文摘

确定化合物的口服吸收后,大鼠血清Wu-Jia Sheng-Hua (WJSH)胶囊,中药(TCM)复合处方,一个ultraperformance液相色谱加上电喷雾电离质谱(UPLC /谱)方法,建立了。吸收化合物的色谱分离和代谢物实现ACQUITY UPLC本·C18柱(2.1毫米 50毫米,1.7 米)梯度洗脱。流动相是乙腈和水组成的缓冲与醋酸铵(10毫米)和甲酸(0.1%,V / V)。十二个吸收化合物和四个代谢物被发现。七电喷雾质谱吸收化合物被确定。吸收化合物的识别可能有助于更好的理解机制WJSH胶囊的药理作用。

1。介绍

中国产后护理(Zuoyuezi)一直被视为一个关键rite-to-passage女人的复苏和过渡到母亲分娩后(1]。Sheng-Hua-Tang的使用,一个著名的中国传统医学(中医)复合处方,在产后一直在中国社区长期流行。先前的研究表明,Sheng-Hua-Tang使用产后第一个月的期间可能会有积极的影响女性的健康相关生活质量,尤其是角色限制由于身体健康和情感问题2]。Wu-Jia Sheng-Hua胶囊(组成基数等主茎Acanthopanacis Senticosi,当归,根状茎Chuanxiong,桃仁,甘草,干姜说明附子),源自Sheng-Hua-Tang,已经广泛应用于中国妇女促进血液流动,解决血瘀,缓解postchildbirth疼痛,减少流血量和缩短出血时间在中国女性人工流产后(3,4]。物质基础,即生物活性成分、Wu-Jia Sheng-Hua (WJSH)胶囊仍不清楚,尽管前列腺素F2alpha (PGF2α)、前列腺素E2(铂族元素2)、内皮素(ET)和一氧化氮(NO)水平被认为是部分负责WJSH胶囊的疗效和恢复效益与阴道出血(人工流产4]。

中药血清药物化学,基于假设活性化合物应该出现在血中医管理局后,提出了本et al。5,6]。在过去的二十年里,被证明是有用的在认识到真正的活性成分在中医和获得更好的理解中医的治疗效果下的机制(7- - - - - -9]。

在目前的研究中,一个ultraperformance液相色谱加上电喷雾电离质谱(UPLC /谱)方法开发和申请调查WJSH胶囊的血清药物化学。认为中医表示其影响通过多组分多目标(10]。WJSH识别的多种生物活性成分吸收和代谢产物可能有助于更好地理解在其疗效机制。

2。实验方法

2.1。试剂和化学物质

Syringin、原儿茶酸、liguiritin,阿魏酸,isofraxidine,绿原酸,liqustilide(标准)购买的国家控制药品和生物制品研究所(中国,北京)。

乙腈、甲醇、甲酸和甲酸铵(高效液相色谱级)是来自默克(达姆施塔特,德国)和Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国),分别。其他化学物质的分析级。

Wu-Jia-Sheng-Hua胶囊和每一个草盛吴贾华胶囊的处方是两人两人的礼物制药有限公司(黑龙江,中国)。

2.2。UPLC条件

的色谱分离吸收组件和代谢物进行水域ACQUITY UPLC系统(水Corp .,米尔福德,妈,美国)配有紫外检测器,autosampler, ACQUITY UPLC本·C18柱( 1.7毫米,μ米),自动恒温柱温箱。(A)水的流动相组成与乙酸铵缓冲(10毫米)和甲酸(0.1%,V / V)和(B)乙腈。列温度保持在40°C。目标化合物的洗脱梯度模式进行了B的体积百分比从5%到50%在最初的10分钟,从50%到80%在接下来的6分钟。流量为0.4毫升/分钟,注射量是8μl

2.3。女士的条件

获得的MS和MS / MS数据研究了化合物,一个水域Quattro首映XE triple-quadrupole质谱仪(Micromass MS技术)是上述UPLC系统耦合。积极的电喷雾电离进行(ESI)模式。质量范围设定在m / z100 - 1000 Da扫描时间是0.5秒。电离参数如下:间隔时间,0.2年代;毛管电压,3.5 kV;锥电压35 kV;电离资源温度、120°C;反溶剂温度、380°C,反溶剂气体流量、500 L / h (N2);和锥气体流量、50 L / h (N2)。MassLynx软件(版本4.1)和QuanLynx软件被用于系统控制和数据处理,分别。

2.4。样品制备

5毫升甲醇加入1毫升空白鼠血清样本或WJSH胶囊血清样本。混合物是涡为3分钟。和离心机,持续15分钟。(4°C, 5000 rpm)。5毫升上层清液干下温柔的氮气流在37°C。残留物被保持在−20°C。分析之前,每个残留在1毫升甲醇和离心机重组了15分钟。(4°C, 14000 rpm)。8μL上层清液注入了UPLC-ESI-MS分析。

2.5。血清药物化学研究WJSH胶囊

WJSH胶囊和生药材的提取WJSH胶囊单独准备。10毫升甲醇加入0.4 g WJSH或每个原料药材。悬浮液是用了30分钟。离心机(3000 rpm) 15分钟。0.45,过滤μ美国微孔膜(微孔)。收集上清液中提取。

男性Sprague-Dawley老鼠(230克 10 g中,实验动物中心黑龙江中医药大学)被随机分为8组(6):A组群h .所有关心和处理的动物进行批准制度权威实验动物照顾黑龙江中医药大学。

禁食12小时后,生理盐水(空白控制)和提取的WJSH胶囊有intragastrically在A组和B组大鼠,分别。提取的原料药材有intragastrically老鼠的其他6组(每组一个提取)。剂量为1.5毫升/ 100克体重,和政府频率每天一次连续三天每组中。在上届政府后40分钟,5毫升血液收集通过肝门静脉。血液样本使离心10分钟。在5000转4°C分离血清样本。残留物被保持在−20°C到分析。

3所示。结果和讨论

3.1。UPLC-ESI-MS条件的优化

净化血清样本,蛋白质沉淀,液液萃取和固相萃取方法都试过了。最后,简单的蛋白质沉淀方法选择与甲醇,因为大多数研究纯化样品中化合物被发现。

相比甲醇-水系统,高分辨率,更好的形状、峰值和更快的化合物通过使用acetonitrile-water洗脱系统与醋酸和甲酸铵缓冲。因此,该系统是作为流动相。吸收组件和代谢产物的色谱分离是在梯度洗脱模式进行整体减少这些化合物的保留时间不同极性的特征。梯度洗脱的时间表是列在表中1。

表1
梯度洗脱的时间表UPLC条件。

电喷雾质谱的条件下,反应越强的化合物得到积极的电离模式比消极的模式。因此,积极的模式采用的总离子流色谱(TIC) WJSH胶囊血清样本m / z100年至1000年期间Da的范围。

3.2。吸收组件的识别

多种生物活性成分的中药使用UPLC-ESI-MS技术可以同时确定。通常有助于更好地理解传统中药的疗效机制。

的血清药物化学研究WJSH胶囊是在老鼠身上进行的口头管理WJSH胶囊。然后,吸收生物活性成分包括它们的代谢物被建立UPLC-ESI / MS方法确定。典型的抽搐色谱WJSH胶囊的提取,WJSH胶囊血清样本,空白血清样本如图1。十二个化学物质的色谱峰出现在抽搐的色谱WJSH胶囊血清样本和WJSH胶囊提取,而不是空白血清样本,被认为是吸收组件。同样,四种物质的色谱峰提出只有在抽搐色谱WJSH胶囊血清样品,但不是在WJSH胶囊的提取或空白血清样本,应该是代谢物。

(一)
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图1
总离子色谱图(a) WJSH胶囊提取,(b)的混合标准,(c) WJSH胶囊血清样本,和(d)空白鼠血清积极模式。峰:1、syringin;2、原儿茶酸;3,liguiritin;4、阿魏酸;5,isofraxidin;6,绿原酸;7,liqustilide;M1, M2, M3, M4,代表代谢物1,2,3和4分别。

通过比较MS / MS谱,抽搐色谱的色谱峰WJSH胶囊血清样本与标准,分别7吸收组件被明确标识。例如,MS / MS谱峰5比isofraxidine标准。这些MS / MS谱图所示2。由于准分子离子m / z223年[M + H]+碎片离子,m / z192 [M + H-OCH3]+,在m / z161 [M + H-OCH3哟3]+同时被发现的MS / MS谱峰5和isofraxidine的标准;这被证实是isofraxidine吸收组件。其他六个组件相同的方式被确定。确定组件的化学结构被显示在图3。其他五个组件和四个代谢物吸收不确定,需要进一步调查。

(一)
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(b)
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图2
MS / MS (a)的光谱峰5抽搐WJSH胶囊血清样品的色谱图;(b) isofraxidine标准。

图3
确定生物活性成分WJSH胶囊口服后吸收鼠血浆。

通过比较血清样本的抽搐色谱,WJSH胶囊,WJSH胶囊基数等主茎Acanthopanacis Senticosi,和基数等主茎Acanthopanacis Senticosi孤独,isofraxidine起源于被确认基数等主茎Acanthopanacis Senticosi。同样,原植物的吸收其他组件和代谢物被证实。这些抽搐色谱图所示4。保留时间,MS / MS数据和原始的植物吸收组件和代谢物被列在表中2和3,分别。

表2
保留时间、质/ MS +数据(m / z),后在大鼠血清和起源的吸收组件WJSH胶囊口服。
表3
保留时间、质/ MS +数据( ),后大鼠血清代谢物的起源WJSH胶囊口服。
(一)
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(c)
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图4
血清样本的抽搐色谱:(一)WJSH胶囊;(b)基数等主茎Acanthopanacis Senticosi独自一人;(c) WJSH胶囊基数等主茎Acanthopanacis Senticosi。峰:1、syringin;2、原儿茶酸;3,liguiritin;4、阿魏酸;5,isofraxidine;6,绿原酸;7,liqustilide;M1, M2, M3, M4代表代谢物1、2、3和4分别。

通过揭示中药复方处方的生物活性成分,血清药物化学研究可能会大大有助于更好的理解在这些药方的疗效机制。例如,WJSH胶囊和Danggui-Shaoyao-San已经广泛用于中国女性加强产后子宫对合,缓解痛经,分别为(11,12]。在药理实验中,前列腺素(PG)水平规定被证明是部分负责WJSH胶囊的子宫肌层收缩刺激和抑制效应和Danggui-Shaoyao-San,分别(4,12]。在以前的和现在的血清药物化学调查,相同的(阿魏酸和liqustilide)和不同(syringin、原儿茶酸、liguiritin isofraxidine, WJSH胶囊和绿原酸;芍药苷磺酸盐,albiflorin、芍药、butylidenephthalide senkyunolide我WJSH Danggui-Shaoyao-San)生物活性成分的胶囊,Danggui-Shaoyao-San被确定(13]。进行比较药代动力学和药理实验,WJSH胶囊的主要生物活性成分和相关Danggui-Shaoyao-San影响差别,对这些基因的子宫肌层的收缩可能会证实,和其他并存组件的影响这些影响可能透露。因此,机制下WJSH胶囊和Danggui-Shaoyao-San的疗效可能阐明。

4所示。结论

在这项研究中,一个UPLC-ESI-MS方法建立了调查WJSH胶囊的血清药物化学。这样,十二吸收生物活性成分和四个代谢物是鼠血清中发现的。七个吸收生物活性成分的确定。这些结果可能会有利于更好地理解机制WJSH胶囊的疗效。

利益冲突

本文的作者宣布,他们没有利益冲突。

确认

这项工作是财务支持黑龙江教育部门的科学和技术研究项目(12511167)。