溶菌酶、蛋白酶K和头孢菌素对临床分离菌株生物膜形成的影响铜绿假单胞菌

摘要

铜绿假单胞菌是一种机会致病菌，可以形成生物膜，使免疫清除和抗菌治疗产生耐药性。因此，有必要采取有效的措施来防止生物膜的形成。在这里,103P.．绿脓杆菌临床分离株定量筛选通过组织培养板方法的生物膜形成的能力。溶菌酶（水解酶）和生物膜形成蛋白酶K（蛋白酶）的影响以不同的浓度进行评价。溶菌酶（30 μg/mL），但蛋白酶K不显著抑制生物膜的形成（抑制率为19%）。24小时后的生物膜的处理P.．绿脓杆菌与头孢他啶和头孢吡肟的最小抑菌浓度（MIC）50次分离显著32.8％和44％分别减少生物膜质量。此外，24个小时之久的生物膜曝光P.．绿脓杆菌溶菌酶分离株(30μg/mL)和50倍mic的头孢他啶或头孢吡肟导致生物膜质量显著减少，与单独暴露于溶菌酶或抗菌药物相比。溶菌酶联合抗菌膜效果最佳(49.3%)μg/mL)和50倍的头孢吡肟MIC。头孢他啶或头孢吡肟单独或联合溶菌酶(30μg/mL)表明了一种根除血管内装置和隐形眼镜中假性生物膜的新策略。

1.介绍

生物膜是由细胞外多糖物质覆盖的固着微生物区域，它促进微生物细胞不可逆地附着在其亚结构上或彼此之间[1那2]细胞外多糖基质支持整个微生物结构，并作为细胞间和细胞表面相互作用的介质，这对生物膜的形成和排列至关重要[3.那4.]因此，生物膜是对抗抗菌剂的障碍。生物膜可能形成于有生命或无生命的表面、水、土壤、沉积物以及活生物体的软组织上[4.］.

铜绿假单胞菌是一种表现出代谢多样性的环境病原体[5.］.它是与各种感染有关的主要机会致病菌之一，包括呼吸道感染、植入物感染、烧伤、伤口和医院感染[6.那7.］.的能力P.．绿脓杆菌在不同的环境中形成生物膜与抗生素对许多严重感染的无效性有关，因为抗生素对生物膜基质的渗透有限，且被细胞外基质灭活[8.那9.］.因此，革兰氏阴性菌P.．绿脓杆菌因其与生物膜相关感染有关而受到极大关注[8.那10］.

用于根除生物膜的各种策略包括防止微生物附着于表面，抑制生物膜的形成以促进抗生素的渗透，以及阻断生物膜的成熟过程[11-13］.其中一种策略是使用精油作为天然化合物，抑制生物膜的形成而不影响细胞活力[14］.

生物膜产生者的多药耐药性高于非生物膜产生者[15]。浓度为最低抑菌浓度（MIC）50倍的抗生素可能会减少某些生物膜产生物种的菌落形成单位数量[16］.相反，基于酶活性的生物膜破坏被认为是对抗与生物膜相关的持续性感染的一种可行策略，因为酶治疗提高了微生物生物膜的抗生素敏感性[17］.溶菌酶和蛋白酶K报道显示出抗生物膜的活动。蛋白酶K酷似天然产生的蛋白酶，并且可以使用通过断裂表面蛋白[以促进生物膜传播18］.溶菌酶的抗菌膜活性与天然免疫系统对生物膜感染的保护功能有关[19依赖于对肽聚糖的水解活性。此外，溶菌酶具有与阳离子和疏水特性相关的上溶机制，导致细菌自溶[20.］.

此前的研究表明，埃及医院中普遍存在生物膜形成细菌[21那22这对根除形成生物膜的细菌的新策略的发展提出了挑战。在本研究中，103P.．绿脓杆菌对临床分离菌株进行定性和定量筛选，考察溶菌酶、蛋白酶K和头孢菌素(头孢吡肟和头孢他啶)的抗菌膜活性。

2.材料和方法

2．1．收集及识别P.．绿脓杆菌临床分离株

在6个月期间(2017年5月至2017年10月)，从曼苏拉大学医院和私人诊所的不同临床来源(伤口、尿液、导尿管、烧伤、隐形眼镜和痰)共收集了103份临床标本。对临床分离菌株进行显微镜检查，并按照先前建议的方案进行标准生化试验[23］.所有临床分离株在37℃的LB培养基中培养，并在含20% (v/v)甘油的LB培养基中存储在−80℃，直到进一步分析[24］.

2．2．伦理批准

实验方案符合埃及曼苏拉大学药学院研究伦理委员会通过的伦理指南(代码:2017-20)。所有患者均同意参与本研究。所有患者年龄均在16岁以上。

２．３．试管法定性检测生物膜

所有P.．绿脓杆菌如前所述，用管状法筛选分离菌的生物膜形成能力[19］.将各分离物的甘油储备分别划线于营养琼脂(NA)平板上，37℃孵育24 h。从NA板上取纯菌落，接种于含1%葡萄糖(TSBG)的10ml胰豆汤试管中，37℃孵育过夜。阴性对照只含TSBG，不含细菌接种。孵育后，仔细抽吸每根试管中的培养物，用磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.4)冲洗附着的生物膜。将试管倒置放置至完全干燥(30-45分钟)，然后用1%结晶紫染色15分钟。过量的染料用蒸馏水冲洗掉。两名不同的观察者分别用肉眼观察生物膜的形成[25那26］.阳性结果显示在管壁和管底表面可见染色膜。根据被染生物膜的紫色强度，生物膜的形成能力不同P.．绿脓杆菌株被列为牢固附着的，适度的粘附，弱贴壁，或贴壁。在这项工作中，P.．绿脓杆菌菌株PAO1和菌株PA14分别被用作强粘附菌株和弱粘附菌株的参考菌株，这些标准菌株的生物膜生成能力在以前的报告中得到证实[27-29］.

２.４.组织培养板法生物膜形成的定量分析

采用组织培养板法检测生物膜形成[6.那30.-32］.我们使用96孔微量滴定板对45个随机选择的分离菌株进行了生物膜筛选，以确定其形成生物膜的能力。这些细菌分别来自TSBG、Mueller-Hinton肉汤(MHB)、脑-心灌注肉汤(BHIB)和LB。

将在NA平板上划线的菌株接种到每种培养基中，并将平板在37℃下培养24小时 h、 在所有研究培养基中制备每个分离物的过夜培养物，用于定性分析。600℃下过夜培养物的光密度（OD） 使用合适的介质将nm波长调整至0.2–0.25，并使用分光光度计（WPA colorwave CO7500色度计）进行测量。对于每个分离物，100等份 μ将调整od的培养物接种到4个孔中。在每个实验中单独包含每种培养基的阴性对照。

37℃孵育18-24 h后，仔细抽吸培养物，用200洗涤生物膜3次μL PBS (pH 7.4)，强烈搅拌以去除任何非贴壁细胞。贴壁细胞用150 μ g固定μL无水甲醇浸泡15分钟。抽吸甲醇，用150染色μL 1%（w/v）结晶紫，20分钟 用蒸馏水仔细冲洗盘子三次，并在空气中倒置，直到干燥。染色后的生物膜用150%乙醇溶解 μ每井33% (v/v)冰乙酸的升。经溶解后，OD值_540海里使用ELx808™Absorbance Microplate Reader (BioTek Instruments Inc.， Winooski, VT)测量值。

结果如前所述进行了分析[6.那30.];计算了4口井每个隔离层的平均外径，并与控制截止外径(OD)进行了比较_C)，定义为高于阴性对照平均值（3 SD）的三个标准偏差（SD） + 平均值）。粘附程度是生物膜质量的指标。每个分离物的粘附力越强，生物膜质量和紫罗兰色强度越高。形成的生物膜量被评分为不粘附（OD）_我≤OD_C)，弱粘附(OD_C< OD_我 ≤ 2 OD_C)，适度粘附(2 OD_C< OD_我 ≤ 4 OD_C)，或强烈的追随者(4 OD_C< OD_我）.选择最适宜的支持生物膜形成的培养基，考察其余部分的生物膜形成能力P.．绿脓杆菌隔离。

2．5．溶菌酶和蛋白酶K对生物膜形成的影响

溶菌酶(Carl Roth，卡尔斯鲁厄，德国)和蛋白酶K (QIAGEN，猫。不。19131)对生物膜形成能力的九种粘附力最强P.．绿脓杆菌如前一节所述，通过生物膜定量分析对分离株(最高值)进行调查。溶菌酶原液(300μg/mL）在0.2中制备 M PBS，而蛋白酶K原液（30 μg/mL)。不同浓度的溶菌酶(5、10、30μg/mL)和蛋白酶K (2,5, 10μ克/毫升）在TSBG培养每个分离物进行了调整和一式四份（4个孔）使用。Negative controls for each culture together with 0.2 M PBS or 30 mM Tris buffer (without the enzymes) were also included in each experiment.

2.6。溶菌酶的作用（30 μg/mL)对浮游细胞活力的影响

目的:探讨溶菌酶对紫花苜蓿活力的影响P.．绿脓杆菌在浮游细胞中，两个具有代表性的强粘附菌株(E4和B3菌株)单独在TSBG中传代或与溶菌酶(30μg / mL)。将培养物置于37℃摇瓶培养箱中，每小时测定OD值，考察其生存能力_600海里共16小时[19那33］.

2.7。浮游细胞的抗菌素敏感性

头孢他啶和头孢吡肟的mic值分别为16P.．绿脓杆菌根据美国临床和实验室标准协会(CLSI, 2018)的指南，使用MHB培养基的肉汤微稀释法分离菌株。这些筛选的菌株是最强的生物膜产生者。

2.8。溶菌酶、头孢他啶和头孢吡肟的抗菌膜效应

16种生物膜的粘附力最强P.．绿脓杆菌分离物在含有100个细菌的微量滴定板中建立 μL TSBG介质如前所述。对于每个分离物，在溶菌酶存在下建立生物膜(30μg / mL)。另外，每个分离物在TSBG仅包含PBS作为对照没有溶菌酶温育。The cultures were aspirated after 24 h of biofilm establishment at 37°C without shaking. Ceftazidime and cefepime were dissolved in the TSBG medium and separately added at concentrations 50 times higher than their MICs. The plates were incubated for 24 h at 37°C without shaking. Each experiment was performed in quadruplicates. Biofilm formation was assayed as mentioned in the previous section of quantitative assay of biofilm [6.那30.］.

2.9。统计分析

使用GraphPad prism 7®(7.00版本)进行统计分析。成对的学生的t-采用双尾分布试验评估生物膜质量的差异。价值被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1。细菌的分离与鉴定

在这项研究中，共有103人P.．绿脓杆菌从曼苏拉医院和私人诊所的不同患者中收集临床分离菌。这些临床分离株经纯化和生化鉴定为阳性P.．绿脓杆菌．分离株从尿液(36例)、伤口(16例)、眼睛(13例)、痰(13例)、烧伤(10例)、导尿管(9例)、接触镜(4例)和血液样本中纯化，如补充材料(可用)所示在这里）.

３．２．试管法检测生物膜的定性分析

按照定性测定的使用管法的结果，103P.．绿脓杆菌根据菌株在TSBG培养基中产生生物膜的能力，两位独立的观察人员将菌株分为:28株(27.1%)强粘附菌株，23株(22.3%)中度粘附菌株，33株(32%)弱粘附菌株，19株(18.4%)非粘附菌株(图)1）.

3.3.用组织培养板法定量测定生物膜形成

表格1研究表明生物膜形成明显增加P.．绿脓杆菌在TSBG培养基中培养的45株临床分离株中，44%的分离株在组织培养板法中是强大的生物膜产生者。相比之下，BHIB、LB和MHB中强生物膜产生菌株的百分比较低。因此，选择TSBG培养基对所有临床分离株进行进一步定量筛选。结果显示，59%的103P.．绿脓杆菌临床分离株在TSBG培养基中具有很强的粘附性，而没有一个分离株是非粘附性的(表)2）.每个分离物形成生物膜的能力在补充材料中说明。

3.4.溶菌酶和蛋白酶K对生物膜形成的影响

观察到所有的调查中生物膜块一个显著减少P.．绿脓杆菌隔离( ）在溶菌酶存在下培养的溶菌酶浓度为30时，还原率最高(19%)μg / mL;因此，我们用这个浓度做了进一步的实验。如表所示3.，在所有测试浓度下，我们均未观察到蛋白酶K对生物膜质量减少的任何显著影响( ）.

3.5。溶菌酶对P.．绿脓杆菌浮游细胞生存能力

溶菌酶(30μg/mL)P.．绿脓杆菌分离菌株B3和E4通过监测培养物在600 nm波长下的吸光度测定(图2）.溶菌酶处理的分离菌在培养16 h时的活力与未处理的对照相似，表明溶菌酶不能影响细菌的生长。

3.6。抗菌药物敏感性的P.．绿脓杆菌浮游细胞

根据CLSI 2018, 11和13，P.．绿脓杆菌分离株表现出抗性(R.)分别对头孢他啶和头孢吡肟进行检测，4株分离株呈中间产物(一世)对头孢他啶耐药，2株表现为中等耐药。只有一株易感(S.)，以两种抗生素(表4.）.

3.7.溶菌酶、头孢他啶和头孢吡肟的抗生物膜作用

我们观察到显著减少( ）在生物膜团中P.．绿脓杆菌临床分离的溶菌酶存在(30μg/mL)或50倍于头孢他啶或头孢吡肟的mic。溶菌酶(30μg/mL）和50倍MIC的头孢他啶显著抑制( ）与溶菌酶或头孢他啶单独相比，生物膜的形成。同样地，显著减少( ）在生物膜团中检测到溶菌酶的结合(30μg/mL)和头孢吡肟(50倍MIC)与单独使用酶或抗生素观察到的差异(表5.和图3.）.

4.讨论

P。绿脓杆菌是一种与慢性肺部感染和囊性纤维化相关的机会性人类病原体[34那35］.P.．绿脓杆菌通过在肺泡中形成生物膜来定植肺组织。生物膜形成细菌对大剂量抗生素具有高度抗性，并受到多形核杀菌活性的保护[1那36］.因此，我们旨在研究溶菌酶、蛋白酶K和头孢菌素(头孢他啶和头孢吡肟)对临床分离菌株生物膜的清除能力P.．绿脓杆菌在埃及检测。总共有103个临床分离株列入本研究。

试管法和组织培养板法分别是生物膜检测常用的定性和定量方法[6.那19那30.那37那38］.我们定性筛选了103个P.．绿脓杆菌使用试管法检测临床分离株生物膜形成能力，发现27%的分离株具有强粘附性，54%为中等或弱粘附性;约18%的分离株无粘附性。这些结果与之前报道的关于生物膜形成能力的研究结果相似P.．绿脓杆菌[39］.

一些研究评估了培养基组成对生物膜形成的影响[30.那40］.与LB和BHI等其他培养基相比，含1%葡萄糖的胰蛋白酶大豆肉汤被认为能增强生物膜的形成。用。进行定量分析P.．绿脓杆菌临床分离菌株定量检测时，选择能增强生物膜形成能力的最佳培养基至关重要。45株临床分离株中，20株(44%)、13株(28%)、7株(15%)和6株(13%)分别在TSBG、BHIB、LB和MHB培养基中具有强粘附性，见表2．因此，被用于剩余的临床分离株的调查TSBG媒体。其结果是，约103个临床分离株59％被认为是强粘附性，而分离的无（0％）在分别TSBG非粘附性。

管状法被认为不如组织培养板法灵敏，因为一些临床分离株在管状法中不粘附、弱或中度生物膜产生者在组织培养板法中表现出强烈的生物膜模式[41那42］.使用管的方法，我们发现，84（81.5％）分离株生物膜生产者和19（18.5％）为生产者非生物膜（表3.）.与此相反，所有分离株生物膜生产者时，使用组织培养板中的方法定量测定。因此，19个分离株在管方法的假阴性由于其精度低，如在许多研究报道[40］.用管状法很难准确区分中度粘附、弱粘附和非生物膜产生者;因此，一些研究推荐不同观察者通过管状法分析生物膜的产生[25那43］.

溶菌酶和蛋白酶K能够抑制多种细菌形成生物膜的能力[19那33那44］.溶菌酶存在于生理分泌物中，浓度在10至30之间μ克/ mL的[33］.溶菌酶的非生理浓度(大于30μg/mL)可促进生物膜的形成P.．绿脓杆菌[19]及白色念珠菌[33］.因此，我们研究的浓度溶菌酶的对生物膜形成的影响≤30 μ克/毫升。

先前的一项研究调查了溶菌酶对细胞生长的影响P.．绿脓杆菌[19］.然而，本研究仅筛选了溶菌酶对两株菌株的抗生物膜能力P.．绿脓杆菌．在浓度为30时，溶菌酶的抗菌膜活性最高μ克/ mL的[19］.在我们的研究中，生物膜形成能力显著降低P.．绿脓杆菌不同浓度溶菌酶。我们的结果(表3.)表明溶菌酶是一种很有前途的生物膜抑制剂，特别是在30μg/mL浓度(生物膜形成减少19%)。

证实所观察到的溶菌酶对生物膜形成的抑制作用仅仅是由于其抗菌膜的活性，而不是由于生长抑制P.．绿脓杆菌细胞，我们研究了酶对浮游细胞活力的影响。为此，我们选择两株临床分离株(E4和B3)进行实验。E4和B3分离株具有较强的溶菌酶抗生物膜效应(减少44%)和中等的溶菌酶抗生物膜效应(减少18%)μ分别g / mL)。

蛋白酶K具有抗生物膜作用金黄色葡萄球菌浓度为2μ克/ mL的[44那45］.然而，我们没有观察蛋白酶K的上的生物膜形成能力的任何显著影响P.．绿脓杆菌在不同浓度下(2,5和10μg / mL)。蛋白酶K的作用是双向的;也就是说，它促进或抑制P.．绿脓杆菌不同浓度的生物膜。例如，分离株B3和W14中蛋白酶K的抗菌膜活性(见表2)3.)在浓度为5时更大μg/mL，与10μ克/毫升。产生这种意想不到的结果的一个原因可能是这种蛋白酶的切割相对不具体[46］.值得注意的是，据报道，蛋白酶K对细菌无抗菌膜活性P.．绿脓杆菌在之前的研究中[47］.因此，蛋白酶K不在我们后续实验中。

头孢菌素是广谱抗生素，对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌有效。头孢他啶和头孢吡肟是最有效和最常用的治疗药物P.．绿脓杆菌感染(48那49]因此，我们选择了这些抗生素，并研究了它们对细菌生物膜形成能力的抑制作用P.．绿脓杆菌．以前的一项研究表明，分离株产生生物膜的能力更高，对许多抗菌剂有产生更高耐药性的趋势[28］.抗生素浓度高于其MICs时，不会对生物膜群落中的细菌产生杀灭作用[16那40］.例如，头孢他啶的MIC增加了15倍P.．绿脓杆菌PAO 579在慢性肺部感染大鼠模型中的应用[50］.因此，一些研究调查了在浓度为MIC值25倍、50倍甚至104倍的情况下，抗生素对不同细菌生物膜形成的影响[16那51-53］.据我们所知，头孢他啶和头孢吡肟浓度为其mic值50倍时对生物膜形成的影响尚未进行评估。

我们筛选了50倍mic浓度的头孢他啶和头孢吡肟对16株典型菌株生物膜形成能力的影响P.．绿脓杆菌在组织培养板法中有较强的粘附性。我们观察到，在这些测试浓度下，头孢他啶(降低32.8%)和头孢吡肟(降低44%)对生物膜的形成均有显著抑制作用。此前的一项研究表明，头孢菌素家族的一员头孢噻肟未能显著抑制生物膜的形成P.．绿脓杆菌[16］.然而，需要指出的是，头孢菌素类药物中仅推荐头孢他啶和头孢吡肟用于治疗P.．绿脓杆菌根据CLSI(2018)。

溶菌酶具有良好的抗菌膜活性(30μg/mL)和50倍MIC的头孢他啶和头孢吡肟的联合作用(30μg/mL)和每种抗生素(50倍MIC)。有趣的是，50倍mic的头孢他啶或头孢吡肟显著抑制溶菌酶存在下24小时形成的生物膜(30μg/mL)3.）.中加入Cefepime的组合（50倍MIC）和溶菌酶（30所观察到的最高抑制效果（49.3％减少） μg / mL)。

5.结论

综上所述，据我们所知，这是第一次研究头孢他啶和头孢吡肟单独或联合溶菌酶50倍MICs对菌体生物膜质量的影响P.．绿脓杆菌．因此，头孢他啶和头孢吡肟单独或联合溶菌酶(30μg/mL)可以作为一种可行的根除策略P.．绿脓杆菌导管、隐形眼镜、血管内装置或呼吸管中的生物膜。今后应进一步研究溶菌酶和头孢菌素直接固定化对这些项目的影响。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的数据是可用的，请相应的作者。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

该研究项目由作者以及埃及曼苏拉大学药学院资助。

补充材料

补充材料包括所有临床分离株生物膜形成的定量分析数据，以及它们的临床和地理来源。（补充材料）

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