疟疾寄生虫的丝氨酸蛋白酶恶性疟原虫:潜在的抗疟药物的目标

文摘

疟疾是一种全球主要的寄生虫病之一,巨大的死亡率和发病率。广泛的耐药性对目前抗疟药权证新药物靶点的识别和开发新药。疟疾蛋白酶是一群分子作为潜在药物靶点寄生虫的生命周期阶段,因为他们的重要性和可行性,设计特定的抑制剂。蛋白酶属于各种机械类中发现恶性疟原虫,其中丝氨酸蛋白酶是特别感兴趣的由于他们的参与parasite-specific出口的过程和入侵。在恶性疟原虫,许多丝氨酸蛋白酶属于胰凝乳蛋白酶,枯草杆菌蛋白酶,菱形宗族。本文关注的潜力恶性疟原虫丝氨酸蛋白酶作为抗疟药物的目标。

1。全球疟疾负担和开发新型抗疟药的必要性

疟疾由原生动物寄生虫引起的疟原虫是一个全球主要寄生虫病(1]。人类疟疾是由五个疟原虫物种,即恶性疟原虫,间日疟原虫,p .那,三日疟原虫,诺氏疟原虫。其中,恶性疟原虫严重疟疾的病原体和疟疾引起死亡的主要原因。

根据2013年世界疟疾报告》,估计有2.07亿名临床疟疾病例和2012年估计有627000人死亡,约有90%的死亡发生在撒哈拉以南非洲地区。国际努力控制疟疾导致显著减少疟疾有关的死亡。从2000年到2012年,全球疟疾有关的死亡人数减少了29%,31%,世卫组织非洲区域(2]。方法,以防止疾病的传播或保护个人在疟疾流行地区包括治疗和预防性药物,蚊子消灭,和预防蚊虫叮咬用杀虫剂处理过的蚊帐(itn),室内残留喷洒,幼虫控制(2]。

早期的抗疟药物从天然产物分离。金鸡纳树的树皮和黄花蒿中提取的是第一批有效的抗疟药。喹啉化合物氯喹是使用最广泛的药物,直到最近。耐氯喹开始在1980年代在非洲,造成巨大的复兴疟疾负担的3,4]。氯喹抗性促使许多国家采用磺胺多辛-乙胺嘧啶(SP)作为一线抗疟,但耐药恶性疟原虫人口迅速被选在非洲,东南亚和南美。只有5年的使用后被废弃在东南亚(5,6]。由于对可用的抗疟药的广泛耐药性,以青蒿素为基础的联合疗法(ACTs)介绍了在亚洲,非洲和南美洲。抗疟药物青蒿素是有效和迅速行动源自中国青蒿植物,青蒿(7,8]。由于他们短期的行动,青蒿素不能独自管理,导致复发的寄生虫血症(9];然而,他们可以管理行为在三天的组合longer-acting蒿甲醚在形式的抗疟药苯芴醇amodiaquine-artesunate, mefloquine-artesunate [10]。尽管行为的有效性,使用青蒿素单一疗法导致出现耐药性恶性疟原虫寄生虫在柬泰边境地区(11,12]。根据世卫组织,直到现在耐药性已经在三个报告疟原虫物种,恶性疟原虫,间日疟原虫,三日疟原虫(13]。

目前治疗疟疾的影响主要是通过政府的氯喹、SP和行为。预防性药物包括氯喹、伯氨喹,甲氟喹合成,强力霉素,malarone (atovaquone和氯胍)(14]。尽管抗疟药物治疗和预防的可用性,传播的阻力,缺乏更多的抗疟药认股权证需要新的药物靶点的识别和开发新型药物。

2。蛋白酶和抗疟药物的目标

蛋白酶构成无处不在和高度丰富的催化和监管组分子在生命系统有广泛的作用。他们主要是参与蛋白质周转组成氨基酸生成新蛋白质的基石和消化的膳食蛋白质在高等生物。此外,蛋白质激活有限蛋白质水解是一种常见的许多生理过程的监管(15]。蛋白酶的主要毒性因素构成各种寄生虫病,如血吸虫病、疟疾、利什曼病,恰加斯病,非洲昏睡病。蛋白酶的作用的一些特征明显的例子寄生虫发病机制包括参与入侵宿主细胞,降低血液的血红蛋白和其他蛋白,免疫逃避,激活炎症(16]。在这种情况下,他们是至关重要的病原生物体生存和他们引起的疾病。他们的潜在药物靶点所强调的可行性设计特定的抑制剂。

蛋白酶识别一个最佳肽序列及其催化裂解活性部位。选择性抑制剂针对活跃的站点可以开发。除了活动网站,exosites和变构网站还参与底物识别。因此,选择性抑制剂针对这些网站也可以开发(17]。

蛋白酶抑制剂已经成功地用作抗人类免疫缺陷病毒(HIV)药物(18)和丙型肝炎病毒(HCV) (19和治疗高血压20.和凝血障碍21]。蛋白酶的活性网站已经成功地针对病毒HIV和丙肝病毒和血管紧张素转换酶在高血压22,23]。针对活性部位并非总是可行是因为与宿主相同酶。在许多癌症,例如,蛋白酶inhibitor-based药物的研发已具有挑战性由于困难在选择性地针对活跃的网站。在这种情况下,变构网站可以有针对性的实现目标(17]。疟原虫的寄生虫是最重要的成员,门Apicomplexa,侵入宿主细胞和驻留在细胞内的定位,从宿主防御和保护提供了丰富的营养来源。无性繁殖的疟原虫的红细胞的生命周期负责疟疾的临床症状。它始于入侵红细胞的裂殖子从肝脏释放。intraerythrocytic寄生虫以主机血红蛋白和发展小环阶段形成一个相对较大的寄生虫和新陈代谢活跃营养体阶段,然后转换到多核裂殖体。Inhibitor-based研究表明,半胱氨酸天冬氨酸的,金属,和丝氨酸蛋白酶活动完成这个循环的关键(24]。一些先前的研究已经涉及功能丝氨酸蛋白酶在出口中的作用和入侵血液阶段(25- - - - - -27]。

3所示。恶性疟原虫丝氨酸蛋白酶

丝氨酸蛋白酶广泛分散于生物通过进化和有不同的功能。他们被分为十三氏族(28]。胰凝乳蛋白酶/ trypsin-like和subtilisin-like丝氨酸蛋白酶是两个主要的丝氨酸蛋白酶家族,具有高度催化三分子Asp的类似安排,他和Ser残留物和完全不同的蛋白质支架,也就是说,β/β胰凝乳蛋白酶和α/β对枯草杆菌蛋白酶29日]。丝氨酸蛋白酶属于胰凝乳蛋白酶,枯草杆菌蛋白酶和菱形蛋白酶家族中发现恶性疟原虫基因组。的列表恶性疟原虫丝氨酸蛋白酶及其直接同源和假定的功能提出了表S1(补充材料网上http://dx.doi.org/10.1155/2014/453186)。这些蛋白酶表达暂时监管方式在无性和有性阶段的寄生虫生命周期(30.- - - - - -32]。表S2介绍了微阵列和基于质谱的表达谱恶性疟原虫丝氨酸蛋白酶。有些蛋白酶已知对于疟原虫在红细胞的发展和exoerythrocytic阶段表明他们的潜在治疗干预的目标。

3.1。恶性疟原虫Chymotrypsin-Like蛋白酶

两个基因编码丝氨酸蛋白酶的chymotrypsin-like家族(PlasmoDB id: PF3D7_0807700和PF3D7_0812200)被确定恶性疟原虫基因组。PF3D7_0807700是同源DegP热休克蛋白家族(33]。因为低温DegP作为一个伴侣蛋白和蛋白酶在温度升高,它的角色在细胞外的过程相关的入侵是不可能的。第二个假定的chymotrypsin-like丝氨酸蛋白酶PF3D7_0812200拥有PDZ2域除了胰蛋白酶域。病毒,这个域存在于原核和真核蛋白质信号GTPase活性(34),锚跨膜蛋白细胞骨架和信号复合物的组装。这种蛋白酶也不可能直接参与侵略。

3.2。恶性疟原虫Subtilisin-Like蛋白酶

三个基因编码另一个主要的蛋白酶家族,subtilisin-like蛋白酶或subtilases(家族某人)[35,在恶性疟原虫基因组被称为PfSUB1 2和3。他们所有的人都高度表达无性血末阶段(31日]。其中,PfSUB1和2都进行了广泛的特点和与出口和入侵血液无性阶段生命周期的寄生虫26,27,36]。PfSUB3是最小的成员和初步报告已经证实了在体外丝氨酸蛋白酶的活性PfSUB3也发现了一个多功能寄生虫蛋白质,profilin,互动合作伙伴(37,38]。

3.2.1之上。恶性疟原虫Subtilisin-Like蛋白酶1 (PfSUB1)

PfSUB1 (PlasmoDB ID: PF3D7_050700和MEROPS识别码S08.012)是第一个确定的成员恶性疟原虫subtilases。PfSUB1分类的主要结构在一小群bacterial-like真核subtilases [29日,35]。在成熟PfSUB1经历了两个主要的细胞内处理步骤。第一个发生在内质网腔和最早的可检测82 kDa形式转换成54 kDa形式(意味着)39]。第二,brefeldin敏感处理步骤,意味着转换成胞内47 kDa终端处理产品(p47);意味着和p47包含预测催化域(40]。

表达codon-optimized PfSUB1基因重组baculovirus-infected昆虫细胞的分泌导致加工形式(意味着)39]。的氨基端radiosequencing在体外翻译后蛋白质显示Asp之间的乳沟^219年和Asn^220年在Leu-Val-Ser-Ala-Asp-Asn-Ile-Asp-Ile-Ser序列。这高度受限的底物特异性PfSUB1暗示非常专业和nondegradative生物功能的寄生虫(39,41]。发现了大量的昆虫细胞分泌意味着绑定到其31 kDa前肽(rp31),这是一个高度选择性,高亲和性的离解常数的蛋白酶抑制剂摩尔范围(Ki ~ 12.5海里)(39]。截断11残留的c端rp31大大减少抑制PfSUB1活动(42]。自从subtilase前肽是特定的同源蛋白酶抑制剂(43- - - - - -47),抑制肽从proregion将促进特定的蛋白酶抑制剂的设计。

许多疟原虫蛋白质具有结构插入没有发现在他们从其他属同源染色体(48,49]。这些插入可以提供目标高度选择性治疗恶性疟原虫。比较PfSUB1一级结构直接同源和相关细菌枯草杆菌蛋白酶揭示了高和低复杂性的存在插入预计形成表面链或环结构。定点诱变,删除整个循环插入,或战略替代透露,大部分循环插入对蛋白酶的活性至关重要(50]。

PfSUB1基因被发现耐火血液中删除阶段。这是存储在顶端细胞器,不同于那些参与红细胞入侵和称为“exonemes”[26]。在裂殖体成熟的最后阶段,是排入parasitophorous液泡(PV),并引发一系列蛋白水解事件导致裂殖子出口(27]。为了确定出口的介质,Arastu-Kapur等人1200年测试库的影响集中丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂对血液疟原虫生长阶段。使用从库中筛选,他们确定了PfSUB1和dipeptidyl氨基肽酶3 (DPAP3)作为出口的主要监管机构。抑制PfSUB1和DPAP3造成一块裂殖体破裂(27]而在一个相对低浓度的抑制剂,有缺陷的裂殖子被释放(51]。DPAP3成熟PfSUB1[引起的27]。成熟的PfSUB1处理parasitophorous引起的空泡的蛋白SERA5 [27]和SERA6 [52),与裂殖子外出。

裂殖子表面蛋白1 (MSP1)复杂是一个大型glycosylphosphatidylinositol (GPI)锚定蛋白复合物,这是由蛋白质MSP6和MSP7 MSP1及其相关的合作伙伴。红细胞入侵期间,最初的低亲和力与宿主细胞发生的交互通过这个复杂53- - - - - -55]。蛋白水解处理(主要处理)这个复杂的是最初的低亲和力之间的交互所必需的宿主和寄生虫和红细胞入侵。在后面的一个阶段,另一个处理这种复杂的运动需要宿主细胞内的裂殖子(二次加工)36]。PfSUB1进行初级处理parasitophorous液泡MSP1复杂的时空调控的方式(56]。此外,PfSUB1也劈开裂殖子和parasitophorous空泡的蛋白(57]。除了血液阶段,SUB1也是必不可少的肝脏发育阶段。条件基因敲除的鼠体内SUB1 (PbSUB1)透露,SUB1,尽管不是必要的早期肝阶段发展至关重要的发展肝裂殖子的裂殖体和生产阶段58]。条件诱变研究表明,PbSUB1-deficient裂殖子无法出口的肝细胞(59]。

最近一直在尝试确定PfSUB1抑制剂。Maslinic酸(MA)、低毒性天然五环三萜烯,发现抑制恶性疟原虫血多目标阶段从环裂殖体过渡阶段的机制。马被发现抑制蛋白水解处理MSP1复杂,可能通过瞄准PfSUB1 [60]。表征PfSUB1直接同源间日疟原虫,诺氏疟原虫,p .鼠透露,虽然有很多的不寻常的特性SUB1衬底绑定崩裂,乳沟网站在这些寄生虫基质蛋白酶是守恒的。二肽基alpha-ketoamide PfSUB1抑制剂抑制其所有直接同源表明小分子抑制剂可以开发针对这种蛋白酶61年]。绑定的分子动力学模拟研究已知PfSUB1底物肽根据其prodomain透露,总理和次级易裂开的债券做出主要贡献的结合自由能。它包括肽残留P4 P2′使这个地区的潜在利益对PfSUB1设计peptidomimetic抑制剂(62年]。鉴于其重要性寄生虫血液和肝脏阶段,在多个寄生虫蛋白,蛋白水解活性和作用在出口和入侵,PfSUB1称得上是一个有吸引力的抗疟药物的目标。

3.2.2。恶性疟原虫Subtilisin-Like蛋白酶2

恶性疟原虫subtilisin-like蛋白酶2 (PfSUB2) (PlasmoDB ID: 248 PF3D7_1136900 MEROPS身份证号码:S08.013)是一种我249跨膜蛋白,并表示晚血无性阶段。试图扰乱p .鼠直接同源的PfSUB2 (PbSUB2)双交叉集成一直不成功,建议PfSUB2作为药物的潜力目标(63年]。它分泌到裂殖子顶端细胞器“micronemes”,发挥了至关重要的作用裂殖子入侵红细胞(红血球)[36]。

PfSUB2导致脱落的裂殖子丰富MSP1顶端膜抗原1 (AMA1)近膜网站入侵期间(64年]。劈理的MSP1 PfSUB2发生远端一个表皮生长因子(EGF)像c端称为MSP1域₁₉(53]。MSP1₁₉仍然是绑定到裂殖子表面,这是唯一MSP1的一部分,进入宿主细胞。乳沟AMA1的地方29残留物从跨膜域,释放大量的ectodomain。通过这种方式,近膜“存根”及其同源跨膜域(TMD)和胞质域进入宿主细胞(65年]。脱落的这些蛋白质对生产力的入侵(至关重要65年- - - - - -67年]。自PfSUB2导致脱落MSP1和AMA1的结在入侵红细胞移动,它称为“裂殖子表面sheddase”(网)。这种蛋白质尚未表达的重组proteolytically活性形式,但显示了网活动纯化裂殖子。它把前到后端裂殖子的actin-dependent运动裂殖子进入宿主红细胞(36]。

像PfSUB1 PfSUB2也经历了蛋白水解职能的寄生虫,这可能是可能的成熟的事件。PfSUB2的开放阅读框编码在体外翻译翻译,这表明154.8 kDa主要产品(SUB2p)接受74 kDa中间物种(SUB2快速转换_我)这是定量转化为终端72 kDa物种(SUB2_T)[68年]。PfSUB2 prodomain已被发现是其“sheddase”活动的选择性抑制剂(36]。核磁共振(NMR)结构PfSUB2 prodomain发现了一个可能的催化domain-binding界面区域,这也可以用于设计peptidomimetic抑制剂对蛋白酶(69年]。蛋白酶对寄生虫生存的重要性,参与红细胞的入侵,初步结果表明设计的可行性对蛋白酶抑制剂使PfSUB2有前途的抗疟疾药物的目标。

3.2.3。恶性疟原虫Subtilisin-Like蛋白酶3

恶性疟原虫subtilisin-like蛋白酶3 (PfSUB3) (PlasmoDB ID: PF3D7_0507200 MEROPS识别码:S08.122)是第三个恶性疟原虫subtilase。PfSUB3研究最少的成员恶性疟原虫subtilases。也是高度表达无性血末阶段(31日]。长篇PfSUB3基因编码一个88 kDa蛋白质,25 kDa c端区域已被证明具有丝氨酸蛋白酶活性(37]。二者混合酵母筛选揭示寄生虫profilin (PfPRF)、细胞骨架和促炎的分子,作为PfSUB3互动的伙伴。PfPRF发现诱导的分泌炎性因子白介素和肿瘤坏死因子-α从小鼠骨骨髓来源树突状细胞。PfSUB3显示在PfPRF蛋白水解活性在体外化验并造成PfPRF为多个较小的片段大小的乳沟,水解的PfSUB3浓度的增加(38]。仍不清楚这种蛋白水解活性导致生理条件下成熟PfPRF或退化。鉴于PfSUB3的丝氨酸蛋白酶活性和PfPRF的多种生理功能,即运动性,出口,和感应,促炎细胞因子,其作用需要探索相关流程(38]。

3.3。恶性疟原虫菱形蛋白酶

菱形蛋白质膜内的丝氨酸蛋白酶催化三分子嵌入到双层膜,由蛋白质亲水腔形成环包围(70年]。九个菱形蛋白酶基因中发现恶性疟原虫基因组。恶性疟原虫菱形是但一个个直到日期。

两个特征的成员恶性疟原虫菱形PfROM1 PfPROM4。PfROM1本地化的顶端细胞器线型裂殖子血阶段称为“mononeme”[71年)和表面上的子孢子入侵唾液腺后(72年]。疟原虫yoeliiROM1缺乏寄生虫在红细胞的减毒和肝阶段和缺陷parasitophorous液泡(PV)发展(73年]。PfROM1和裂殖子PfROM4帮助入侵催化裂殖子的intramembrane乳沟adhesin AMA1 [65年,74年)和红细胞结合抗原175 (eba - 175),分别为(75年]。PfROM1和/或4能够打通各种丰富的参与宿主寄生虫相互作用在跨膜域(74年]。尽管这些蛋白酶的初步报告暗示寄生虫发展的重要性,他们仍然广泛的特点和评估他们的治疗价值。

4所示。结论

恶性疟原虫丝氨酸蛋白酶是特别感兴趣的是潜在的抗疟药物目标由于其出口的作用过程和入侵红细胞的preerythrocytic阶段,两个关键检查点,可以阻止寄生虫发展。寄生虫丝氨酸蛋白酶参与处理寄生虫分子参与分子相互作用在寄生虫入侵和乳沟的跨膜丰富的入侵使他们有吸引力的药物靶标。肝阶段,虽然临床沉默,药物和疫苗的潜在目标干预由于其低丰度和不同的新陈代谢。研究蛋白酶表达肝阶段是一个令人兴奋的研究领域。一个原理图的作用恶性疟原虫丝氨酸蛋白酶在无性阶段和肝血阶段如图1。

广泛的生化和结构描述这些分子和高通量筛选小分子抑制剂会导致开发新型药物的方法针对这些蛋白酶。此外,peptidomimetic抑制剂抑制区域的基础上prodomains也可以开发。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

数据源PlasmoDB版本10感激地承认。作者感谢教授阿萨Chishti,塔夫斯大学,美国、校对。

补充材料

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