一种快速光学方法，用于测定微孔板中的液体水平

摘要

平行液体处理系统广泛应用于生命科学的不同应用领域。为了避免由于重复实验而导致的假阳性或阴性结果导致更高的成本，有必要监控液体输送的过程和成功。建立了一种简便的测定微孔板液位的方法，并进行了评价。光学方法是利用CCD相机测量液位，然后通过特殊算法对测量数据进行评估和可视化。在两种不同液体的环境照明条件下对该方法进行了测试。这些测试证实了我们对微板中最小体积的光学液位测定方法，也显示了环境照明和流体不同物理特性方面的挑战。

1.导言

昂贵且耗时的过程强迫研究行业的效率提高;这以及越来越多的文档需求，介绍了丢失机器人操作盲的问题。操作员提供系统的试剂和物质与预编程的程序一起使用，在实验结束时留下了价值测量形式的结果 - 当识别异常值的根本原因是困难和纠正措施不再可能。

因此，引入移液监测系统来监测个别处理程序可能是有意义的。移液问题在极小样本需要移液的地方尤其普遍[1］.本文介绍的移液监测系统是一种价格低廉、快速且节省空间的解决方案，可用于检测井中极少量的液体。然后将监测结果添加到文件中或反馈到控制系统中，以初始化重复移液程序。

液体填充水平的检测在许多工业领域中起着重要的作用，因此许多确定填充水平的方法被开发出来，并在不同的应用领域被报道。称重，在血管底部的压力测量，和超声波是一些测量原理已经被使用的例子[2那3.]，而光学方法也被大量应用，例如，在需要无接触测量的地方[4.］.到目前为止，还没有任何关于在实验室自动化系统中使用光学方法确定液体填充水平的报告，但1989年提交的一项专利确实描述了一种手动视觉控制微量滴定板(MTPs)的机制[5.］.使用这种方法，要检查的mtp被放置在设备中，使它们保持与图案表面的预定平行距离。从图案表面反射的光通过透明mtp井中的流体进行折射，允许检测流体在图案中的畸变或与空井相比的过度强度。这种方法便于用户进行手动监测，但仍限于透明、无色的微量滴定板。

目前，自动移液系统使用电容式或气压敏感移液器来确定填充水平[6.]，通过检测移液管尖端与流体接触时的容量变化或移液管尖端浸入流体时的压力变化来确定液位。此电容测量原理仅限于导电的流体，然后可能必须将其添加到实际样品中；此限制然而，n不适用于压力原理。

这两个系统都使用间隙测量和基于已知井几何结构的体积计算来测量填充水平。但是，此处应用的体积为0–20 μL代表96井和0-10井μL表示384孔板——流体仍然在井底形成液滴;在这些体积范围内的经典填充级测量不会产生可用的结果。

使用上述方法，移液器还需要保持到井底的最小距离以避免损坏。除此之外，由于粘附效果良好的小偏心液滴将保持不可检测。

超声波传感器可用于测定体积，也支持无接触测量。有足够小的传感器，可以进行多口井的测量[7.];上述关于移液管到平板底部的最小间隙或不检测偏心液滴的限制在这里不适用。

2.MTPs中填充水平定性检测的光学方法

2．1．需求和挑战

上述原理有一个特别的缺点——测量非常耗时，因为每个传感器一次只能监测一口井。在96孔板上使用八尖移液管工具进行电容测量大约需要半分钟，384孔板大约需要两分钟。超声波传感器速度更快，但要用于96孔板，必须使用可以排成一排的薄传感器，每个孔的宽度为9毫米。它们必须安装在机器人上的一个实验室位置之上。由于大多数机器人从上面接近实验室设备(进行拾取和运输)，必须使用传送带来运送感知设备下面的平板。这些必需品使得解决方案安装困难，而且价格昂贵。此外，它需要相对较大的空间，无法用于384孔板。这些液位检测器系统理论上可以提供一种监测单个移液步骤的方法，但所花的时间将相当长。

开发的光学移液管监测系统将提供一种适当的方法，在几个平行井上测量每个给药步骤，支持在不到10秒的极短时间内监测384个井。评估包括检测液滴以及随后根据液滴在图像平面上的二维投影和众所周知的几何图形估计液滴体积。本文将描述第一步的开发和评估。

2.2。选择合适的光学系统

在实验室里，摄像机系统和平板扫描仪已经用于读取条形码。相机系统提供了一种大约每秒的快速成像方法，但它们对环境光非常敏感;此外，他们根据不同的位置从不同的角度拍摄每口井。对于图像处理来说，速度的好处不能超过缺点，因为监测移液管需要极高的精度(灵敏度和特异性)。

平板系统是一种替代方案，因为它们可以从下方直接照亮，使得必要的图像处理更容易。联系图像传感器（CIS）系统（ZTS-A6那Ziath有限公司)具有弱光源和景深；弱光源使扫描仪对环境光照条件的变化敏感，但低景深的优势在于只有井底的物体处于焦点位置，使它们更容易识别。相比之下，电荷耦合器件（CCD）平板扫描仪(Xtr-96那fluidX有限公司。)的光源强，景深大。每个传感器类型的正负点可以根据应用来权衡——该软件支持各种成像系统。

2．3.系统设置

对实施移液监测的各种方法进行了研究。该系统的设计目的是整合移液机器人甲板(Biomek FX, Beckman Coulter)所需的硬件，并支持与控制计算机的合适接口。此外，为了确定和最小化环境照明的影响，尝试了各种覆盖物。需要在由控制软件控制的计算机上安装其他软件。该软件支持通过USB连接的各种传感器类型，确保安装设备的方便和简单。

２.４.软件

自行开发的图像评价软件是测量系统的核心;它可以用于各种成像系统，可以配置为不同类型的板，可能不同的底部形状和材料，因此也透明度。图像处理概念的灵感来自于级联分类器[8.]由于最初不可能开发出同样适用于各种板类型、液滴大小和流体的算法。级联分类器由多个弱分类器组成，这些弱分类器组合成一个强分类器。

三种算法（弱分类器;见表1)同时评估图像;输出与ADALINE (Adaptive Linear Neuron)合并，计算结果[9.].存在为每个板和设备组合配置系统的最佳重量（见图1）.用简单的最小二乘方法从训练数据中确定权重。

最后，为了使用系统，需要选择一个固定的阈值;理想的阈值由训练数据确定如下: 关于平板、成像设备和移液液的先验知识也用于其他点。系统参考板-器件组合来选择成像方法所需的设置和算法参数。

2．5．考试的方法

每台设备均设置在移液台上进行测试。液体通过移液管给药。然后这些感光板被转移到光学系统中;用(CIS，相机)和不覆盖(CIS, CCD，相机)分别拍摄一张图像。由于本节所述的原因，摄像机系统未列入评价2.2．

为了产生更多的测试数据，将板用几次使用内部的物质累积的数​​倍。两种移液方法用于检查。对于96孔板，在一行中向8个井中分配某个体积，而下行留空（填充6行，则为6行）。对于384孔板，一定的体积分配到每秒钟。选择这些方法以测量液滴在板上铺展。还有空洞的井分布在板上，以便检测到位置效果。

第1 - 40的剂量μ96井MTP采用了l，但只有1-12 μ384孔板的最大用量，因为孔的体积较小。1-8使用更紧的步骤μl为生成更多测试数据。之后开发的算法在收集的数据上使用。

试验在96孔聚苯乙烯（PS）和聚丙烯（PP）板（V型底）、96孔聚苯乙烯板（F型底）和384孔板聚丙烯板（V型底）上进行。在下文中，我们将使用上述缩写来指代铭牌。在三种类型的设置CCD、带覆盖的CIS和不带覆盖的CIS中，在八到十二个体积步骤中对四块板分别进行三到四次扫描。总共拍摄了四百多张测试图像。

2.6。评价方法

接收器工作特性(ROC)函数描述探测器的行为取决于阈值选择设置其灵敏度[10.]。如果设置了较低的阈值，则会出现许多真阳性，但会出现更多假警报。

疗效以真阳性(TPs)和假阳性(FPs)表示3.）.无论阈值如何，均取ROC曲线下面积来衡量其疗效[10.］.ROC曲线是一个以阈值为参数的函数。表中的标准2可以使用以测试功效。

3.结果

桌子1总结每个设备检测板的真阳性和假阳性的百分比。此表显示了一个运行的例子与固定参数优化的V-PP-96板和CIS系统(无覆盖)。

对系统对各种影响的敏感性进行了广泛的检查，以衡量系统在现实生活条件中的有用性。

3．1.决议对疗效的影响

测试的最大分辨率为600 dpi(每像素0.042 mm)。对较低分辨率300 dpi(每像素0.085 mm)的比较测试也取得了良好的结果。在1以上测试的音量范围内降低分辨率μL无显著负作用。

3.2。系统的测量范围

检测液滴有上限和下限。下限受几个因素的影响，如光在圆柱体顶端或v尖处扭曲v底井中间的图像，液滴需要比底尖更大。所有板的下限都小于1μl

数字2显示了液滴在尺寸增大时，粘附在井壁上的数量明显增加。

这降低了大体积的TP率，因为反射消失了，从而导致了测量范围的上边界。96孔板的理想测量范围在1到24之间μl、 而卷高达10个 μl可在384孔板中可识别。数字3.显示了两种不同极板测量质量的退化。

3．3.在变化的照明条件下操作

该系统将在实际操作的各种条件下使用;环境光到达板的变化取决于系统的位置以及季节和一天中的时间，所以系统必须测试与光照条件有关的鲁棒性。为了测试这一点，我们在以下三种不同的典型照明情况下拍摄了测试图像:(1)设备上的阳光完全直接照射，(2)间接照射，(3)没有自然照明——实验室照明。

使用CIS传感器对每个运行进行两种图像，以测试其对环境光的特定敏感性。每个板在每个环境光线设置和每个体积中都有一次使用一次，并在没有覆盖物（微调板盖）的情况下进行成像。在成像过程中，盖子从环境光屏蔽板。

数字4.展示了阳光直射如何破坏图像的一个例子。类似的过度曝光也会影响到使用CCD传感器拍摄的图像，但由于CCD传感器对环境光不太敏感，因此影响程度较低。总的来说，CCD传感器拍摄的图像不会受到直射光的影响，从而变得毫无用处。

带有lid的CIS扫描仪的结果由图中的散列区域表示4.．固体区域包括没有盖子的结果。图中显示了使用盖子改善的真阳性与假阳性之间的关系，以及另一方面较小的波动范围。因此，覆盖的好处包括改善结果和对环境光的鲁棒性。波动范围越小，TP/FP平面上的面积就越小。有界区域ΔAUC_O.与ΔAuc相比，在没有覆盖的情况下为0.132_L.0.018，有盖，仅约13.6%。

CCD传感器产生更强大的结果;区域ΔAuc的差异_{o, CCD}为0.034，与带覆盖的CIS传感器的一般量程相同。

3.4.样品物质和移液技术的影响

所给物质的剂量因液体性质而异。不同粘度和表面张力的液体使用不同的移液技术。如果流体和移液管之间的粘结力过大，则必须使用Tip Touch等技术将液滴滴到井中。粘度还会影响给定体积的样品在井中扩散的方式。

一项测试涉及过滤水和纯DMSO的功能性。理想的水移液技术用于将相同形状的液滴以非常高的再现性水平放置在井的中间。DMSO移液使用尖端接触，这对物质不理想；这增加了d的负面影响滴状物粘附在油井边缘。二甲基亚砜的剂量也显示，随着体积的增加，偏离中心的滴状物的频率增加，这表明操作范围取决于物质。图5.展示了一种糟糕的移液技术如何导致未在墙壁上隐藏的未被液滴。如部分所述3.2，这导致测量精度降低。与使用任何一种传感器类型的水相比，二甲基亚砜的精度降低得更早、更快。优化的移液技术在可靠检测移液滴方面发挥着重要作用。

4.结论和建议

系统的功能已经在这个测试序列中得到了确认。与目前使用的相机解决方案相比，使用一个基本的平板扫描仪简化了移液监测的应用，并提高了结果，同时提高了效率。

呈现的移液监测可以使用基于CCD或CIS平板扫描仪的条形码读取器来实现，实验室可能已经拥有。测试了对样品体积和物质性质以及对环境光的鲁棒性的功效。根据实验室照明条件，覆盖物可以改善结果。应对影响传感器信号的所有环境变量进行进一步工作。另外对发达系统的错误分析和古典方法的比较将进行。

现在的测试结果揭示了系统的各种可能的改进;结果质量显示出对所使用的算法参数的重大依赖性，因此自动参数优化应用于可靠地检测最佳参数。此外，这将使用户能够以自己的方式为新的LabWare配置设备，因为然后自动找到所有设置。

此外，应优化对环境光的适应，以确保系统尽可能在无覆盖的情况下使用。对于高体积范围或位置不正确的液滴，还有进一步的改进空间；从二维液滴投影、流体性质和井壁厚度进行定量体积估算的可能性ape需要进一步调查。

承认

作者希望感谢联邦教育部和研究生命科学中心的财政支持部（03zik 021）。

参考文献

1. G.波特，“微型化分析放大移液管问题”美国生物技术实验室，第20卷，第2期。2，页71,2002。浏览：谷歌学者
2. A. Balcombe，“在水平上，”控制和仪表，卷。26，不。12，p。1994年。浏览：谷歌学者
3. m·j·海姆Füllstandmesstechnik in der industriellen Praxis, VDI/VDE-Gesellschaft für Mess- und Automatisierungstechnik, 2002.
4. S. Chakravarthy，R. Sharma和R. Kasturi，“使用计算机愿景的非接触水平传感技术”IEEE仪器仪表与测量汇刊第51卷第1期2，页353-361,2002。浏览：出版商网站|谷歌学者
5. G. J. Litt，“美国专利：4824230-Visualization Device，”美国专利4824230，1989年4月25日。浏览：谷歌学者
6. J. Pochert，“高通量筛选应用中的液位检测”，刊于国际生物技术实验室，p。44,2000。浏览：谷歌学者
7. D. dosenbach和S. Jess， " Wenn derμ升eine卷spielt，“在Mikrofluidik，第44页，Oktober 2009。浏览：谷歌学者
8. R. E. Schapire，“机器学习的提升方法：概述”非线性估计与分类， vol. 171, pp. 149-171，施普林格，柏林，德国，2003。浏览：谷歌学者
9. h博特,神经模糊方法，施普林格，柏林，德国，1998。
10. T. Fawcett，《ROC分析导论》，模式识别的字母，卷。27，不。8，pp。861-874,2006。浏览：出版商网站|谷歌学者

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