UVC辐照对大鼠生长和凋亡的影响Scedosporium apiospermum和Lomentospora prolificans

摘要

Scedosporium apiospermum和Lomentospora prolificans是从免疫缺陷患者中分离出来的重要真菌种类。以往的研究表明，这些丝状真菌以腐生植物的形式存在于土壤中，对几种药物具有最高的最低抑菌浓度。我们的目的是研究UVC是如何影响美国apiospermum和l . prolificans通过研究UVC在生长中的作用，溴化乙啶(EB)/吖啶橙(AO)染色诱导细胞凋亡，以及caspase招募域家族成员9 (CARD-9)基因的转录组学研究。我们的研究表明，暴露在UVC光下15分钟有效地增加了这两种生物的减少，并导致菌落形态、颜色和菌丝生长模式的变化。UVC照射15 min后，EB/AO染色检测凋亡细胞，凋亡率为96.06%美国apiospermum和28.30%l . prolificans．CARD-9基因表达结果证实了细胞凋亡的诱导美国apiospermum和l . prolificans在UVC治疗之后美国apiospermum细胞凋亡信号的表达高于l . prolificans．我们的研究探讨了UVC在失活中的作用美国apiospermum和l . prolificans．我们希望我们的数据在未来的研究中对其他研究者有用。

1.介绍

Scedosporium apiospermum物种复合体是一组新兴的机会性真菌病原体，越来越多地在免疫缺陷患者中发现[1]．美国apiospermum和Lomentospora prolificans(前名Scedosporium prolificans)是医学上很重要的一种真菌，是从患有癌症的病人身上分离出来的Scedosporium感染(2- - - - - -5]．以往的研究表明，这些丝状真菌以腐生植物的形式存在于土壤中，特别是来自工业场所、城市操场、农田、下水道和污水的土壤中，并与有机物有关[6，7]．在泰国，感染美国apiospermum和l . prolificans已被报告[8，9]．不过，过关了l . prolificans比…更复杂美国apiospermum因为它对许多传统的抗真菌药物更具耐药性[10]．

一些研究评估了紫外线(UV)光作为消毒剂的使用[11，12]．紫外线分为三个波段，即UVA, UVB和UVC。UVC(波长100 - 280nm)杀菌能力强，常用于杀菌[13]．沙利文等．确定了UVC在原核生物和真核生物中的作用[14显示99%铜绿假单胞菌和脓肿分枝杆菌在接触3-5秒后死亡，99%的白色念珠菌和来自烟曲霉属真菌暴露15-30秒后死亡。本研究结果得到Dai的支持et al。谁研究了紫外线对人体的影响C．白色的三度烧伤的老鼠感染后[15]．他们证明，在第0天和第1天进行UVC治疗显著降低了感染烧伤的真菌生物负荷。

美国apiospermum和l . prolificans可能是机会性感染和环境污染，特别是土壤。因此，免疫缺陷的宿主可能对感染具有易感性[16]．因此，这些真菌可能分布和污染，可以高度影响免疫缺陷的宿主。

研究主要集中在UVC作为消毒剂的作用，特别是其杀菌效果。然而，关于UVC在凋亡通路中的作用的信息缺乏。这项研究的目的是研究UVC是如何影响的美国apiospermum和l . prolificans通过研究UVC对细胞生长和诱导细胞凋亡的作用。

2.材料和方法

2．1．分离株及培养条件

美国apiospermum哥伦比亚广播公司(CBS) 117410l . prolificansCM324由Ana alastuey Izquierdo博士(Servicio de Micología, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spain)提供。每株分离物在Sabouraud葡萄糖琼脂(SDA;Difco，美国)在35°C下倾斜7天。收集孢子并悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.4)中。

2．2．UVC对S生长的定性评价。apiospermum和l . prolificans

研究UVC对S。apiospermum和l . prolificans，取1 ml分生孢子悬液，浓度为1 × 10⁶细胞/ml加入6孔板，暴露于波长254 nm (CL-1000 Ultraviolet Crosslinker, Canada) 54 mJ cm的UVC辐射下⁻²［13然后是20分钟μl悬液转移到SDA板上，37℃孵育7天。每天用肉眼观察菌落形态(直径、颜色和生长速率)，直到第7天。剩余孢子悬液2000 rpm离心5 min, PBS (pH 7.4)重悬，溴化乙啶(EB)和吖啶橙(AO)染色进行细胞凋亡研究，caspase招募域家族成员9 (CARD-9)基因转录组研究。

2．3.扫描电子显微镜

分生孢子悬液美国apiospermum和l . prolificansUVC曝光后转移到SDA板上，37℃孵育4天;然后收集真菌菌丝，放置在一个13毫米的圆形盖玻片上。用扫描电镜观察细胞形态。首先，将样品用2.5%戊二醛固定在蔗糖磷酸盐缓冲液中(1次，1 h)。吸出固定液，用甲醇脱水1 min，吸出至干燥。之后，将样品涂上金，用扫描电子显微镜(JSM-6610Lv, JEOL Ltd, Tokyo, Japan)检查。

２.４.细胞凋亡的研究

用EB/AO染色检测凋亡细胞，与之前报道的一样，只是有轻微的修饰[17- - - - - -19]．简单地说,2µl 100年µg/ml EB和100µg/ml AO各加至20µl，在荧光显微镜(Olympus/BX41)下立即观察样品。测定活细胞和凋亡细胞。活细胞显示绿色的正常细胞核，而凋亡细胞显示染色质浓缩或破碎。

2．5．CARD-9基因的转录组学研究

从分子水平、转录组水平研究凋亡调控基因CARD-9、凋亡相关基因调控、IL-1的表达β，并定量测定与BCL10/CLAP的相互作用[20.- - - - - -22]．总RNA从美国apiospermum哥伦比亚广播公司(CBS) 117410l . prolificans根据制造商的说明，使用TRIzol®(Invitrogen，美国)分离UVC暴露15分钟后的CM324和没有UVC暴露的相应对照。大约1 × 10⁶750毫升裂解细胞μl，以氯仿为分离相。用异丙醇沉淀RNA，然后用75%乙醇洗涤，DNase处理。用不含rnase的水溶解RNA。用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher, Wilmington, DE, USA)测定RNA得率，并调整总RNA浓度。

采用定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测UVC暴露后CARD-9表达的变化。RT-PCR采用80 ng/反应的RNA模板和由KAPA SYBR®FAST One-Step qRT-PCR Master Mix (2X) kit组成的PCR反应混合物(KAPA Biosystems, USA)， 0.4μ每10的LμM正向引物和反向引物(CARD-9:正向引物5 ' -TCCGACCTGGAAGATGGCTCAC-3 '，反向引物5 ' -CAGAGCTGCAAAGGGCTGTTTC-3 ') [22), 0.4μ50X RT Mix。采用CFX96 TouchTM Real-Time PCR检测系统(德国Biorad公司)进行PCR扩增。阴性对照包括除RNA模板外的所有试剂。所有的条件都是用相同的RNA进行的。采用qRT-PCR方法分析检测样品和对照样品的基因表达水平。β-以微管蛋白为内参基因，利用以下引物进行qRT-PCR归一化:β-tubulin forward 5 -GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3β-tubulin Reverse 5 ' -ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3 '[详细信息]23]．RNA定量方法。将UV照射下的CARD-9表达与对照条件进行比较。

3.结果

3．1.UVC辐射对紫外线照射时间的影响美国apiospermum和l . Prolificans

UVC辐射的初始测试效应:暴露15分钟时发现时间依赖效应显著降低菌落大小，15分钟后未发现显著降低。然后我们在这项研究中使用了15分钟的暴露时间(图1)。

3．2．UVC对生长的影响美国apiospermum和l . Prolificans

通过测量菌落直径和观察菌落形态来确定菌落的生长速度。结果表明，对照组(未UVC照射)的菌落直径美国apiospermum和l . prolificans明显大于UVC暴露者(图2- - - - - -4)。在两者的控制下，殖民地的边缘都是圆形和平滑的美国apiospermum和l . prolificans．相比之下，美国的殖民地美国apiospermum和l . prolificansUVC曝光的锯齿边缘有辐射晕;在第2 ~ 4天不呈圆形，在第5 ~ 7天逐渐呈圆形。的颜色美国apiospermum控制（在未UVC照射下，SDA第2天呈白色，第7天呈完全灰色美国apiospermumUVC曝光也显示出类似的结果，但与对照组相比呈现出浅灰色。的殖民地l . prolificans对照组有黑色的边缘从中心辐射出来，显示黑色和灰色菌丝的混合，并且UVC暴露的菌落的颜色比对照组更淡。

3．3.扫描电子显微镜(SEM)

电镜下，细胞形态无明显差异美国apiospermum和l . prolificans，有或没有UVC曝光(图5)。

3．4．UVC对美国apiospermum和l . prolificans细胞凋亡途径

UVC诱导几种真菌凋亡[13，24，25]．在这两个美国apiospermum和l . prolificans， UVC暴露诱导细胞凋亡，通过EB和AO处理后细胞染色质缩合和橙色染色观察(图)6)。UVC照射后，细胞凋亡率为96.06%美国apiospermum28.30%,l . prolificans．无UVC照射时，细胞凋亡率为2.38%美国apiospermum2.04%,l . prolificans．

3．5．CARD-9基因的mRNA表达

两组均观察到CARD-9 mRNA表达增加美国apiospermum和l . prolificans在UVC照射15分钟后，与对照组(无UVC照射)相比。有趣的是,美国apiospermum细胞凋亡信号的表达高于l . prolificans，差异均有统计学意义(P < 0.05)。（数字7)。

4.讨论

Scedosporium物种(包括l . prolificans)被证明与机会性感染有关，特别是在免疫功能低下的患者中。在泰国,美国apiospermum据报道在接近溺死和肾移植患者的脑脓肿中发现[8，26),l . prolificans据报道，在急性髓系白血病伴长期发热性中性粒细胞减少的患者中发现了播散性感染(Damronglerd et al. 2014)。在这个病人,l . prolificans对抗真菌药物如两性霉素B、伏立康唑和泊沙康唑(最小抑菌浓度> 32μg / ml) (17]．在环境调查研究中，我们发现美国apiospermum物种复合体在曼谷各地的土壤中广泛存在，并检测到优势美国apiospermum美国这篇(27]．正如上面提到的,l . prolificans对多种常规抗真菌药物均表现出较高的最低抑菌浓度美国apiospermum似乎更容易受到这些药物的影响[28]．由于抗真菌耐药性，许多研究都在研究新药物与传统药物联合用于协同杀菌活性[29- - - - - -31]．

许多研究已经证明了紫外线作为消毒剂的作用，特别是在细菌中。紫外线亦被用作室内游泳池等地方的消毒剂[32]及医院地面[33]．紫外线分为UVA, UVB和UVC波段。UVC光是一种常用的微生物灭活工具。Lakretz等．结果表明，254nm ~ 270nm的UVC波长对微生物的灭活效果最好，254nm、260nm和270nm波长对生物膜的控制效果最好[34]．因此，我们选择的波长为254 nm。到目前为止，没有研究解释UVC辐照对生长的作用美国apiospermum和l . prolificans．在我们的研究中，我们证明了UVC辐射在15分钟的UVC暴露后降低这两种生物的生长的有效性，并伴随着菌落的颜色和形态的变化和菌丝生长模式。在细菌中，UVC通过破坏DNA发挥杀菌活性[35]．贝克et al。表明UVC会杀死金黄色葡萄球菌，大肠杆菌,铜绿假单胞菌在UVC暴露2分钟后无活菌计数白念珠菌被紫外线照射20分钟后死亡[36]．紫外线照射的杀菌效果取决于目标微生物的属和种。Conner-Kerr等．发现,粪肠球菌是更容易被紫外线杀死的金黄色葡萄球菌［37]， UVC并不区分耐抗生素菌株和敏感菌株[35，37]．

在进行了文献综述后，我们对UVC诱导的程序性细胞死亡感兴趣。在本研究中，我们发现96.06%的细胞被诱导凋亡美国apiospermum和28.30%的l . prolificansUVC暴露后的细胞。我们的结果表明美国apiospermum对UVC的敏感度是l . prolificans，增加了UVC行为是属/种依赖方式的假设的价值。我们进一步通过分析CARD-9基因的表达，在分子水平上探讨其对细胞凋亡的影响。CARD-9可与BCL10的CARD结构域相互作用，BCL10是凋亡和NF-的正调控因子κB激活(38]．基因表达结果表明，CARD-9在大肠杆菌中被诱导表达美国apiospermum和l . prolificansUVC处理后的细胞美国apiospermum细胞凋亡信号的表达高于l . prolificans．扫描电镜形态分析结果显示，UVC暴露后未见明显变化或显著点;可能来自于UVC, UVC不直接影响形态，但影响了真菌生长过程中涉及的内部信号转导等功能，有待进一步研究。

El-Azizi的研究等．证明UVC联合抗葡萄球菌抗生素对甲氧西林敏感和耐甲氧西林葡萄球菌导管生物膜消毒的有效性[39]．UVC光与抗真菌药物联合应用的效果有待进一步研究美国apiospermum和l . prolificans．总的来说，我们的研究观察了UVC对失活的影响美国apiospermum和l . prolificans．因此，这一知识可应用于烧伤、皮肤真菌感染及其他浅表和皮下真菌感染的UVC局部应用等治疗方法。然而，在安全性和有效性方面还需要进一步的评估。我们希望我们的数据在未来的研究中也对其他研究人员有用。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

信息披露

这篇文章不包含任何研究与人类参与者或动物执行的任何作者。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

我们感谢Mahidol大学热带医学院医学真菌学和病毒学实验室提供的实验室房间和一些必要的机器，我们还要感谢Yuvadee Mahakunkijcharoen博士提供的一般性咨询和建议。这项工作得到了2015年热带医学基金的支持，该基金由Mahidol大学热带医学学院Watcharamat Muangkaew、2016年卫生系统研究所(HSRI)和泰国国家研究委员会(NRCT) 2016年Natthanej Luplertlop资助。

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