Capture-SELEX:选择DNA寡核苷酸适配子的氨基糖苷类抗生素

文摘

有机小分子具有挑战性的目标,一个适配子选择使用SELEX技术(SELEX-Systematic进化的Ligans指数浓缩)。通常他们不适合固定在固体表面上,这是一种常见的程序已知的适配子选择方法。Capture-SELEX过程允许DNA寡核苷酸适配子溶质的选择目标。建立了一个特殊的SELEX图书馆,目的是在磁珠固定这个库或其他表面。为此一个对接的序列被纳入的随机区域图书馆使杂交补充益生元固定在磁珠。寡核苷酸的图书馆展览高亲和力到目标和二级结构拟合目标释放珠子的适配子选择过程中绑定到目标。这些绑定的寡核苷酸复合物被放大,纯化,通过对接序列磁珠固定如下选择圆的起点。基于这个Capture-SELEX过程,成功的DNA适体选择的氨基糖苷类抗生素卡那霉素作为小分子的目标。

1。介绍

寡核苷酸适配子是一个非常有吸引力的目标分子需求量很大应用在许多领域,如医学(作为诊断和治疗代理)、医药(用于药物发现和验证),以及环境和食品分析(如生物识别元素)。寡核苷酸适配子天生核酸分子,但他们的功能是基于复杂的三维结构与传统观点不同核酸是遗传信息的载体。复杂的折短,单链DNA或RNA寡核苷酸适配子根据他们的主要序列使他们能够与高亲和力和特异性结合给定的目标。适体和目标之间的分子间相互作用的特点是结合互补的形状,叠加芳香族化合物和寡核苷酸适配子的碱基之间的相互作用,静电相互作用组,和氢键1- - - - - -3]。自1990年第一次出版寡核苷酸适配子(4,5),他们被描述为各种不同类型的目标的小分子,如核苷酸,代数余子式或氨基酸,多肽,多糖和蛋白质等复杂结构整个细胞,病毒和单细胞生物(6]。越来越多的适配子出版物多年来描述他们的选择及应用显示了这个研究领域非常感兴趣。在这个领域的一个挑战是优化的方法得到新的寡核苷酸适配子与杰出的绑定在一定目标的能力。寡核苷酸适配子通常是由一个叫做SELEX-Systematic体外选择和放大技术指数富集配体的进化。(4,5]。SELEX过程是一个迭代的过程。从DNA寡核苷酸库组成一个大序列多样性和结构复杂性只有那些寡核苷酸和浓缩在几个SELEX轮可以选择紧密绑定到特定的目标分子(7,8]。SELEX过程的基本步骤是寡核苷酸和目标间的结合反应,清洗步骤删除飘散的寡核苷酸,酶放大的target-bound寡核苷酸,选择的寡核苷酸和净化池随后开始下一个选择。最好的拟合序列生存选择过程和代表了有针对性的适配子池作为一个成功的SELEX过程的结果。从应用程序的早期阶段的SELEX技术,它往往是修改选择过程更高效和更少的时间消耗和选择寡核苷酸适配子与特定的绑定功能(亲和力和特异性)分子不同的目标和不同的应用程序。变化通常关注绑定条件(缓冲,温度和时间),目标绑定和不具约束力的高效分离寡核苷酸(9),引入额外的选择步骤,像负面或柜台选择步骤删除是非绑定寡核苷酸或区分目标分子密切相关,oligonucleotide-target复合物的严格清洗步骤提高特异性寡核苷酸适配子的选择,标记寡核苷酸的量化或洗脱的寡核苷酸结合复杂之前放大(7]。适体的一个重要方面选择也是SELEX库的设计和修改在核苷酸水平或结束的寡核苷酸。这样的修改可以用于提高寡核苷酸的稳定所必需的RNA寡核苷酸适配子的选择或引入新官能团等功能提供新的可能性与目标分子(6,10,11]。众多SELEX变异表明,没有标准选择协议适用于任何类型的目标。选择条件必须仔细调整对寡核苷酸适配子的特定目标特性和所需的应用程序。医疗和分析应用程序例如适配子可以有不同需求的工作条件如缓冲区组成或温度。探头矩阵往往适体的稳定性提出了挑战和特异性,可影响由核酸适体筛选过程中修改和counterselection步骤。

在本文中,我们描述的发展称为Capture-SELEX SELEX变体。这是部分来自FluMag-SELEX过程出版于2005年(12),它的特点是固定目标分子的磁珠和量化的荧光标记的寡核苷酸。两者之间的主要区别是表示目标分子的寡核苷酸。目的是为目标选择DNA寡核苷酸适配子不适合固定在固体表面上,像小有机分子,例如,药品。因此,一个特殊的SELEX图书馆开发根据Nutiu和李,200513]使固定的寡核苷酸适配子筛选过程中而不是目标分子。本文还描述了Capture-SELEX的成功应用程序使用的混合药品(卡那霉素a,磺胺脲、磺胺甲恶唑和盐酸心得怡)适配子选择目标。药物残留在表面,地面和饮用水。他们大多来自人类和动物出现治疗。在这种背景下抗生素越来越多问题。他们引入到环境中促进抗生素耐药性细菌基因的扩散。寡核苷酸适配子与特异性药物可用于生物传感器和检测这些物质的快速和容易的检测(14]。记住这个需求我们组装上述目标混合组成的三个抗生素和β-受体阻滞药盐酸心得怡。使用Capture-SELEX过程,一个适配子池对卡那霉素特异性富集。

2。材料和方法

2.1。化学物质

化学品准备缓冲和解决方案都是来自默克公司(德国)如果没有提到。卡那霉素硫酸氢盐盐二水合物、磺胺脲、磺胺甲恶唑和盐酸心得怡购自Sigma-Aldrich(德国)。PCR(聚合酶链反应)的组件(比如10×反应缓冲区,25 mMMgCl₂,HOTFire聚合酶从索利斯购买生物因素(爱沙尼亚)。100毫米的股票解核苷酸来自通用电气医疗集团(德国)。

2.2。Capture-SELEX图书馆,捕捉低聚糖和引物

Capture-SELEX图书馆BANK-S4被Microsynth合成(瑞士)包括一个页面(聚丙烯酰胺凝胶电泳)纯化步骤。图书馆由多种不同的寡核苷酸。每一个都包含特定的引物结合位点(pbs) 18元的5′和3′末端和两个不同大小的随机区域(N)由一系列具体的对接的12元:5′-ATACCAGCTTATTCAATT-N₁₀-TGAGGCTCGATC-N₄₀-AGATAGTAAGTGCAATCT-3′(图1)[12,15]。以下引物被用于放大的寡核苷酸适配子筛选过程中,合成了biomers.net(德国):AP10:5′-ATACCAGCTTATTCAATT-3′, AP60:修改后的变体的AP10 5′荧光素,AP20:5′-AGATTGCACTTACTATCT-3′,和TER-AP20:修改后的变体AP20 5′-poly-dA_20.-HEGL [12]。捕获益生元i-ODN2Sp特点是对接的互补序列的寡核苷酸序列库:5′-Bio-GTC-HEGL-GATCGAGCCTCA-3′(图1)。它还包含三个额外的核苷酸和hexaethylene乙二醇垫片(HEGL) 5′端。捕获益生元修改5′生物素,还合成了Microsynth(瑞士)包括纯化步骤的页面。

2.3。耦合Streptavidin-Coated的磁珠捕获的寡核苷酸

超顺磁的Dynabeads m - 270链霉亲和素(直径2.8μ米)从英杰公司购买/生命科技(美国)。适量的这些streptavidin-coated磁珠从储备溶液转移到样品管和500洗了三次μL黑与白缓冲区(绑定和洗涤缓冲,10毫米Tris-HCl pH7.5, EDTA 1毫米,和2 M氯化钠)。珠子被隔开放置磁铁站地铁。洗后的珠子在黑与白resuspended缓冲2×10的浓度⁹珠子/毫升,同等体积的生物素化的捕捉低聚糖i-ODN2Sp添加(600 pmol生物素化的益生元/ 1×10⁸珠)。这个固定的混合物在室温下培养1 h和温柔旋转使用开销瓶(Intelli-Mixer RM-2, neoLab,德国)。珠子被分离并与500洗了三次μL黑与白的缓冲区,然后与500年的三倍μL选择缓冲(100毫米氯化钠,20毫米Tris-HCl pH7.6, MgCl 2毫米₂、5毫米氯化钾和CaCl 1毫米₂)。在选择缓冲再悬浮后的最终浓度1×10⁹珠子/毫升,streptavidin-coated磁珠,现在修改与生物素化的捕捉低聚糖i-ODN2Sp,准备用于Capture-SELEX过程。珠浓度可以确定更准确的显微计数(显微镜奥林巴斯BX60,奥林巴斯欧罗巴控股GmbH德国)使用Neubauer-improved计数室。

2.4。目标解决方案

四个药品(卡那霉素硫酸氢盐盐二水合物,磺胺脲、磺胺甲恶唑和盐酸心得怡,见下表1)被用作适配子选择目标混合物。个股的解决方案准备的药品,在选择缓冲稀释,混合为每个物质的最终浓度1毫米。这个混合物是无菌过滤使用注射器过滤器与孔隙大小为0.22μ德国米(VWR)、整除和储存在−18°C。

2.5。Capture-SELEX过程

每个Capture-SELEX一轮始于寡核苷酸池的热量平衡选择缓冲区。2 - 3 nmol图书馆的寡核苷酸在第一轮,在第二轮,选定的寡核苷酸的总量从上一轮,分别被加热到90°C 8分钟,立即冷却,保持在4°C 10分钟后跟一个短在室温下孵化。同时,streptavidin-coated磁珠的整除与捕获寡核苷酸(1×10修改⁹珠子在第一轮和1×10⁸珠子的第二轮)与500年洗了三次μL选择缓冲区。300年resuspended的珠子μL的寡核苷酸池预处理和孵化隔夜21°C有轻微摇晃。这个步骤是固定的寡核苷酸从池中磁珠的杂交对接在寡核苷酸序列和捕获珠子上的寡核苷酸。的寡核苷酸是被洗珠子与500年九次μL选择缓冲区。在温度一步所有的剩余unhybridized寡核苷酸或削弱了DNA双螺旋结构被孵化500年DNA-bead-complexes消除μL选择缓冲28°C与轻微的晃动,随后洗15分钟与500年的7倍μL选择缓冲区。300年以下的孵化DNA-bead-complexesμL选择缓冲21°C 45分钟有轻微摇晃作为控制背景杂化寡核苷酸的洗脱造成的珠子孵化过程。洗后再与500年的7倍μL选择缓冲,DNA-bead-complexes孵化21°C 300年45分钟有轻微摇晃μ目标混合的L(见部分2。4)。寡核苷酸与亲和选择目标可以折叠成特定的三维结构绑定到目标的解决方案,因此从DNA-bead-complexes发布在这个目标绑定步骤。他们可以在上层清液收集珠子的磁选。

这些选中的寡核苷酸绑定到目标直接放大15平行PCR反应。每个包含1μ的引物AP60 TER-AP20,每个核苷酸0.2毫米,1.9毫米MgCl₂5 U HOTFire聚合酶在PCR反应缓冲区(80毫米Tris-HCl pH9.5, 20毫米(NH)₄)₂所以₄,0.02% Tween20)在100年一个卷μl .放大条件15分钟在95°C的1分钟和30个周期95°C, 1分钟在51°C,在72°C 1分钟,10分钟的最后一步最后一个循环后72°C。因此,dsDNA荧光素修改了产品的5′端相关链和poly-dA_20.扩展的5′端反义链。2.5%琼脂糖凝胶上电泳用于监控成功放大,放大DNA的正确的大小。影响药品的PCR反应检查,不能观察到的。

所有PCR产品池,沉淀用乙醇存在线性聚丙烯酰胺(19在100年,resuspendedμL TE缓冲(10毫米Tris-HCl pH7.4 1毫米EDTA)。的两股dsDNA由于poly-dA长度不同_20.扩展的反义链20.]。这是用于两个DNA链的分离制备变性聚丙烯酰胺凝胶8%的网页,内容包括7毫米尿素和甲酰胺20%此种缓冲(Tris-HCl 90毫米、90毫米硼酸和2毫米EDTA)。fluorescein-labeled意义上链可以确定凝胶使用紫外线透照器。相应的DNA带切断,单链DNA (ssDNA)从2毫米EDTA的凝胶,筛选了300毫米醋酸钠,pH7.8在80°C的150分钟轻微的颤抖。后去除残留的凝胶过滤通过使硅烷化玻璃棉,在筛选了ssDNA沉淀用乙醇存在线性聚丙烯酰胺(19)和resuspended选择缓冲区。新一池的选择和fluorescein-labeled寡核苷酸现在已经准备好开始下一轮Capture-SELEX过程的寡核苷酸池的固定磁珠。

荧光素标签附加到寡核苷酸从第二轮开始使量化的寡核苷酸在SELEX分数像洗涤步骤,温度一步,背景洗脱,目标绑定。这是很重要的,为了评估选择进步几个SELEX轮。通过这种方式浓缩特定目标绑定的寡核苷酸是监控。总的来说,这个Capture-SELEX过程进行了13轮,一个pharmaceutical-specific适配子池被选中。

选中的适配子池从13轮Capture-SELEX的放大与修改的引物AP10 AP20随后克隆到向量pCR2.1-TOPO(威尼斯平底渔船助教从表达载体克隆工具和生活技术,美国)。由此产生的重组载体转化为化学主管大肠杆菌全球细胞(也威尼斯平底渔船TA克隆工具包提供的)。可以进行一些积极的转化株菌落PCR使用组合vector-specific底漆(向前M13引物或M13反向引物)和一个aptamer-specific底漆(例如,底漆AP10)。这种方法使快速筛查正确的质粒直接插入大肠杆菌殖民地。96年克隆的质粒DNA是孤立使用QIAprep 96涡轮Miniprep工具包试剂盒(德国),并插入DNA适体的克隆测序(Microsynth、瑞士)。获得的序列分析和一致通过使用提供的基于web的工具ClustalW EBI web服务器(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)[21- - - - - -23]。

2.6。寡核苷酸适配子的特异性和亲和力测试

个体的适配子候选人选择进一步特征合成了5′Microsynth荧光素标记的页面(瑞士)包括净化步骤。比较绑定测试与个别寡核苷酸适配子进行混合使用目标根据Capture-SELEX条件(见部分2。4)以及个人制药的解决方案。选择缓冲区没有任何目标物质被用作背景控制。

数绑定测试并行执行。适量的新鲜整除streptavidin-coated磁珠捕获寡核苷酸(5×10修改⁷珠子为每个绑定测试)是500年第一次洗了三次μL选择缓冲区。每5×10 50 pmol适体⁷珠子在300年暂停了μL选择缓冲和加热到90°C预处理为8分钟,立即冷却10分钟4°C,并保持它在室温下5 - 6分钟前将它添加到洗珠子。孵化了一夜之间在21°C和轻微摇晃固定寡核苷酸适配子的磁珠。平均而言,在每一个测试中,一个量寡核苷酸适配子pmol (ssDNA使用的最初决定的区别和ssDNA隔夜后上层清液固定步骤)固定在()×10⁷streptavidin-coated磁珠修改与捕获寡核苷酸。以下步骤的背景洗脱Capture-SELEX节描述的都是相同的。背景洗脱珠子洗后与500年的六倍μL选择缓冲和均匀分布在反应管的数量根据计划绑定测试。300年DNA-bead-complexes被resuspendedμL制药混合物(最终浓度为每一个制药1毫米),300年μL个人制药为特异性测试解决方案(最终浓度1毫米),300年μL不同集中个人亲和力制药解决方案测试(例如,一系列卡那霉素浓度在0 - 1.5毫米),或只在300年μL选择缓冲控制。孵化21°C进行45分钟的轻微的颤抖。进一步措施都是Capture-SELEX小节中描述的相同。

期间释放的适配子目标绑定步骤的珠子是由荧光检测和计算使用校准曲线。荧光条件中描述的部分2。7。解决方案是离心机之前移液成96 microwell板为了消除大部分剩余的珠子。寡核苷酸适配子用于校准曲线的确定受到相同的热预处理寡核苷酸适配子测试用于特异性和亲和力。

2.7。荧光检测

所有的荧光测量fluorescein-labeled DNA进行Wallac 1420维克多²V Multilabel计数器(PerkinElmer、德国)激发在485 nm,排放在535海里(提示氟量计,1 s, CW-lamp能源22500)。阅读进行96年黑色microwellplates NUNC /热费希尔科学(德国)样本容量为100μ信用证。0.4校准曲线在-40 pmol /毫升fluorescein-labeled ssDNA准备从Capture-SELEX库(BANK-S4)是用于计算样本的DNA浓度。对于购买fluorescein-labeled寡核苷酸适配子,他们每个人必须校准曲线确定。没有影响力的药品检测荧光读数。

3所示。结果与讨论

3.1。设计Capture-SELEX图书馆和捕获寡核苷酸

选择过程的起点有针对性的寡核苷酸适配子是SELEX库,包括大量的不同的寡核苷酸(大约10¹⁵独特的序列),它可以折叠成不同的三维结构。这个功能是通过随机寡核苷酸的区域。典型的SELEX图书馆由寡核苷酸相同的长度和一个中央,随机地区20个核苷酸,两侧特定序列的5′和3′末端。后者作为引物结合位点扩增PCR的寡核苷酸适配子筛选过程。这种完全随机的图书馆可以转化为部分随机库给它新的功能,例如,通过定义序列引入随机区域。在这里,我们描述了使用这些额外的,序列区域定义为对接序列来构造一个Capture-SELEX库。在一个典型的SELEX实验,目标分子通常是固定在固体表面,使一个有效的分离目标绑定和不具约束力的寡核苷酸在每个SELEX圆的。这是一个非常关键的一步成功的适体的选择。传统的方法与目标固定化亲和色谱法在不同的列材料或使用磁珠固定矩阵。但这种方法论的方法并不适用于所有潜在的适体目标,尤其是非常小,有机目标分子只有很少或根本没有合适的官能团。 Additional functionalization of such molecules often affects their structural features. However, retaining the native biomolecule structures of the targets is very important for the binding features of the aptamers to be selected. On the other hand, size-dependent separation techniques like filtration or centrifugation are often not practicable for small, organic target molecules. The Capture-SELEX library provides an alternative approach by immobilization of the oligonucleotides to a solid matrix instead of the targets. This is done by hybridization between the docking sequence within the oligonucleotides and a complementary capture oligo, which is coupled to the solid matrix by affinity binding or covalent binding. The selection concept is based on release of those oligonucleotides from the matrix which show an affinity to the selection target and therefore undergo a specific conformational change for binding to the target in solution. One possible risk of this concept is that not all oligonucleotides of a SELEX library are productive. Those of them which can bind to the target but do not undergo a conformational change including the docking sequence are not released and therefore are not selected, especially during the first SELEX round.

Capture-SELEX图书馆的设计称为BANK-S4(见图1Nutiu中描述)是来自设计和李,200513]。他们首先描述一个适配子选拔程序基于结构转换想法,目的是立即将选中的寡核苷酸适配子转换成荧光信号记者分子复合物的检测绑定。

BANK-S4特点是一个内部非结构化12-nucleotide对接序列两侧是两个非对称随机地区安排。其中一个是构造相对较大的40元库的结构复杂性。其他由只有10元。短随机区域(20 - 25元)的SELEX图书馆似乎是足够的对于一个成功的适配子选择,因为post-SELEX优化截断经常显示一个相对较短的最小功能的许多寡核苷酸适配子序列。然而,再随机区域(至少60 - 70元)给库结构复杂性更高,例如,包括高阶连接(24)和可能提供更好的机会,一个DNA分子间的相互作用和在一个扩展的目标域的约束力的合作伙伴。对接的设计序列(长度和核苷酸组成)是旨在实现双工之间的平衡与捕捉低聚糖形成稳定的固定的图书馆和依赖于目标释放复式结构的寡核苷酸形成特定oligonucleotide-target复合物。的引物结合位点的5′和3′端BANK-S4寡核苷酸来自FluMag-SELEX图书馆Stoltenburg et al . 2005中描述12]。

第二部分Capture-SELEX图书馆的概念是捕获的低聚糖(图1),由12个核苷酸互补为方便对接序列,生物素化的耦合streptavidin-modified矩阵,例如,磁珠。杂交序列之间的对接和matrix-coupled捕捉低聚糖许可的固定Capture-SELEX图书馆。两种捕获益生元设计有关生物素酰化网站,5′和3′端的寡核苷酸(i-ODN2Sp或i-ODN4Sp,图1),暗示两个阵营中包含的寡核苷酸SELEX图书馆由于不对称排列的随机序列。从理论上讲,可能两个阵营:杂交到i-ODN2Sp时,再随机区域(N₄₀)是指向磁珠的表面,而当杂交到i-ODN4Sp,较短的随机区域(N₁₀)是指向珠子。捕捉低聚糖进一步包含一个hexaethylene乙二醇垫片(HEGL)核苷酸和生物素酰化的网站。另一种poly-dA₉垫片是不适合这个应用程序,因为一个不受欢迎的co-selection T-rich寡核苷酸从图书馆,能够杂交捕获的益生元在一个扩展的领域包括poly-dA₉垫片。

以下部分描述详细Capture-SELEX过程及其成功应用选择DNA寡核苷酸适配子的氨基糖苷类抗生素卡那霉素。

3.2。Capture-SELEX的一般程序

Capture-SELEX过程使用BANK-S4 SELEX库建立和优化的一种变体SELEX技术针对性的寡核苷酸适配子的选择。它的特点是捕捉寡核苷酸(SELEX库或选定的寡核苷酸池)磁珠。通过这种方式,目标分子不需要固定,可用于溶解的形式。磁分离技术提供了一个方便的处理和高效分离珠绑定组件与其他组件的解决方案12]。Capture-SELEX策略如图2。开始选择轮Capture-SELEX过程,图书馆的寡核苷酸在第一轮和所选的池在随后的几轮,分别固定在streptavidin-coated磁珠。这些珠子是另外的修改由耦合生物素化的捕获寡核苷酸(图1)。DNA杂交两国合作伙伴在一夜之间孵化结果固定的SELEX库或选定的寡核苷酸池珠子。后来,DNA-bead-complexes孵化两次选择缓冲减少复合物的寡核苷酸的非特定的版本。首先,我们介绍了温度在升高温度,消除unhybridized寡核苷酸或削弱了DNA双螺旋结构。孵化的下一步,背景洗脱步骤,特点是相同的孵化条件(时间和温度),用于下列目标绑定步骤。我们使用这个背景在选择洗脱缓冲来确定数量的寡核苷酸释放引起的复合物的孵化过程。此外,这一步可以很容易地结合负选择一步添加适当的物质选择缓冲区。负选择步骤通常是有用的和推荐的适体的选择不仅避免浓缩是非绑定的寡核苷酸,也直接的选择特定的抗原决定基的寡核苷酸适配子目标,例如,或区分密切相关的目标分子。固定和不同孵化步骤后我们不得不洗DNA-bead-complexes广泛广泛删除的寡核苷酸。在接下来的目标绑定步骤DNA-bead-complexes暴露目标的解决方案。 The target concentration can typically be in the range of 0.1 mM–1 mM. There is the possibility to reduce this concentration during the SELEX process for more stringent selection conditions, which can affect the affinity of the aptamers to be selected. There is also the possibility to use a target mixture (2 or more different target molecules) for a parallel selection of aptamers in one SELEX process. Oligonucleotides with affinity to the target can fold into a specific three-dimensional structure to bind to the target. These oligonucleotides are able to form a stable binding complex and are therefore released from the bead-bound state into solution during the target binding step. The remaining DNA-bead-complexes are separated, and the target-eluted DNA is directly transferred to the following amplification and purification steps of the selected oligonucleotides of one SELEX round. These steps are the same as described for the FluMag-SELEX process [12]。首先选择圆寡核苷酸后用荧光素标记在放大通过PCR使用5′修改底漆(底漆)。这使一个量化的DNA直接荧光检测,从而监控目标绑定浓缩的寡核苷酸。我们使用的比例分数的寡核苷酸筛选了目标分子(目标绑定步骤)相比,通过选择的筛选了缓冲区(背景洗脱步骤)获得的信息适配子选择在每个SELEX一轮进步。第二个修改底漆(反义底漆)是用于PCR反义链引入一个核苷酸的扩展,它允许两股通过变性页面的尺度依赖的分离净化相关的有意义链紧随其后。由此产生的新的寡核苷酸池用于下一个SELEX轮开始streptavidin-coated磁珠固定。许多这样的Capture-SELEX轮(通常10 - 15)是必要的,丰富目标绑定寡核苷酸池(适配子池)。每个SELEX过程以PCR产物的克隆个体寡核苷酸适配子的最后一轮。我们通常选择100适配子克隆的特性通过测序和序列分析。然后执行绑定测试与个别寡核苷酸适配子筛选最好的绑定适配子的候选人,这是选择进一步描述为了得到信息关联,特异性和最小绑定域。

3.3。选择药品使用Capture-SELEX寡核苷酸适配子的过程

总共13轮Capture-SELEX进行如上所述(参阅部分2。5)。常数的四个药品的混合物作为目标1毫米的浓度选择缓冲每个(见部分2。4)。药物的混合物被选为了提高概率找到至少一个绑定序列的目标物质在理论上没有阻碍发展的寡核苷酸适配子在多目标SELEX过程不同的目标(25]。背景洗脱步骤是进行选择缓冲区没有额外的物质,因此没有结合负选择的步骤。有关的问题的一个可能i-ODN2Sp捕捉寡核苷酸和i-ODN4Sp是喜欢,杂交效率进行了测试,确定固定化ssDNA比使用珠子的数量。杂交效率非常相似的两个组件,使用i-ODN2Sp捕捉低聚糖决定。

在第一轮,大约2 nmol ssDNA SELEX图书馆BANK-S4添加到7.9×10⁸streptavidin-coated磁珠修改与捕获寡核苷酸。一笔600 pmol (ssDNA使用的最初决定的区别和ssDNA隔夜后上层清液固定步骤)固定在这些珠子。在接下来的几轮,平均45 pmol pmol(30 - 70)的ssDNA SELEX轮固定在前1×10⁸修改后的珠子。确定一个数量的average-37 pmol pmol(10 - 75)的固定化ssDNA仍在珠子毕竟洗涤步骤以及温度和背景洗脱步骤和目标绑定步骤。目标分子的浓度在300年1毫米μL。因此每个目标的浓度出现在样本期间目标绑定步骤是比固定化ssDNA高出8000倍。因此寡核苷酸的可能性,一旦释放捕获寡核苷酸的珠子的存在具有约束力的合作伙伴,回到捕获寡核苷酸,可以忽略不计。我们可以看到在图3从10轮,增加了大量的筛选了ssDNA在目标绑定步骤暗示寡核苷酸适配子的浓缩过程。的总量目标筛选了ssDNA从大约增加pmol超过8 pmol轮12。第13轮下降到7.4 pmol和表示,SELEX过程结束。大量的寡核苷酸的比值相比目标绑定步骤中筛选了背景洗脱步骤是另一个参数,可以考虑在Capture-SELEX评估进展。首先,当只有少量的具体绑定寡核苷酸溶液中,这个比例应该等于团结为目标绑定和背景洗脱条件是相同的。作为一个成功的寡核苷酸适配子的选择收益和粘结剂的量的增长,该值将会增加。这可以从图得出的结论3,大量的寡核苷酸的比例筛选了在目标绑定步骤相比背景洗脱步骤增加从~ 1 ~ 6。

克隆和转换后选择适配子池,99大肠杆菌克隆进一步检查。其中,96年积极转化株测定,含有质粒DNA是准备插入DNA适体的克隆测序。79年的序列,可以明确地确定(26)根据其序列相似性分成10组和9孤儿(图4)。第一组是最多的成员。它由17 97个核苷酸的序列长(一个删除SELEX过程中发生内部对接序列)。这17个序列不同于另一个只有一个,最多两个,基本交流用黄色标记。此外,在组1有两个长126核苷酸序列。他们显然来自克隆# 3 _7(代表4相同的序列)的这组序列翻倍的5′核苷酸引物结合位点和额外的插入11。

组2的15个成员国(12相同的序列和3序列与单基地交流)更均匀组1组3和10相同的克隆。此外,有一个124个核苷酸序列组3,再次出现在父序列(克隆# 13 _83代表)通过加倍的5′引物结合位点和额外插入的八个基地。组4(6)成员,5(5)成员,6(4)成员,7和8(3)成员,和9和10(2每个成员)或多或少是同构的。但是,没有共识序列可以发现团体之间当使用基于web的工具ClustalW [23]。

组1的序列的积累四两到三个鸟嘌呤的残留物,分别由两个基地之一是显而易见的(出图4)。这给G-quadruplex结构的形成的可能性在寡核苷酸适配子的三维折叠。

提取序列的一个有趣的特性是原始对接序列的变化(TGAGGCTCGATC,印在红色)标志着黄色的图4。在大多数的群体,可以找到原始对接的序列变化,如基本交流,或删除。对接的序列组10尤其显著,相比五核苷酸丢失原始对接序列。

由于Capture-SELEX的设计过程潜在的绑定有必要发生构象变化切换时从双结构与特定目标绑定捕获低聚糖结构。因此,有一种选择压力对对接序列不稳定连接到捕获寡核苷酸。另一方面,对接序列有足够特定杂交必须足够稳定生存目标绑定先例的洗脱步骤一步。这两个要求的平衡可以观察到在我们的选择增加筛选了ssDNA在温度洗脱步骤开始在3 ~ 7 pmol ~ 17轮pmol轮6。这个数字仍然很高(~ 12 pmol)直到它再次下降~ 7 pmol轮12和13(数据没有显示)。此外,它不是惊人的基础交流对接序列导致11例T和2例C·G·不匹配,因为这些是DNA中最稳定的不匹配(28,29日),当然,他们不太强大的比完美匹配。

一个代表(图4,印在红色)每个十组的被选作进一步检查。这十选择合成寡核苷酸适配子,荧光素标记(Microsynth、瑞士),随后由特异性和其中的一些特征关联测试。

3.4。选定的寡核苷酸适配子对卡那霉素的特异性和亲和力

首先,绑定的能力代表的十个适配子群体目标混合物被绑定测试与检查的条件选择轮(SELEX条件,看材料和方法部分)。的十个测试序列,只有6个展出绑定到目标混合物超过负控制的范围(作为一个阈值,洗脱1 pmol ssDNA被选为定义一个序列作为一个绑定序列)。这六个序列被代表组1 (# 3 _7),4 (# 4 _30),6 (# 13 _82),7 (# 3 _18)8 (# 11 _76),9 (# 3 _19)。四种可能的目标物质是用于并行,这是特别必要确定特异性寡核苷酸适配子的测试目标(s)具有约束力。因此物质的四个目标是检查。同时,选择缓冲没有任何目标物质进行了检测,作为一个负控制(图5)。它可以表明,大部分的绑定序列被卡那霉素筛选了只有一个(和所有四个药物的混合物),而序列# 13 _82还显示弱绑定磺胺脲和磺胺甲恶唑。的四个制药、卡那霉素是最亲水和拥有最氨基酸组(见表1),支持静电作用与带负电荷的磷酸骨架的适体DNA和适体和目标之间的氢键的形成。堆积相互作用的芳香环的其他三个药品碱基似乎是次要的。

除了绑定序列,有四组(组2、3、5、10)的寡核苷酸不绑定到的四个目标或混合物。其中两个甚至是强大的团体,许多成员(组2和3)。其原因当然可以Capture-SELEX的设计。虽然有温度和背景洗脱步骤和大量的洗涤步骤,它仍然是有可能的,一些非特异性洗脱步骤发生在目标绑定。然而,特定序列应该最后主导选择过程。因此,它尤其重要Capture-SELEX彻底执行特异性测试为了消除nonbinders从接收到的组序列。

在图5标准偏差(误差)有时会相当大的实验是非常复杂的许多步骤,因此它是不容易获得恒定的绝对数量的筛选了DNA。即使在前离心步骤,珠子还剩余的解决方案与荧光检测阅读影响激发光束的反射。还稍微不同的珠子用于每个准备,即使正常化的珠子固定价值的5×10⁷珠子,增加了错误。然而,这种设计具有约束力的试验被选为最接近SELEX条件和因此产生的寡核苷酸适配子的结合反应的目标是将不受任何影响的变化分析配置。此外,药品仍然可以受雇于solution-preferable为未来的应用开发寡核苷酸适配子在这些药品的检测环境样品和不需要固定的风险和可能失去绑定属性。然而,在未来的考试,不同的绑定试验设计必须进行测试。

为了确定的亲和力一些选定的寡核苷酸适配子卡那霉素溶液中的自由,亲和力测试进行类似于Capture-SELEX过程在材料和方法部分描述。在目标绑定选择适配子在不同浓度卡那霉素,一定数量的fluorescein-labeled适配子被释放从修改streptavidin-coated磁珠捕获寡核苷酸。这些数量然后由荧光检测(图量化6),以及由此产生的数据拟合模型的一个站点直接绑定使用直角双曲线也称为绑定等温线曲线或饱和绑定(OriginLab Corproration, OriginPro 8 g SR2)。方程用于此模型描述平衡结合的配体受体增加配体浓度的函数,和就是平衡离解常数。当目标浓度=一半的结合位点(寡核苷酸适配子)在平衡占领。派生的离解常数,适配子组的代表1,6,8,9在微摩尔的范围(低(# 3 _7 (gr。1): 24μ米,# 13 _82 (gr。6): 5.1μ米,# 11 _76 (gr。8): 9.6μM, # 3 _19 (gr。9): 3.9μ米)。

使用不同的SELEX方法(亲和色谱法与kanamycin-immobilized琼脂糖珠),歌曲et al ., 2011年最近才选择DNA寡核苷酸适配子卡那霉素(27]。他们开始合成ssDNA库90元长度的随机序列40元两侧是两个引物结合位点。卡那霉素是固定化CNBr-activated琼脂糖珠。这些珠子是用于制备的亲和柱卡那霉素绑定寡核苷酸。九轮的选择之后,他们获得了16个人48克隆序列。T-GG-A图案与茎环结构的折叠模式出现在11序列和被认为是绑定寡核苷酸适配子区域。适体的亲和力Kana2卡那霉素固定在磁珠进行了测试,和一个85.6 nM的价值。

为了找到可能的序列相似性,我们检查了十组的代表序列的寡核苷酸中我们发现Capture-SELEX反对那些13序列所示的出版歌曲等。27使用基于web的工具,ClustalW [23]。我们比较事先给定的区域(引物结合序列,在我们的案例中对接序列,分别地。)和随机区域。最高的similarity-especially随机区显示一条序列(序列# 3 _18 (gr。7)及其Kana18)。然而,没有发现共识序列之间被确定为绑定地区歌等人,我们的序列(图7)。因此,一个不同的主题必须假设在我们的案例中有约束力。实验为了找到绑定区域在我们选定的寡核苷酸适配子将效仿。

3.5。适体试验开发基于Capture-SELEX原理

寡核苷酸适配子的分析应用程序经常需要一些post-SELEX修改。典型的官能团的附件修改,例如,固定的寡核苷酸适配子在传感器表面,附件的记者分子监测aptamer-target绑定,序列的改变,或它们的组合。不同的策略已经发达转导aptamer-target交互为可记录的信号(30.- - - - - -33]。然而,这样的修改可能的风险损失的亲和力和特异性寡核苷酸适配子目标。为了规避这一问题,一些替代方法的直接选择fluorescence-signaling寡核苷酸适配子已经被描述13,34- - - - - -36]。这些在体外选择过程的特点是将信号组件,如记者分子荧光技术检测特殊序列,或额外的寡核苷酸,所以大post-SELEX修改是可以避免的。

Capture-SELEX原则,描述了本文还提供了开发基于双检测化验的可能性之间形成对接选中的适配子序列和捕捉低聚糖。依赖于目标的构象变化导致释放双重构造的适配子与捕捉低聚糖。这个开关从杂化dehybridized阶段的适配子可以用来生成一个可记录的信号。图8显示了一个潜在的战略分析开发基于荧光测定术使用众所周知的方法如荧光强度的变化,荧光共振能量转移(FRET),分子信标或荧光偏振(FP)。所示的策略数据8(一)和8(b)使aptamer-target复合物的直接检测。适体标记,荧光团,因此绑定后复杂的形成直接的目标可以测量荧光检测。策略数据8(c)和8(d)的特点是aptamer-target复合物的间接检测。这意味着适体标记,而捕获益生元标签与一个或两个荧光团。后添加目标的适体释放的双重构造引起的变化的捕捉低聚糖荧光行为的捕获益生元,可以探测到,而不是aptamer-target复杂。图8(一)代表Capture-SELEX过程中使用的相同的策略。我们应用此分析筛查策略最好绑定适配子候选人克隆和测序后选择适配子池和特异性和亲和力测试(见部分3.4)。所有其他分析策略都是基于不同的修改主要是捕捉寡核苷酸(附加的荧光分子和记者序列改变)。数据8(c)和8(d)显示策略aptamer-target复合物的检测没有任何修饰的寡核苷酸适配子。我们未来的工作旨在发展一个适配子试验对卡那霉素使用策略进行了描述。

4所示。结论

的一种特殊变体SELEX技术,Capture-SELEX过程,建立了DNA寡核苷酸适配子的选择对于那些目标,不能固定在固体表面上,例如,有机小分子的目标。但绑定伙伴之一的固定是一个非常重要的和方便的方法,使一个有效的分离目标绑定和不具约束力的寡核苷酸适配子期间选择过程。因此,部分随机DNA库定义了一个对接区域内随机序列被设计用在磁珠捕获寡核苷酸杂交。通过这种方式,图书馆的寡核苷酸可以固定的目标分子。洗一个广泛的DNA-bead-complexes建议删除所有unhybridized DNA分子。此外,两个特殊的洗脱步骤使用最小化目标绑定前一步的寡核苷酸释放是非的珠子,例如,由于不正确的双形成或由机械力量。评估进展的选择在每个SELEX轮,背景之间的直接比较洗脱步骤和目标绑定步骤。的寡核苷酸筛选了的目标应该大大超过背景洗脱和应进一步增加(直到达到最高级别)Capture-SELEX过程中。DNA的荧光素标记为量化服务在不同的SELEX分数每个SELEX轮(从第二轮)荧光检测。

Capture-SELEX过程非常灵活的配置。背景洗脱步骤可以很容易地加上一个负面的或者counterselection一步为了影响特异性寡核苷酸适配子的选择。除了单一目标物质,Capture-SELEX过程适用于目标混合物含有两个或两个以上的不同物质的并行选择不同的有针对性的寡核苷酸适配子。此外,Capture-SELEX原则是同样对其他类的目标分子的吸引力,如多糖、多肽或蛋白质。

的成功应用Capture-SELEX kanamycinA DNA寡核苷酸适配子的选择过程是证明,和离解常数测定。接收的寡核苷酸适配子更精确的检查,结合特异性对其他氨基糖苷类抗生素,是必须解决的问题。这是在调查后发布的为准。

Capture-SELEX原则还提供了可能性发展荧光技术检测化验没有大量额外的修改所选的寡核苷酸适配子。寡核苷酸的开关之间的双重构造(捕捉寡核苷酸)和aptamer-target复杂的目标分子可以用来生成一个可测量的信号。因此,未来的工作将针对敏感检测卡那霉素的测定发展基于选定的寡核苷酸适配子的特殊结构特点,部分中描述3.5。

确认

这项工作是支持的德国工业研究协会联合会(AiF)资助项目的上下文支持创新II (KF 011004 da6)和由联邦教育部和研究,德国(BMBF)在计划的一半(01 rb0805b)。作者感谢他们的同事安雅Prange,船底座弗洛德Looß,Christine Reinemann技术援助和讨论。

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