高性能液相色谱法:化学发光方法潜在的决心伐地那非的膳食补充剂

文摘

流的方法高效液相色谱分离和化学发光(CL)检测敏感伐地那非分析膳食补充剂。伐地那非分离实现了C18柱30^∘C使用ethanol-H₃阿宝₄和乙二胺四乙酸二钠盐(Na₂EDTA)水溶液(25:75 v / v %)为流动相。之后连续CL检测进行了基于CL增强强劲luminol-K伐地那非的存在₃铁(CN)₆反应在碱性介质。在0.8毫升/分钟的流量,伐地那非保留时间()是6.4分钟。因素影响了高效液相色谱分辨率和CL检测进行了研究和优化。伐地那非标准获得的校准曲线是线性的浓度范围mol / L。盘中的相对标准偏差(RSD)和interday精度小于3.5%。该方法应用于口服液的伐地那非的决心,酒,胶囊样品。

1。介绍

膳食补充剂是一个产品,其中包含一个用来补充饮食的“营养成分”。一般来说,男性的性能力的天然膳食补充剂由不同的草药提取物如人参根、荔枝核、枸杞子、龙眼肉、冬虫夏草。这些膳食补充剂可以提高男性性能力不会造成危险,即使发生过量(1]。最近,化学合成phosphodiesterase-5 (PDE-5)抑制剂已被用于改善勃起功能障碍(ED),使用最普遍的是盐酸伐地那非(艾力达),2 - [2-ethoxy-5 - (4-ethyl-piperazine-1-sulfonyl)苯基]5-methyl-7-propyl-3h-imidazo[5,行进]- [1、2、4]triazin-4-one monohydrochloride,三水(图1)。伐地那非,经美国食品和药物管理局(FDA)在2003年,是一个新的口服,强有力的、高度选择性phosphodiesterase-5 (PDE5抑制剂)销售的改善艾德在人2]。研究表明,剂量的伐地那非(10-40毫克)口服后迅速吸收,达到最大血浆浓度在一些男人在15分钟内3]。然而,事实证明,伐地那非构成严重的健康风险(4),如头痛(5)、低血压(6),冲洗、消化不良和鼻塞或鼻炎7]。因此,伐地那非只能依法取得医生的处方。然而,一些非法经销商伐地那非添加到膳食补充剂产品为了利润。为质量控制和健康安全的目的,建立敏感和有选择性的方法来检测非法伐地那非添加膳食补充剂是必要的。

如文献所示,几种方法已经报道了伐地那非在膳食补充剂,如质和gc - ms测定方法(8],LC-ESI-MS方法[1,4],LC-ESI-MS / MS方法[9],MRM-ESI-MS-MS方法[10),FTICRMS方法(11]。注意到所有这些方法开发基于MS检测。女士提供了敏感和可靠的结果,但它也意味着高度复杂的仪器,小心的控制条件和运营成本相对较高。更重要的是,女士在大多数实验室不可访问。因此,简单,自动化和更便宜的方法仍然是必要的。

采取简单的优点完美的多功能性和射流操纵、流动注射(FI)已经取得了极大的成功开发的自动化分析。FI的整合和高效液相色谱法(HPLC)也显示复杂样品分析的能力。化学发光(CL)检测是一个高度敏感的分析技术。CL-based技术作为高效液相色谱的检测手段近年来引起了分析师的兴趣(12,13),尽管CL检测不是普遍的荧光检测或紫外可见检测,更有选择性的更少的干扰物种中观察到色谱(14)和敏感的大型CL信噪比(S / N)和线性工作范围广12]。高效液相色谱相结合的高分辨率,CL敏感检测和FI操作将一个似是而非的一个敏感的技术,精确,并简单化合物的测定微量物质的复杂混合物13]。最近的研究证人快速进展HPLC-CL方法,它被广泛用于执行不同的定性和定量分析问题(15- - - - - -18]。

我们的实验表明,在碱性介质luminal-K的CL₃铁(CN)₆可以大大提高跟踪伐地那非的存在。基于以上现象,伐地那非自动化HPLC-CL方法测定膳食补充剂的开发。各种实验建立的最佳分析条件。该方法表现出的优势的自动化操作,分析吞吐量高,仪器简单,线性范围宽,reagent-saving用于口服液,酒,和胶囊样品分析。

2。实验

2.1。试剂和化学物质

乙醇和甲醇的高效液相色谱法。分析试剂级的所有其他试剂,除非特别说明,和去离子的双重蒸馏水中使用。盐酸伐地那非三水(纯度99.6%)从Qiyu购买生物有限公司有限公司(西安,中国)。鲁米诺是来自Kangpei科技公司(西安,中国)。其他试剂包括K₃铁(CN)₆H₃阿宝₄乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA),氢氧化钠由西安化学试剂厂(西安,中国)。

伐地那非股票的解决方案(mol / L)是由乙醇和存储在冰箱−20°C。标准系列mol / L准备每天按顺序与流动相稀释股票的解决方案的解决方案。一个mol / L K₃铁(CN)₆股票的解决方案是由溶解164.6毫克的K₃铁(CN)₆在50毫升水,防止光和存储在冰箱4°C。一个mol / L原液的鲁米诺准备0.1 mol / L氢氧化钠溶液。此外,这些股票的解决方案是reprepared每一个月。

的流动相组成的乙醇,水溶液中含有mol / L H₃阿宝₄和mol / L Na₂EDTA (25: 75 v / v %)。流动相是0.45过滤μ米的聚四氟乙烯(PTFE)微孔膜和超声波浴使用前进一步脱气。

2.2。样品制备

健康食物样本包括一个中药口服液,一个草药药酒,和一个草药胶囊能够增强男性性能力声称是掺假的嫌疑,从当地的药店购买,市场。口服液和葡萄酒的一部分样本,分别与流动相溶液稀释10倍,透过一个0.45μm聚四氟乙烯膜滤器(上海新雅净化器设备工厂,上海,中国),最后脱气前使用。胶囊样品制备、三胶囊内容被清空,充分混合。粉胶囊重量被转移到一个50毫升烧杯,与10毫升移动和旋转地提取阶段解决方案1 h。部分提取的解决方案是透过0.45μm聚四氟乙烯膜过滤和用流动相稀释溶液进行进一步分析。

2.3。设备和程序

如图2,HPLC-CL实验装置由一个氯分析仪(西安飞羽分析仪器有限公司,西安,中国)配备了滨松R456 PMT(日本东京)和负高压发生器(NHV),平面螺旋透明聚四氟乙烯流细胞,1.8 mL / min恒定流量CL泵(上海仪表电机工厂,上海,中国),一个LC-10AT液相色谱(日本岛津公司、东京、日本)配备Rheodyne 7725我syringe-loading取样阀(20μL-loop,加利福尼亚州,美国),水域C18柱(证件:毫米,粒子大小:5μ美国m)和dt - 230 a柱温箱(天津Do-Chrom科技有限公司、天津、中国)。流动相流速是设定在0.8 mL / min。C18柱温度控制在30°C。

使用描述了实验装置,高效液相色谱泵和CL泵启动。流一个包含mol / L鲁米诺,mol / L Na₂EDTA和1.0 mol / L b含有氢氧化钠和流mol / L K₃铁(CN)₆由氯泵在T1合并。然后,试剂混合物在T2与流动相合并,生成一个稳定的CL基线。随后,当取样阀改用注射位置,20μL标准或样品注入流动相。流出伐地那非与试剂混合反应,生成增强CL信号流中的细胞。CL信号被记录作为时间的函数和CL强度PMT的飞羽分析仪操作−400 V。微机配备飞羽软件下运行Windows XP是用于数据处理。伐地那非峰鉴别是由标准添加法和保留时间(伐地那非)。峰高,(,在那里CL的基线,伐地那非的峰值CL)是用来量化伐地那非内容通过相关的校准方程。

3所示。结果与讨论

3.1。CL反应选择

伐地那非CL的决心,我们考虑几个已知的CL反应包括碱性luminol-H₂O₂、碱性luminol-K₃铁(CN)₆、碱性luminol-KIO₄、酸性KMnO₄、酸性KMnO₄一氧化碳、酸性KMnO₄na₂所以₄,NaClO-NaOH。为了防止可能的金属离子干扰,mol / L Na₂EDTA在所有使用鲁米诺反应有关。实验结果表明,碱性luminol-K₃铁(CN)₆反应了最强的CL回应mol / L伐地那非存在。因此,碱性luminol-K₃铁(CN)₆CL反应被选为后续调查。

3.2。动力学曲线

碱性luminol-K的动力学曲线₃铁(CN)₆伐地那非氯反应与静态注射方法进行了研究。碱性鲁米那和K₃铁(CN)₆溶液混合在烧杯放置在前面的PMT窗口。获得一个稳定的基线后,1.0毫升mol / L伐地那非标准是由一个注射器注入到烧杯。动力学曲线记录作为时间的函数和CL强度,和它可以得出结论,伐地那非极大地增强了luminol-K₃铁(CN)₆CL, 1.5秒内达到最大。因此,研究氯反应是一个快速反应。因此,T2被尽可能接近黑盒内的流动单元,如图2。

3.3。HPLC-CL系统的优化

获得HPLC-CL描述的敏感和快速伐地那非检测系统,进行了一系列的实验来建立最佳的分析性能。mol / L伐地那非标准被用于所有优化实验。鲁米诺和流动相溶液中mol / L Na₂EDTA。鲁米诺和K₃铁(CN)₆流率控制在1.8 mL / min,分别。实验选择最佳分析表演是基于最大的CL S / N值和平均三个注射为每个测试时,相对标准偏差(RSD)的每个测试点都不到5.0%,除非另有指定。

3.4。高效液相色谱法的优化

HPLC-CL分析,流动相,不仅适用于复杂伐地那非分离矩阵也兼容CL检测。Acetonitrile-acidic水缓冲(1,4,11,19和methanol-acidic水缓冲8,20.)是最常用的移动阶段伐地那非C18柱上分离。在调查与氯乙腈的兼容性检测,发现乙腈带来很高的CL背景。伐地那非高背景违背了敏感检测。类似的实验表明,甲醇和乙醇的使用时,相对较低的CL背景和能获得平滑的基线。因此,甲醇和乙醇的选择构成了移动后研究阶段。

有机相的体积百分比的影响(v / v %,有机相体积/有机+水相体积),S / N值和列压力(P),研究的范围40% - -60%甲醇和乙醇,20% - -30%。观察实验结果列在表中1,可以得出结论,v / v %,越高越短,30%乙醇贡献最大的S / N值。然而,30%的乙醇也相对较高造成的P。于是,作为妥协在S / N值越大,短和适当的P在后续实验中,25%的乙醇被选中。

许多有机或无机酸被用来构成流动相来提高伐地那非分离(1,4,8,11,19,20.]。众所周知,所选的CL反应是一个oxidative-reductive反应。考虑到有机酸和CL之间可能的反应试剂、无机酸被认为是更适合CL检测。实验表明,H₃阿宝₄可以有效地抑制peak-tailing,一个相对狭窄的和对称的色谱峰可以实现(图3)。更重要的是,正如所料,被缩短。对获得最大的CL S / N值,最优H₃阿宝₄集中研究了通过不同浓度的范围mol / L。实验表明,与H S / N值增加₃阿宝₄浓度增加。当H₃阿宝₄浓度是mol / L,流动相的pH值约为2.0,最大的S / N值。根据列供应商的建议,H₃阿宝₄浓度高于mol / L没有测试。作为一个结果,mol / L H₃阿宝₄被雇佣为最佳浓度。

可以看到实验结果总结表2,通过改变流量从0.3到0.9毫升/分钟,流动相流速的影响在CL检测进行了研究。结果表明,流动相流速越高,越短越高P。最后,0.8毫升/分钟的流量被选作为妥协之间最大的S / N值和相对短。

3.5。CL优化

众所周知,碱性介质luminal-K是必要的₃铁(CN)₆的反应。在我们的实验中,氢氧化钠是选择构成了碱性反应介质。氢氧化钠浓度的影响在CL检测是检查的范围0.2 ~ 1.3 mol / L。实验表明,S / N值增加随着氢氧化钠浓度增加,能找到一个平当氢氧化钠浓度高于1.0 mol / L。后继实验使用1.0 mol / L氢氧化钠。

鲁米诺浓度的影响在CL检测评估的范围mol / L。发现S / N值增加与鲁米诺浓度增加,达到最大值mol / L,而S / N值下降进一步鲁米诺浓度增加。因此,mol / L鲁米诺浓度被选中。

CL的氧化剂反应,K₃铁(CN)₆直接影响了CL信号。K的影响₃铁(CN)₆浓度对CL检测评估的范围mol / L。发现S / N和K值增加₃铁(CN)₆浓度增加的范围mol / L。高K₃铁(CN)₆浓度导致减少的S / N值。根据以上结果,mol / L K₃铁(CN)₆被选中。

3.6。分析特点

一系列的标准解决方案(mol / L)是用来确定绩效最优条件下的分析数据。实验表明,伐地那非浓度(C)是线性的mol / L的回归方程= 3.17C+ 9.91 (C:10⁻⁶mol / L,n= 5,r= 0.9980)和检出限mol / L (3σ)。再现性是通过注入调查mol / L伐地那非标准为11倍,证明了RSD。结果表明,RSD为3.6%。盘中、inter-day精度的描述方法进行使用口服液样本飙升mol / L标准。盘中精度定义为为5次,决定在一天相同的样本,5注射一次,不到3.5%。inter-day精度定义为为五天,决定到相同的样本,5注射一天,不到2.3%。得出结论,描述HPLC-CL方法相对较好的精度。

3.7。应用程序

在实验部分中详细描述的过程后,提出HPLC-CL方法应用于确定伐地那非口服液,酒,胶囊样品。最初,伐地那非标准上升色谱的口服液,酒,胶囊是如图4。它可以看到从图4伐地那非不是在所有三个样品,没有发现从内源性物质的干扰伐地那非。注意到伐地那非为6.4分钟,比要短得多查阅相关文献报道(1,4,8,9,11,19]。这短也隐含了时间和流动相储蓄。

评估的适用性提出HPLC-CL方法确定口服液的伐地那非,酒,和胶囊,恢复实验进行。这些实验是由水平飙升3伐地那非内容口服液和葡萄酒和添加相同水平的伐地那非内容胶囊如表所示3。经济复苏百分比的估计是通过比较上升和样品的浓度检测标称浓度补充道。从实验结果总结表3,得出该方法提供良好的精密度和准确度,当应用于口服液,酒,胶囊样品。

4所示。结论

我们实施了自动化HPLC-CL方法在口服液伐地那非的决心,酒,胶囊样品。根据获得的实验结果,可以得到以下的结论。新的流动相是由25%的乙醇和75%的水被发现无毒,环境友好,与碱性luminol-K兼容₃铁(CN)₆CL检测。短贡献了高储蓄分析吞吐量和试剂。相对较好的精度,精度得到预期。检测极限是可以接受和线性校准范围宽。此外,CL探测器很便宜,简单,不需要复杂的技术。一句话,我们建议的方法也可以作为一个替代方法,伐地那非的膳食补充剂。

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