ITS1 PCR-RFLP诊断和描述利什曼虫在临床样品和菌株从人类皮肤利什曼病病例在墨西哥东南部的州

文摘

美国皮肤利什曼病临床局部皮肤的形式,包括一个频谱弥漫性皮肤,黏膜与皮肤的利什曼病可引起不同的菌株利什曼虫属于l .墨西哥或原虫在相同的流行地区复合物可能共存。我们评估了PCR-RFLP化验的ITS1基因直接识别利什曼虫物种在163年临床分离出的样品和21日墨西哥利什曼虫。与墨西哥的隔离利什曼虫显示一个模式类似于52%l . (l)墨西哥,5%显示混合模式兼容l . (l)墨西哥和l . braziliensis (v),八l . amazonensis (l)和l . (l)墨西哥,一个l . braziliensis (v)。大多数的临床样本,109/116(94%),做了一个类似的模式l .墨西哥,两个临床样品给了类似的模式利什曼虫braziliensis 5样本模式,建议合并感染l . (l)墨西哥和l . braziliensis (v)或l . (l)墨西哥和l . amazonensis (l)。的ITS1 PCR-RFLP诊断分析是一种多用途的工具利什曼虫从临床样本,使确定感染种类的新世界利什曼虫在相对较短的时间和低成本。

1。介绍

利什曼病是一组寄生虫病的全球分布。皮肤利什曼病(CL)是最普遍的形式的利什曼病,主要引起局部皮肤损伤(拼箱),可以自我修复,但从寄生虫可以传播到鼻咽黏膜,造成二次损伤的典型黏膜与皮肤的利什曼病(制程)或传播到整个身体的结节样病变扩散皮肤利什曼病(DCL)。世界卫生组织估计全球大约1200万例,患病率60000年死亡率。高危人群的大小大约是3.5亿1]。

美国皮肤利什曼病包括拼箱所致利什曼虫(l)墨西哥,DCL造成的利什曼虫(l。)amazonensis,利什曼虫(l。)venezuelensis,利什曼虫(l)pifanoi和制程造成的l。braziliensis复杂的(2]。

在流行地区,多个物种的利什曼虫可能共存。识别基于临床症状的感染物种是困难的,因为几个物种会导致拼箱和恢复期。在一些村庄在墨西哥,患者病变产生的原虫和l .墨西哥复杂的成员可以找到患者以及患者拼箱和DCL在同一个村庄3]。此外,报告显示,对治疗药物的反应可以在不同物种之间差异存在于同一地区(4]。诊断确认,正确的识别利什曼虫物种具有重要的适当的物种特异性治疗以及流行病学研究。

聚合酶链反应(PCR)方法被开发作为一种替代现有的诊断程序直接检测等寄生虫通过显微镜检查的临床标本或种植。

几个分子诊断PCR已评估的目标利什曼虫包括minicircle动基体DNA (kDNA) [3),miniexon(拼接领袖RNA)基因(5),gp63 PCR-RFLP [6),而内部转录间隔区(ITS) (7- - - - - -9),等等。

在目前的研究中,所述的Cupolillo et al。10)和Schonian et al。11),发现在滤纸和样品利什曼虫从皮肤溃疡患者隔离疑似PCR扩增分析了LC的内部转录间隔区1基因(ITS1)和限制性片段长度多态性(ITS1 PCR-RFLP)对利什曼病和寄生虫的直接诊断识别。

本研究的目的是寻找一个利什曼病的诊断方法,结合了高灵敏度和物种分化,在短时间内和低成本。

2。材料和方法

2.1。道德的考虑

知情同意是获得所有的成年人参与了这项研究。同意列入儿童从父母或监护人。本研究的协议是伦理委员会审查和批准的卫生当局卡拉克穆尔的尸体,墨西哥,同意进行人体生物医学研究国际伦理指南(诺玛Oficial墨西哥de Salud:笔名- 003 - ssa 2 - 1993),为诊断和治疗人类流血。

2.2。利什曼虫文化和临床样本

这与21的文化研究利什曼虫隔绝皮肤溃疡患者不同州的墨西哥,请由学院捐赠记录Referencia, Secretaria de Salud墨西哥。

临床样本(163)被Centro de请捐赠Investigaciones基于,大学德坎佩切和洛Servicios de Salud del市政厅de卡拉克穆尔坎佩切,墨西哥。临床采集标本过滤器文件或涂片的皮肤病变患者疑似CL不同流行地区。

2.3。利什曼虫参考菌株

利什曼虫panamensis (v)(MHOM / CR / 87 / NEL3),利什曼虫panamensis (v)MHOM / PA / 72 / LS94,利什曼虫guyanensis (v)(MHOM / BR / 75 / M4147),l . (l)墨西哥(MHOM / MX / 85 /索利斯),l . braziliensis (v)(MHOM / BR / 75 / M2903)l . amazonensis (l)(MHOM / BR / 73 / M2269)参考菌株被用作控制。的菌株利什曼虫在RPMI培养介质补充10%胎牛血清在26°C。

2.4。DNA提取

每个临床标本被从滤纸或筛选了250年涂片和培养μ为1 h L细胞裂解缓冲56°C。DNA利什曼虫文化是由离心法10⁸寄生虫在增长的指数期在4°C 2000 g 10分钟。粒的DNA提取使用高纯PCR模板准备工具包(罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国),遵循制造商的指示。DNA是储存在−20°C,直到被使用。

2.5。PCR分析内部转录间隔区1 (ITS1)

样品进行了分析使用400 nM ITS1 PCR引物:LITSR: 5′-CTTG GATCATTTTCCGATG-3′和L5.8S 5′tga TAC CAC TTA TCG猫条t - 3′(12]。PCR-Ready最高的反应进行了混合(Syntezza生物科学,耶路撒冷,以色列)25μ总反应的L。放大条件如前所述[12]。PCR产品(地位μL)消化有三世酶,根据制造商的指示。分析了300 - 350个基点的扩增子在1.5%琼脂糖凝胶和限制碎片在4%琼脂糖凝胶电泳在1 x 100 V Tris-acetate-EDTA缓冲区(0.04米三乙酸酯和1毫米EDTA, pH值8)和可视化的紫外线与溴化乙锭染色后(0.3μg / mL)。GeneRuler DNA梯混合(Fermentas MBI)用作DNA分子标记。

3所示。结果

与特定的引物PCR ITS1导致的放大利什曼虫参考菌株、墨西哥文化和临床样本给300到350个基点放大乐队。限制ITS1基因的扩增子的l . panamensis (v),l . guyanensis (v),l . braziliensis (l)参考与核酸内切酶菌株有三世生成的模式有两个乐队170年和150年的英国石油公司;l . amazonensis (l)生成两个乐队220年和140年的英国石油(bp);和l .墨西哥生成三个乐队200年80年,40个基点(图1)。

大多数墨西哥隔离利什曼虫11/21(52%)显示限制模式的三个乐队(200、80和40 bp)相似l . (l)墨西哥参考应变;其中9从患者获得来自坎佩切。1/21(5%)显示混合模式兼容l . (l)墨西哥和l . braziliensis (v)(巷15)和一种文化l . braziliensis (v)(3)道;8显示混合模式兼容l . (l) amazonensis和l . (l)墨西哥。几个样品可以欣赏(图一个不完整的消化2)(表1);这些结果与先前的研究一致PCR TS1-RFLP分析来确定利什曼虫物种在临床samplesby Rotureau et al。13)和PCR诊断和表征的研究利什曼虫在临床样品Schonian et al。11]。

与临床样本116/163(71%)被放大,109/116(94%)给ITS1 PCR-RFLP模式相似l . (l)墨西哥参考应变;在7个样品(6%)额外的50乐队和25个基点观察表明合并感染,因为它被发现在前面研究Hernandez-Montes et al。3墨西哥的]kDNA PCR分析利什曼虫物种,他们发现了在临床样本的DNAl . (l)墨西哥和l . braziliensis (v)。在车道3 - 4和7 - 8 200年乐队的模式,170年和140年英国石油公司观察到显示的存在l . (l)墨西哥,l . (v) braziliensis和l . (l) amazonensis分别(图3)。

4所示。讨论

分子技术已被证明是敏感的和强大的工具,用于检测利什曼虫直接在临床样本以及寄生虫特征,利用PCR。

几篇科学论文基于其分析发表在利什曼病的诊断和识别利什曼虫物种。Cupolillo et al。10评估的使用限制模式利什曼虫和VianniarDNA隔离从不同的主机和地理区域,发现高水平的内部和种间变异,并显示其属的进化速度不够快,使物种歧视。

有趣的是,Schonian et al。11)建立了一个诊断ITS1 PCR-RFLP使用限制性内切酶的方法有三世利什曼病;它结合了高灵敏度检测利什曼虫直接在临床材料和识别所有与医学有关的物种群体的能力。另一方面,Spanakos et al。14)开发了一个ITS1 PCR-RFLP方法和核酸内切酶13日我为检测和物种的分化利什曼虫直接从临床样本,具体足以识别所有利什曼虫在希腊物种常见。Slami et al。15]研究伊朗中部的CL地方性区域,通过使用ITS1 PCR-RFLP分析诊断利什曼虫物种在临床样本,发现概要文件的变化利什曼虫物种可能影响治疗和/或控制策略。另一方面El-Beshbishy et al。16]研究ITS1 PCR RFLP和kDNA PCR检测临床样本CL来自沙特阿拉伯西部发现的患者l .主要和l . tropica这kDNA PCR的灵敏度90.7%和70.1%的ITS1 PCR。促进诊断和物种识别使用这两种技术,而寄生虫文化仅检测到39.2%和涂片阳性样本的55.3%。此外Kumar et al。17),在印度的CL流行区域使用ITS1 PCR-RFLP, kDNA PCR,和特定的抗体检测,发现类似的结果l . tropica致病寄生虫。

另一方面Abbasi et al。18)进行了前瞻性群组研究传播动力学的重要的血液样本收集的村民Tahtay Adiabo埃塞俄比亚北部地区结合定量实时动基体/ DNA PCR (qRT-kDNA PCR)检测少量的利什曼虫寄生虫(1 - 10 /毫升的血液)和ITS1序列PCR扩增子以识别利什曼虫物种。

另一方面Rotureau et al。13),在诊断CL和制程的新世界利什曼虫物种使用ITS1 PCR RFLP,发现只有一个消化Rsa我需要识别寄生虫在临床样本消化水平,但限制有三世并不足以区分所有物种的吗Viannia亚属,尤其是l。(V。)braziliensis/l。(V。)naiffi和l。(V。)lainsoni/l。(V。)guyanensis。

在墨西哥,Perez-Vega et al。19在杜兰戈州和Ochoa-Diaz et al。20.在锡那罗亚状态标识利什曼虫墨西哥在临床样本ITS1 PCR RFLP分析。

在目前的研究方法所描述的Schonian et al。11),大多数DCL病例被发现在塔巴斯科和韦拉克鲁斯州和所致l . (l)墨西哥拼箱的,而大多数情况下产生的l . (l)墨西哥属于坎佩切状态以及拼箱的情况下造成的原虫复杂的成员(表1)。所有这些州位于墨西哥东南部彼此非常接近(图4)。他们都有热带雨林CL流行地区。塔巴斯科州,DCL和拼箱共存;在坎佩切可以找到拼箱所致l . (l)墨西哥或原虫复杂的成员和我们能够检测混合感染的临床样本和文化(3,21]。这个方法是非常有用的分析墨西哥株利什曼虫和临床样品因为我们可以执行相对容易诊断和描述利什曼虫物种及其与临床表现的关系。

然而,这项研究与观察Berzunza-Cruz et al。22),限制模式和墨西哥的小亚基rRNA基因分离的l .墨西哥,发现基因的所有菌株显示不变的模式。

pcr检测是有利的在免疫学技术,如酶联免疫吸附测定(ELISA)和免疫荧光抗体试验(IFAT)主机物种特异性试剂不需要,这是重要的制程和免疫力低下的患者,都给负血清学测试(3]。特别是在慢性CL病人,他们构成了更大的诊断挑战由于寄生虫密度低,PCR检测化验利什曼虫DNA呈现100%的敏感性。此外,抗体仍可检测多年成功治疗后使应用PCR必要性(4]。此外,持续感染被发现在显然从恢复期病人痊愈的伤疤7];的存在利什曼虫braziliensis报道先前接受免疫疗法治疗的病人或病人在治疗的不同阶段和那些从来没有临床表现,但他们没有住在流行地区,迁移到流行地区(8]。

这些结果提出问题(我)的身份墨西哥株显示限制模式不兼容的任何限制模式在这项研究中使用的参考菌株但建议合并感染,(2)这些菌株的致病性,(3)他们的地理分布23]。为了回答这些问题,建立墨西哥的身份利什曼虫菌株及其地理分布,这将是必要的,以下的方法由范德et al。24),分析几个single-locus标记排序的墨西哥人利什曼虫压力来自最流行地区的墨西哥和患者的临床表现CL(拼箱、制程和DCL)。此外反向行污点杂交分子诊断试验的旧世界皮肤利什曼病由Nasereddin et al。25)将是有用的,探针设计从墨西哥株ITS1 PCR扩增子,流行病学研究,需要大量的样本筛选,为了测试潜在的宿主和向量和流行病学监测。

5。结论

ITS1PCR-RFLP化验分析工作是一个有价值的多用途工具直接从临床诊断样本没有寄生虫感染的隔离,使测定的新世界利什曼虫在一个相对短的时间。推荐的ITS1 PCR-RFLP试验可靠的特征利什曼虫物种主要在流行地区的多个物种的存在利什曼虫重叠的临床图片要求同时物种识别以相对低的成本。虽然在这两个领域利什曼虫和Viannia亚属的物种存在,ITS1 PCR-RFLP必须结合kDNA PCR为了提高诊断的灵敏度CL或制程。

信息披露

这项研究没有得到具体拨款资助机构在公众,商业,或非营利部门。

利益冲突

不存在利益冲突,作者要申报的东西。

承认

金融支持这项研究的经费由Secretaria de Investigacion y Posgrado IPN,墨西哥。阿玛莉亚Monroy-Ostria CONACyT会员,EDI, COFAA、墨西哥。

引用

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