高效液相色谱法测定Isoliquiritin Apioside和Isoliquiritin后大鼠血浆药代动力学研究中应用口服Zhigancao提取物

文摘

一个敏感的高效液相色谱定量测定的方法开发isoliquiritin apioside(马尼拉)和isoliquiritin (IL)在大鼠血浆。与乙腈沉淀蛋白质后,氯仿是用于分离脂溶性杂质的血浆样品和去除乙腈。色谱法是进行Diamonsil C18 (mm;5μ米)分析柱,用流动相组成的水(含有磷酸0.1%,v / v);乙腈(72:28 v / v)在1.0毫升/分钟的流量。wavelength-switching技术来确定执行伊拉和IL 360海里和汉黄芩甙在276 nm(内部标准)。伊拉和IL相当的校准曲线线性浓度范围0.060 - -3.84μ克/毫升(),0.075 - -4.80μ克/毫升(),分别。马尼拉的平均提取复苏,IL,都超过了80%。的精密度和准确度的质量控制和标准浓度在15%。量化的下限(LLOQ)是0.060μ对马尼拉和0.075 g / mLμg / mL。该方法用于药代动力学研究口服Zhigancao提取物后老鼠。

1。介绍

Zhigancao、中药Praeparata cum Melle Glycyrrhizae来源于加工干根或根状茎Glycyrrhriza解费,g . inflata蝙蝠。,或g . glabral .(家庭蝶形花科)。最常用的中国传统医学规定协调所有的药物和解毒中药的副作用。临床,治疗疾病,如呼吸短促,疲劳,epigastria和腹部疼痛,肌肉骨骼和平滑肌痉挛和疼痛,腹泻(1]。由于众多生物活性化合物如萜类化合物,皂苷、多糖和黄酮类化合物,Zhigancao,据报道具有抗炎活动(2,抗氧化3,4),神经保护(5,抗过敏药6),抗惊厥的活动(7),等等。两个查耳酮衍生品在图1,isoliquiritin apioside(马尼拉)和isoliquiritin (IL),选择Zhigancao中的重要成分,研究其药物动力学。伊拉显示药理作用减少氧化应激基因毒性(8]。和IL已经表现出了各种药理作用,如抗血管新生的影响取决于antitube形成(9),抗抑郁效应引起的小鼠强迫游泳和尾部[10)和酪氨酸酶的抑制作用11]。

(一)

(b)

药物的生物利用度的基石是扩展人类体内体外的生物功能。类黄酮苷显示广泛的口服生物利用度低可能是因为接合的自由羟基12- - - - - -14)或/和苷水解苷配基在肠道内腔(14- - - - - -16]。伊拉和IL的药代动力学研究是至关重要的对我们理解两个分析物的生物利用度在口服Zhigancao extrat。

据我所知,伊拉和IL量化方法(质/ MS)已经完成研究药物动力学的多个甘草黄酮口服剂量的Xiaochaihu-tang后大鼠(17),但质/ MS方法在大多数实验室是不可得到的。在这项研究中,我们建立了高效液相色谱法同时量化非常挑剔和敏感的马尼拉,在大鼠血浆IL。方法被用来探索可能的药物动力学伊拉和IL后口服Zhigancao提取物。

2。实验

2.1。试剂和化学物质

Isoliquiritin apioside(马尼拉)和Isoliquiritin (IL)从西安购买Xiaocao植物开发有限公司有限公司(纯度> 98%,山西、中国)。汉黄芩甙(内部标准)是获得国家食品和药物控制研究所(中国,北京)。Zhigancao是在中医理论的指导下科学是由忻州赤峰市中药有限公司有限公司(内蒙古,中国)。材料验证的干燥根g .解Ting-guo康教授从辽宁中医药大学。高效液相色谱年级乙腈和分析年级氯仿从山东购买的村支书化工有限公司有限公司(山东、中国)。研究中的水从微孔净化Milli-Q净水系统(美国贝德福德)。

2.2。Zhigancao提取物的制备

粉草材料与70%乙醇提取两次回流条件下(1:10 w / v) 1 h在100°C。提取过滤和蒸发。最后,残留在真空干燥箱干燥60°C到获得Zhigancao提取的粉末状态。伊拉和IL提取的内容被高效液相色谱检测,分别为33.72和28.17毫克/克。干粉末是存储在真空干燥机使用前。

2.3。液相色谱条件

使用安捷伦1100液相色谱系统具有可变波长紫外检测器(血管性血友病G1314A)。数据被MassHunter分析软件(美国安捷伦)。使用的分析柱是Diamonsil C18(150×4.6毫米身份证,5μm, Dikma技术,中国)分析柱与结束描述C18 ODS警卫队列。水的流动相组成(含磷酸0.1%,v / v)和乙腈(72:28日,v / v)是0.22过滤μ微孔膜过滤器。流量为1.0毫升/分钟。检测波长被设定为360 nm(0 - 9分钟)和276海里(9 - 12分钟)。注射量20μL为最终的方法进行优化。

2.4。标准溶液的制备和质量控制样品

股票的解决方案是,伊拉和IL浓度的440年,384年和480年μg / mL,分别在甲醇,储存在4°C。工作的解决方案是用甲醇稀释最终浓度为8.80μ克/毫升。股票的解决方案与甲醇稀释系列标准工作溶液浓度为0.60,1.20,2.40,4.80,9.60,19.2和38.4μg / mL伊拉,0.75,1.50,3.00,6.00,12.0,24.0,36.0和48.0μg / mL。这些解决方案被添加到空白血浆(1:10)0.060 - -3.84的标准μ伊拉-4.80和0.075 g / mLμg / mL。质量控制(QC)样品是用于内部和inter-day精度,精度,提取复苏和稳定性研究,准备以同样的方式为0.12,0.48和3.07μ马尼拉的g / mL, 0.15, 0.60和3.84μg / mL。

2.5。样本的准备工作

200年μ20 L的大鼠血浆混合μL是工作的解决方案。与500年后蛋白质沉淀μL的乙腈1.5毫升聚丙烯管涡流3分钟,样品在6677 g离心5分钟。上层清液转移到2.0毫升管,与1000年了μL(氯仿。涡流和离心后,20μL注入的水相进行分析。

2.6。方法验证

分析方法完全使用大鼠血浆样品验证,包括选择性、线性、内部inter-day精度,精度和稳定性,根据FDA指南方法验证分析化验的18]。

证明了该方法的选择性比较空白血浆样品的色谱图(没有)从老鼠,获得与分析物,血浆样品飙升,口服剂量后血浆样品。所有空白血浆样本准备和分析,以确保没有干扰峰。

方法的线性评估通过绘制校准曲线在等离子体7个浓度水平一式三份连续三天。量化的下限(LLOQ)被定义为最低浓度的校准曲线,通过分析样本,测量准确度和精密度在六个复制0.060的浓度μ对马尼拉和0.075 g / mLμg / mL。

精密度和准确度进行评估通过确定QC样品三个浓度在六个复制在同一天(盘中准确度和精密度)和连续三天(inter-day准确性和精度)。精度测量的相对误差(RE)和精度是由内部评估和inter-day相对标准偏差(RSD)。

提取复苏评估通过比较提取的QC样品的峰面积三个浓度在六个复制与unextracted标准100%恢复。同样,复苏是评估在一个浓度为0.88μ克/毫升以同样的方式。

马尼拉的稳定性和在大鼠血浆IL评估通过比较均值back-calculated存储QC样品的浓度在一式三份,三个浓度上升分析物的浓度。QC样品作为样品制备在室温下保持12 h,然后稳定的决心。冻融稳定性决定afterthree冻结(-20°C, 24 h)和解冻(室温)周期。长期稳定评估通过保持QC样品15天的-20°C。

2.7。应用程序在药代动力学研究

2.7.1。样品收集

女性Sprague-Dawley老鼠(g)在环境控制育种室7天直到实验。老鼠禁食12小时但允许水随意Zhigancao提取之前口头管理在一个剂量的1.21克/公斤。轨道静脉血样收集(0.5毫升)剂量之前,在0.5,1.0,1.5,2,3,4,6,8,12日,24日,36岁,48 h后管理。在6677 g离心法5分钟后,血浆样本和冻结在-20°C,直到分析获得。

2.7.2。药代动力学分析

高效液相色谱法分析程序应用于分析血浆浓度时间的伊拉和IL。数据处理noncompartmental方法使用药物和统计(DAS) 2.0软件包(中国药理学会、上海、中国)。

3所示。结果

3.1。方法验证

选择性是评估通过分析空白样品,上升在LLOQ样品,和中间质量控制水平,和实际样品从大鼠口服Zhigancao提取物后获得。典型的高效液相色谱色谱图如图2。所有空白样品,伊拉、IL和保留windows是免费的从内源性干扰峰。没有观察到等离子体基体效应条件下。

(一)

(b)

(c)

(d)

图2

μ μ μ μ μ μ 典型的高效液相色谱的色谱分析物在大鼠血浆(1、马尼拉;2、IL;3)。(一)色谱空白血浆;(b)的血浆样品色谱LLOQ (ILA 0.060水平0.075g / mL和ILg / mL);(c)血浆样品的色谱图中间质量控制(ILA 0.48水平0.60 g / mL和ILg / mL);(d)血浆样品的色谱图从鼠(2号)在1 h后口服Zhigancao提取物(ILA 0.781.04g / mL和IL通过计算g / mL)。

校正曲线的线性浓度范围的0.060 - -3.84μ伊拉-4.80和0.075 g / mLμ为投资贷款加权(克/毫升)线性最小二乘回归方法。校准曲线的相关系数值超过0.995。REs back-calculated值的标准从他们的名义值不断为所有值在15%以内,包括LLOQ。LLOQ测量显示各自的平均值0.060μILA和0.077 g / mL, RSD为14.5%μg / mL, RSD为12.3%。典型的色谱在LLOQ如图2 (b)。ILA,典型的回归方程计算如下:();伊尔,()。

精密度和准确度的数据表所示1。内部和inter-day RSD值低于10%,和的值在±5%。结果显示满意这个礼物方法的精密度和准确度。


被分析物	浓度上升	测量浓度	盘中()		测量浓度	Interday ()
被分析物	(μg / mL)	(μg / mL)	相对标准偏差(%)	再保险(%)	(μg / mL)	相对标准偏差(%)	再保险(%)

伊拉	0.12	0.12±0.01	6.2	−3.6	0.12±0.01	9.0	0.4
	0.48	0.46±0.02	5.6	−3.4	0.48±0.03	7.0	−0.8
	3.07	3.08±0.16	5.4	0.2	3.02±0.16	4.8	0.7

伊尔	0.15	0.15±0.01	5.9	1.4	0.15±0.01	9.7	−2.3
	0.6	0.62±0.03	6.8	3所示。1	0.61±0.04	6.8	1.0
	3.84	3.78±0.24	5.0	−1.7	3.73±0.18	3所示。5	−2.7

(Inter-day)相对标准偏差(Inter-day)所取代。

马尼拉的提取复苏,从大鼠血浆IL%,%,%为1.2,4.8和3.07μ克/毫升,%,%,%为1.5,6.0和3.84μ分别g / mL。提取的复苏%。这些结果表明,萃取法是适合提取伊拉,IL,从等离子体。

所有稳定性测试显示足够的伊拉和IL在各种测试条件下的稳定。如表所示2分析物的稳定显示,没有明显的样品损失超过12 h在室温下,三个冻融循环,15天的存储条件。


被分析物	浓度上升 (μg / mL)	储存在室温下12 h		三个冻融稳定性		储存在−20°C 15天
被分析物	浓度上升 (μg / mL)	测量浓度(μg / mL)	再保险(%)	测量浓度(μg / mL)	再保险(%)	测量浓度(μg / mL)	再保险(%)

伊拉	0.12	0.12±0.001	2。7	0.12±0.003	−0.5	0.12±0.002	−0.5
	0.48	0.48±0.008	−3.6	0.45±0.018	−5.6	0.48±0.002	0.07
	3.07	3.07±0.028	0.03	2.91±0.029	−5.2	2.97±0.006	−3.2

伊尔	0.15	0.16±0.005	4.3	0.16±0.006	3所示。9	0.15±0.004	−2.6
	0.6	0.59±0.015	−1.1	0.62±0.019	2。7	0.57±0.010	−4.4
	3.84	3.82±0.065	−0.4	3.85±0.077	0.19	3.72±0.157	−3.2

3.2。药代动力学研究

马尼拉的开发方法应用于药代动力学研究和在大鼠血浆IL口服Zhigancao提取物(在剂量含有40.8毫克/公斤伊拉和34.1毫克/公斤,职责)。平均血浆浓度时间配置文件()如图3。表中所示的药代动力学参数3。的分析足够敏感的决心伊拉和在大鼠血浆IL口服Zhigancao提取物。


参数	伊拉	伊尔

(μg / mL)	0.88±0.34	1.45±0.47
(h)	2.08±2.11	1.92±2.06
(h)	8.12±1.72	8.56±1.17
(μg / mL * h)	8.93±3.06	15.39±3.91
(μg / mL * h)	9.49±3.35	16.20±4.23
(h)	11.17±2.72	11.53±1.66
(h)	12.27±4.35	13.20±2.34

表3

马尼拉的药代动力学参数和IL后口服Zhigancao提取物。的是马尼拉的测量最大浓度和IL,和是马尼拉的时间达到最大浓度和IL,获得直接从观测值。等离子体浓度在终端阶段为每个主题都适合的对数线性最小二乘法得到消除速率常数()。的价值是用以下公式计算:= ln (2) /。的值曲线下的面积从0到36 h(使用线性梯形积分法计算)值的计算使用公式:+/,在那里是最后一个可测量的浓度。平均停留时间(捷运)从公式获得AUMC / AUC(×时间浓度曲线下AUMC-area)使用公式计算:。

4所示。讨论

在这项研究中,我们建立了高效液相色谱法同时量化伊拉,在大鼠血浆IL。由于ILA和IL的强极性,蛋白质沉淀是用于从生物矩阵分析物的提取19]。乙腈和甲醇作为蛋白质沉淀剂进行测试。经济复苏与甲醇和乙腈,等离子体的两个过程中分析物的浓度稀释有机溶剂体积增加了2.5倍,马尼拉和低浓度IL无法被检测到。然而蒸发浮在表面的干燥,然后溶解在少量的溶剂浓度增加将耗时,会导致分析物的损失。所以把有机溶剂从上层清液使用。上层清液时添加与氯仿、清水阶段可以通过与乙腈沉淀蛋白,但没有分层可以观察到当甲醇代替乙腈因此,血浆样本处理与乙腈沉淀蛋白,然后用氯仿去除。

汉黄芩甙被选为是由于其适当的保留和提取复苏。其他一些化合物如芦丁、黄芩苷和橙皮素也测试了上面的选择条件,但没有理想的结果。由于其满意的分析物的分离,汉黄芩甙被选为是。因为汉黄芩甙是永远0.88浓度检测到360海里μg / mL,波长切换到276海里在9分钟。

外推AUC的一部分_{0 -∞}仅占5 - 6%,这表明ILA和IL药代动力学分析方法的适用性研究。这两个分析物表现出一致的倾向在血浆浓度时间配置文件和类似的,和捷运值后口服Zhigancao提取物。事实上,这两个化合物有类似的药代动力学行为可能暂时归因于他们有类似的结构。

ILA与药代动力学数据的比较,和AUC的伊拉低于IL虽然在Zhigancao提取前的更多内容。可以水解,伊拉的IL肠道或被吸收后转化成IL。

5。结论

我们已经开发和验证一个选择性和敏感的高效液相色谱方法,同时量化伊拉,在大鼠血浆IL。该方法成功地应用到马尼拉的药代动力学研究和在大鼠血浆IL口服Zhigancao提取物。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢辽宁中医药大学(没有。YXRC0920)和辽宁科技部门(没有。20111133)支持这项研究。

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