不同的Terpene-Containing精油对扩散的影响棘球绦虫granulosus幼虫细胞

文摘

人类罹患囊型包虫病仍然是一个主要公共卫生问题在几个国家和治疗策略不解决。现在的工作的目的是确定麝香草酚的体外效果、,m . pulegium和迷迭香属officinalis精油的扩散大肠granulosus幼虫细胞。孤立的细胞和细胞聚集体取自包虫囊肿的生发层,1、5、10μ克/毫升的麝香草酚和不同精油为7天。药物作用是评估使用测试可行性和扫描电子显微镜。控制细胞培养能力为2.1 x 10⁶7天的孵化后(100%)。在第七天,麝香草酚5μg / ml引起细胞的减少63%,精油的可行性m .、10μg / ml,m . pulegium10μg / mlr . officinalis10μg / ml 77年的可行性产生减少,82年,和71%,分别。此外精油导致细胞数量减少,倒塌的细胞,失去正常的三度空间的聚集的成分。由于精油造成的抑制作用大肠granulosus细胞我们认为这将是一个有效的方法抑制幼虫的生长。

1。介绍

罹患囊型包虫病(CE)是一种人畜共患的疾病造成的幼虫阶段的寄生虫棘球绦虫granulosus全球分布和重要的医学和经济影响1]。Metacestode或包虫囊肿是由三层,一个内部生发层包含一些细胞类型包括未分化的细胞,以及肌肉和被膜的细胞。支持这一层外部的非细胞的层压层,旁边有一个host-produced外膜层(2]。

CE的传统上,手术是最常用的替代治疗,因为它有可能消除囊肿,导致完成治疗(3]。然而,在瘫痪病人或陪同的情况下手术,化疗导致一个更好的选择。到目前为止没有替代治疗方法疗效为100%。因此,一个强大的动力研究人员开发替代治疗方法,如使用传统的药用植物,最近被提升(4]。

目前,用于药物筛选的方法对囊性包虫病包括孵化protoscoleces或与物质测试小鼠囊肿。使用这种方法目前的几位已报告令人鼓舞的结果5- - - - - -9]。虽然已经提出了建议精油作为一种有价值的治疗选择与大量的疾病(10,11),到目前为止只有一些作品研究精油针对寄生蠕虫的作用[12- - - - - -14]。最近,在体外protoscolicidal效果的精油迷迭香属officinalis(迷迭香)、百里酚(精油提取的主成分牛至属植物vulgare和胸腺vulgare),精油的提取黄连木khinjuk,和精油各种种虫害已经证明了几位作者4,5,7,15]。

在体外文化系统是非常有用的描述候选化合物对他们的作用机理16]。创新,我们建议使用一个大肠granulosus细胞培养作为工具进行大规模筛查驱虫剂的化合物。

当前工作的目的是确定的在体外不同的terpene-containing精油对扩散的影响大肠granulosus幼虫细胞。

2。材料和方法

2.1。植物材料

博士提供的精油是请Liesel Gende和马丁博士Eguaras (Laboratorio de Artropodos Facultad de Ciencias正序连赢y一直所de马德普拉塔)。的r . officinalis精油提取报道(5)和m .、和m . pulegium据(7]。

2.2。细胞培养和药物治疗

大肠granulosus细胞培养是获得使用之前报道的方法(17]。总之在37°C细胞培养介质199 (Gibco BRL)补充10%的边后卫,10%包虫囊液,减少代理(5×10⁻⁵2-mercaptoethanol和100μM l), 2毫米谷酰胺(美国Bio-Rad) 4毫克毫升⁻¹美国葡萄糖(σ),1毫米丙酮酸钠(σ,美国),和抗生素(青霉素、链霉素、庆大霉素100μ克毫升⁻¹)。大肠granulosus细胞培养至少4周。有些文化是亚文化一周一次和其他人保持没有亚文化促进细胞聚集体的形成悬浮生长。百里酚(σ)溶解在二甲亚砜(DMSO)的药物浓度10毫克/毫升。精油的m .、,m . pulegium和r . officinalis被溶解在10毫升蒸馏水和乳化与5%丙二醇(PG) v / v。阿苯达唑(ABZ) (Sigma-Aldrich)用作参考的解决方案是由溶解药物和10毫克纯DMSO溶液的标准药物1毫升。然后,麝香草酚、ABZ或每个精油添加到介质导致的最终浓度10 5和1μ克/毫升。细胞培养在培养基含有10μL DMSO溶液或PG担任控制。每个实验重复三次。

2.3。孤立的细胞生长抑制试验

大肠granulosus细胞被播种到24-well微型板块实现5×10的一个近似密度⁵细胞也⁻¹1毫升的媒介。这个实验细胞培养24小时后的亚文化。麝香草酚或添加了不同的精油系列浓度和文化培养7天。天0、2、5、7可行性评估通过台盼蓝染料(σ)排除使用血细胞计数器。在实验中,文化被后显微镜下决定的外观形态改变。

2.4。药物影响孤立的细胞和细胞聚集

对这个实验细胞培养24小时后亚文化或四个月大的文化包含大数量的细胞聚集。天2、5、7的治疗,样本收获(总量恢复在1.5毫升塑料管道和单个细胞治疗的整个过程附加幻灯片),2.5% (v / v)戊二醛固定在0.1% (v / v)钠甲次砷酸盐缓冲48 h在4°C,然后洗几次甲次砷酸盐缓冲。标本后来被连续脱水孵化项目增加浓度的乙醇(50% 10分钟,10分钟70%,80% 10分钟,10分钟90%,95% 10分钟,10分钟两次100%)最后沉浸在hexamethyldisilazane 18 h。用黄金和检查他们sputter-coated JEOL地产- 6460 LV扫描电子显微镜(日本)15千伏。

2.5。统计分析

为了验证实验假设广义最小二乘法(gl)方法应用(18]。分析使用统计程序“R”(2011) (19)和统计包“NLME”(20.]。

3所示。结果

细胞培养生存在暴露于不同浓度的麝香草酚和精油如图1。控制治疗显示总细胞数的增加平均达到2.1×10⁶在第七天总细胞。没有发现差异时介质包含PG或DMSO作为控制(图1)。

百里酚产生的细胞数量的减少只有时间的方式。麝香草酚的最高的打虫药效果获得了5μg / mL显示减少63%的细胞生存能力在第七天。然而未发现不同浓度的麝香草酚之间的差异。的精油m .、和m . pulegium产生的剂量和时间效应只对实验的最后达成可行性降低82%和77,分别用10μ克/毫升浓度在第七天。必要的油r . officinalis显示显示减少剂量和时间影响细胞的可行性在第七天(10 71%μg / mL)。百里酚治疗或不同的精油不仅会导致细胞分裂的逮捕,但也引发了相当大的减少细胞的数量在孵化后第二天。另一方面,大数量的细胞碎片可以检测到细胞计数特别是使用phytotherapics的最高浓度。ABZ被用作参考药物治疗化验显示没有区别。

麝香草酚的影响,各种spp。,r . officinalis精油也由光学显微镜显示监控不仅减少细胞数量匹配结果的可行性测试(图2),而且许多死细胞和细胞碎片。此外,通过SEM研究显示药物治疗中产生细胞超微结构的损害。有相关性的强度破坏和精油的浓度或复合化验。细胞治疗的麝香草酚10μg / mL第七天显示形态改变,肿胀,细胞萎缩,细胞数量减少(图3)。

另一方面,结构损伤诱导的细胞聚集体的药物也被观察到。图4(一)显示了未经处理的细胞总量表现出典型的三度空间的组合与大数量的细胞和粗糙表面的蛀牙。后7天postincubation麝香草酚或精油,严重改变骨料表面被观察到。图4 (b)显示的效果r . officinalis作为一个标记细胞数量减少,细胞碎片和倒塌的细胞。蛀牙是空的空间包围着一堵墙的厚度(图2 - 3细胞4 (c))。phytotherapics在蛀牙的效果显示典型的多细胞结构的损失也观察(图4 (d))。

统计分析(gl)透露,研究因素(浓度、博览会时间和治疗)相关解释细胞数量变化。

4所示。讨论

精油和植物提取物已被用于食品保存数千年尤其是,制药,替代医学和自然疗法21]。最近,越来越多的草药用于治疗许多疾病,包括一些感染(11)还有几个挥发油(monoterpenoids和倍半萜类化合物)、抗菌以及抗癌活动报道(22]。

几项研究已经证明了在体外各种精油的效果对寄生虫(23- - - - - -26]。它也证明了各种种虫害和r . officinalis精油和精油的主要成分作物和o . vulgare麝香草酚,明显在体外驱虫剂活动(4,5,7]。

本文描述了第一次在体外不同的terpene-containing精油对扩散的影响大肠granulosus幼虫细胞。百里酚和精油的打虫药活动m .、,m . pulegium和r . officinalis是证明。治疗总是显示与控制条件的差异;然而与治疗精油,麝香草酚的浓度之间没有差异。这可能是由于低浓度使用。在先前的研究精油的杀寄生虫药效果trypanosomatids研究和使用浓度20至150人μ据报道(克/毫升27]。

减少大肠granulosus观察细胞数量与曝光时间成正比。m . pulegium(10μg / mL)产生最快的效果,在第二天的细胞生存能力减少了56%。另一方面,最高的打虫药效果观察m .、(10μg / mL)导致的减少82%的细胞生存能力在第七天。

这些结果与报道的一致(7),观察到显著protoscolicidal效果使用m . pulegium和m .、精油,即使获得的效应与细胞更快。它可以解释为protoscoleces是多细胞生物包围外皮与裸细胞相比,更容易受到药物的作用。因为这些细胞是相同的组合生发层的这个结果可以推断药物影响棘球蚴囊肿。

评估phytotherapics造成的结构性变化大肠granulosus单个细胞和细胞聚集,主要生产收缩,细胞肿胀,和失踪的损失正常的多细胞聚集的组织。这个结果同意先前的研究中胚层包虫囊肿的治疗后不同的药物(7,28]。

虽然到现在对精油的方式行动,相信它涉及不同的目标和机制在不同的生物因为他们包含各种各样的组件29日]。精油的主要化合物用于这项工作是piperitone氧化物(63.6%)m . pulegium,isomenthol (36.08%)m .、和beta-myrcene (24.97%)r . officinalis。据报道,piperitone氧化表现出抑制作用金黄色葡萄球菌(30.),黄曲霉(31日),和肠杆菌科32]。另一方面,薄荷醇(isomenthol异构体)的抗菌效果证明了几个作者(33,34]。此外beta-myrcene抗氧化和抗菌性能的证明(35]。

相比,在我们的研究中,使用的低浓度百里酚LD50值400μ使用u - 937 g / mL人类promonocytic细胞已被报道(36]。的精油m .、,m . pulegium和r . officinalisLD50值1612.45毫克/公斤(37),4200毫克/公斤38),> 2000毫克/公斤(39),分别报道使用啮齿动物模型。这些数据证明,这里使用的phytotherapics更有选择性大肠granulosus幼虫细胞与其他动物模型相比。

的大肠granulosus细胞培养模型适用于各种精油的筛选和组件,目的是寻找新的打虫药药物。而且它允许分析药物对细胞增殖的影响,是不可能使用protoscoleces小囊太小不会或小鼠囊肿。由于抑制作用观察大肠granulosus细胞是比得上生发层获得的结果,我们认为这将是一个有效的方法抑制幼虫的生长。

在未来的工作中,我们计划评估精油的打虫药活动组件单独或联合评估协同或拮抗的发生之间的相互作用。这类研究可以识别和量化驱虫剂活动中每个组件的责任。使用单个组件将提供更大的可预测性和减少副作用的可能性。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者欣然承认老特博士和峡谷(SENASA、阿根廷)。这项工作是支持的皮克特人12号1164 (ANPCyT、阿根廷),PIP 0029国家(阿根廷),和所de马德普拉塔(格兰特穰581/12和格兰特穰672/14),阿根廷。

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