种蛋白激酶CE的神经保护作用,我们使用一种蛋白激酶抑制剂,Ly294002。免疫印迹显示一种蛋白激酶的磷酸化是废除与Ly294002孵化后的神经元(数据未显示),演示的特异性抑制剂。接下来,主要培养皮层神经元处理车辆或10μM Ly294002 30分钟。随后,H₂O₂添加到神经元的缺失或CE 24 h。如图3(一个)Ly294002完全封锁了CE的神经保护效应对氧化应激的皮层神经元。

4所示。讨论

神经退行性疾病是一类广泛的遗传和零星的条件表现为进行性神经系统功能障碍。这些障碍包括阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD),亨廷顿氏病(HD),和朊病毒疾病,是由遗传和环境因素的结合。与超过2000亿美元为研究和治疗广告仅每年在全球范围内,神经退行性疾病仍然没有治疗或预防治疗,可用的治疗方法只提供症状改善。最近,证据表明天然产品承诺目标治疗神经退行性疾病如AD和PD用更少的副作用。例如,研究表明,姜黄素和绿茶多酚防止淀粉样beta-induced神经毒性在体外(11- - - - - -13]。此外,姜黄素抑制氧化损伤和阻止认知障碍动物模型的广告(14]。我们证明了CE防止氢peroxide-induced主要培养的神经元细胞死亡。这是我们先前的调查结果,符合CE抑制淀粉样beta-induced神经毒性。此外,CE获救ischemia-induced神经元死亡和认知障碍大鼠(15]。因此我们的数据支持的假设氧化应激中起着重要的作用在调节淀粉样beta-induced神经病理学,内存赤字和广告的发展。

一种蛋白激酶信号通路是生存和神经保护的主要途径16]。据报道,p-AKT水平降低了患者的大脑从广告和广告的动物模型17,18]。在这里,我们表明,氧化应激的磷酸化水平降低AKT的差别和CE逆转氧化应激对这些活跃的一种蛋白激酶,凋亡的财产。更重要的是,我们发现一种蛋白激酶抑制剂阻止CE对氧化应激的神经保护效应主要培养皮层神经元,这表明CE的神经保护效应被AKT介导的信号通路。因此我们的研究结果是一致的一种蛋白激酶信号通路的作用压力和广告的发展。

bcl - 2蛋白的家庭是一个大家庭,或凋亡的属性。这些包括伯灵顿这是proapoptotic bcl - 2蛋白和凋亡蛋白。细胞凋亡后,伯灵顿发生构象变化,使其疏水C末端;然后oligomerized转移到线粒体和细胞溶质形成孔隙,从而导致细胞色素c的释放和半胱天冬酶的激活,最终导致细胞死亡19,20.]。相比之下,bcl - 2与伯灵顿防止孔隙形成线粒体调解生存和神经保护(21]。鉴于bcl - 2(伯灵顿)的重要作用半胱天冬酶信号通路在细胞凋亡,这并不令人惊讶,发现bcl - 2的表达改变患者的大脑从广告(22]。此外,Csp3已经观察到在突触后密度增加,丰富广告(23]。有趣的是,一项研究发现,抑制Csp3救了突触活动失败和认知功能障碍动物模型的广告(24]。我们表明,bcl - 2蛋白的减少引起的氧化应激与CE预防治疗。此外,我们的结果表明,激活Csp3引起的氧化应激与CE被治疗。基于我们的新发现,这个可能是一个潜在的治疗目标广告。因此继续调查特首的功能是必要的。

作者的贡献

哲郭和Rui-Yuan锅了同样的工作。

确认

作者感谢支持民族大学985年基金(MUC98504-14),中央大学的基础研究基金(1112 kyzy41),和111年项目(B08044)。

引用

1. j·d·张g . Liu史,j .张“Coeloglossum viride var. bracteatum提取变弱D-galactose和纳米₂诱导小鼠记忆障碍。”民族药物学杂志,卷104,不。1 - 2、250 - 256年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. S.-Y。黄,G.-Q。李,J.-G。施,S.-Y。莫”,根状茎的化学成分Coeloglossum viride var. bracteatum,”亚洲天然产物研究杂志》上》第六卷,没有。1,49 - 61年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. m . Li Y.-F。王马,G.-T。刘,j j。张”效应和机制的Coeloglossum viride var. bracteatum提取scopolamine-induced赤字的啮齿动物的学习和记忆行为,”Pharmaceutica学报,44卷,不。5,468 - 472年,2009页。视图:谷歌学术搜索
4. 业务,r . a . Quintanilla说道j·a·奥雷利亚纳和r·冯·Bernhardi”了解阿尔茨海默病的危险因素:相互作用的存在,connexin-based沟通和氧化应激,”档案的医学研究,43卷,第644 - 632页,2012年。视图:谷歌学术搜索
5. 程y和L.-C。甘丙肽保护淀粉样蛋白- Yu。β全身的神经毒性主要培养的海马神经元的老鼠,”阿尔茨海默氏症期刊》上,20卷,不。4、1143 - 1157年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. p . Mecocci美国MacGarvey, m·f·比尔”线粒体DNA氧化损伤是增加在阿尔茨海默氏症,”神经病学年鉴,36卷,不。5,747 - 751年,1994页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. a . Furuta d l .价格,c . a . Pardo et al .,”定位的超氧化物歧化酶在阿尔茨海默氏症和唐氏综合征的大脑皮层和海马,”美国病理学杂志》上,卷146,不。2、357 - 367年,1995页。视图:谷歌学术搜索
8. r·a·奥马尔Y.-J。Chyan, a·c·Andorn b . Poeggeler n . k . Robakis和m . a . Pappolla”增加抗氧化酶的表达但减少活动在阿尔茨海默氏症,”阿尔茨海默氏症期刊》上,1卷,不。3、139 - 145年,1999页。视图:谷歌学术搜索
9. k .村上春树:日本村田公司,y野田佳彦et al .,“SOD1(铜/锌超氧化物歧化酶)缺乏驱动淀粉样蛋白β蛋白质寡聚化和记忆丧失在阿尔茨海默病小鼠模型,”《生物化学》杂志上,卷286,不。52岁,44557 - 44568年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. m·j·麦克马纳斯·m·p·墨菲和j·l·富兰克林,“mitochondria-targeted抗氧化剂mitoq防止损失的空间记忆力和早期神经病理学在阿尔茨海默病转基因小鼠模型,”《神经科学杂志》上没有,卷。31日。44岁,15703 - 15715年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. X.-Y。秦,j·崔、张y, y Cheng和L.-C。姜黄素对淀粉样蛋白的潜在保护玉。β全身毒性对培养大鼠前额叶皮层神经元。”神经学字母,卷463,不。2、158 - 161年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. X.-Y。秦、y . Cheng和L.-C。Yu”,姜黄素对细胞内淀粉样蛋白的潜在保护β全身毒性在培养大鼠前额叶皮层神经元。”神经学字母,卷480,不。1、21 - 24日,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. X.-Y。秦、y . Cheng和L.-C。Yu”的潜在保护绿茶多酚对细胞内淀粉样beta-induced毒性主要讲究的前额叶皮层神经元的老鼠,”神经学字母,卷513,不。2、170 - 173年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. s . A等,w·胡,p . Kim et al .,“酚醛抗炎抗氧化的逆转β全身的认知障碍和神经病理学”,神经生物学衰老的,22卷,不。6,993 - 1005年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. h . b .妈,m . Li侬,j .史g . Liu和j·张,“保护作用的提取Coeloglossum viride var. bracteatum ischemia-induced神经元死亡和认知障碍的老鼠,”行为药理学,19卷,不。4、325 - 333年,2008页。视图:谷歌学术搜索
16. n . x y Cheng考利,y . p . Loh“羧肽酶E / NFalpha1:一个新的神经营养因子对氧化应激通过ERK和PI3-K / AKT介导的凋亡细胞死亡途径,”《公共科学图书馆•综合》文章ID e71578卷。8日,2013年。视图:谷歌学术搜索
17. H.-K。李·库马尔傅,k . m . Rosen和h·w·Querfurth胰岛素/ Akt信号通路是细胞内的目标β淀粉样蛋白”,细胞的分子生物学,20卷,不。5,1533 - 1544年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. j . Magrane k·m·罗森r·c·史密斯·g·k . Gouras k·沃尔什和h·w·Querfurth Intraneuronalβ淀粉样蛋白的表达会使生存Akt通路,减弱应激反应,”《神经科学杂志》上,25卷,不。47岁,10960 - 10969年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. y邓,吴x Peg3 / Pw1促进p53-mediated凋亡诱导伯灵顿易位从胞质到线粒体,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷97,不。22日,第12055 - 12050页,2000年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. 美国共和党,a .总值j·n·拉瓦et al .,“监管针对线粒体的伯灵顿,”《细胞生物学》杂志上,卷143,不。1,第215 - 207页,1998。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. j . e . Chipuk d·r·格林,“怎么bcl - 2蛋白诱导线粒体外膜透化作用?”细胞生物学的趋势,18卷,不。4、157 - 164年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. y北村,s . Shimohama w . Kamoshima et al .,“改变蛋白质的调节细胞凋亡、bcl - 2, Bcl-x,伯灵顿,贝克,坏,ICH-1 CPP32,在阿尔茨海默氏症,”大脑研究,卷780,不。2、260 - 269年,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. n . Louneva j·w·科恩,L.-Y。韩寒et al .,“Caspase-3浓缩在突触后密度和增加在阿尔茨海默氏症,”美国病理学杂志》上,卷173,不。5,1488 - 1495年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. m . D 'Amelio诉Cavallucci, s Middei et al .,“Caspase-3引发突触功能障碍早期阿尔茨海默病小鼠模型,”自然神经科学,14卷,不。1,第79 - 69页,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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