具体的和快速检测结核分枝杆菌复杂的临床样本的聚合酶链反应

文摘

背景。肺结核、全球卫生问题和高度普遍在印度,一直是一个严重的问题对于明确诊断。聚合酶链反应(PCR)技术现在广泛用于分枝杆菌的早期检测和物种分化,但大多有自己的局限性。我们的目标是检测和区分结核分枝杆菌(Mtb)感染通过选择合适的目标序列,最好是出现在所有分枝杆菌物种(快艇复杂),没有别人。方法。放大的三个目标序列不相关的基因,也就是说,hsp 65(165个基点),dnaJ(365个基点),插入元素是6110(541个基点)PCR在疑似病例的临床样本进行结核病/ mycobacterioses和健康对照组。结果。该方法的灵敏度范围从73.33%到84.61%,特异性为80%。PCR方法更好(和比涂片和培养方法)。结论。我们trimarker-based PCR方法可以专门检测结核分枝杆菌和快艇复杂感染的主要致病特种加工和非病原的分枝杆菌。这种方法,通过区分快艇复杂和特种加工,提出了一种快速、精确的方法更有效地检测和诊断分枝杆菌感染,从而可以帮助更好的病人管理特别是考虑增加分枝杆菌感染由于出现特种加工在过去几十年。

1。介绍

结核病是一个重大的公共卫生问题共有920万例新病例和170万人死于结核病(TB)在2006年。印度占全球结核负担的五分之一(2008),已在上升由于耐多药和高度的毒性菌株结核分枝杆菌(快艇)[1)和艾滋病的综合效应。一个准确的诊断肺结核是可取的抗结核治疗开始前(2]。的实验室诊断快艇根据抗酸的芽孢杆菌(AFB)在24 h涂片可以产生一个结果。然而,涂片不是非常具体快艇还需要10³到10⁴每毫升唾液微生物。细菌涂片文化优于空军基地,无论是敏感性和特异性。但是,由于分枝杆菌增长有非常严格的要求,培养的诊断方法是缓慢的。此外,涉及放射诊断检查和结核菌素试验有助于检测疾病在某种程度上,但是不是很可靠的肺外结核病。BACTEC系统,给出了一个非常快速的结果相比,文化,但它是昂贵的,包括处理放射性同位素(BACTEC 460)。的荧光BACTEC MGIT 960是快速,高效,敏感但昂贵的用于贫穷经济体。针对这些,准确和早期诊断肺结核(TB)是一个关键的步骤,它管理和控制结核病。聚合酶链反应迄今为止一直是非常有用的工具,用于快速检测分枝杆菌DNA在临床标本如痰、支气管灌洗,脑脊液(CSF)和腹水。然而,内部测试相差很大的准确性和导致异质性在测试精度的因素,并不是研究的很透彻了。确诊的肺结核和mycobacterioses复合菌群(非结核分枝杆菌(特种加工)感染)一直是一个严重的问题。 These methods also have their own limitations due to region-specific variations in the genome of mycobacteria [3- - - - - -5]。我们的研究描述了PCR试验使用快艇-complex-specific DNA标记包括165、365和541个基点的目标片段的三个不相关的基因,也就是说,hsp 65、dnaJ和插入元素是6110分别的结核分枝杆菌在肺结核疑似病人从加尔各答,印度。考虑增加分枝杆菌感染造成特种加工的出现在过去的几十年中,也需要一个方法,可以检测任何根深蒂固的分枝杆菌生物存在于少量疑似临床样本无论分枝杆菌物种关系。

2。材料和方法

2.1。主题

研究样本肺结核疑似病例参观胸部加尔各答国立医学院和医院门诊部(CNMCH)。本研究机构的伦理委员会批准,所有受试者签署知情同意文件之前进入本研究。共有60个主题,包括疑似病例和健康对照组进行了研究。怀疑是结核病例进一步分为三组(组》)基于实验室诊断结果(AFB-smear、文化和antero-posterior胸透),临床症状,和过去的历史。研究对象的临床和人口数据表中给出1。五到十毫升的清晨痰样本收集的所有科目。所有的样品都涂抹和筛选Ziehl-Neelsen酸快速染色法等传统的微生物测试记录涂片Lowenstein-Jensen偏上培养的积极性,进一步根据标准方法。组我)的情况下,也被涂片Ziehl-Neelsen染色和积极的文化积极的,而第二组()涂片阴性但文化和放射检查阳性样本。在某些患者(),实验室诊断快艇感染消极,但根据其临床症状,他们被认为是其他呼吸道疾病(PTB)或mycobacterioses(第三组)。然而,这些病人没有任何历史的结核病和后续治疗。健康对照组(指定为Gr四世)没有临床症状和历史和被诊断为阴性快艇感染(细菌消极的)。所有的60个样本由PCR方法进行了进一步的分析。

2.2。隔离从痰标本的DNA

痰液样本被DNA分离净化后根据以前公布的方法(6]。

2.3。PCR扩增

PCR扩增目标两个保守区域和分枝杆菌基因组插入元件之一。165个基点守恒的区域的基因编码65 k道尔顿的抗原蛋白结核分枝杆菌放大使用引物组发布之前(7]。同样,地区365个基点(序列之间的位置,1377 - 1741年)dnaJ基因的结核分枝杆菌被放大使用前面描述genus-specific底漆Takewaki et al。(1993)8]。在插入元素IS6110地区541个基点结核分枝杆菌使用寡核苷酸指定为Pt-8放大和Pt-9 Kox et al . 19949]。10毫升的放大PCR产品分馏electrophoretically 2%琼脂糖凝胶,用溴化乙锭染色的,可视化在UV-transilluminator的准确性和特异性PCR扩增,使用PhiX174 HaeIII消化基因的统治者。所有的PCR扩增受到内部使用模板DNA实验室标准化结核分枝杆菌参考应变H37Rv积极控制(图1)。简单地说,50 - 100 ng纯化总细胞的DNA与耐热性的Taq放大DNA聚合酶基因Amp PCR系统9700(应用生物系统公司,培育城市,CA)。建立积极,我们添加了50 uL的反应混合物包含10毫米Tris-HCl (pH值8.3),MgCl 50 mm氯化钾,1.5 - -2.5毫米₂,0.01% (w / v)明胶,20 - 50 pmol各自的引物(前面描述),2.0 - -2.5 nmol每个四deoxynucleoside的三磷酸腺苷(dATP、dCTP dGTP和dTTP), 1 U的Taq DNA聚合酶(应用生物系统公司,培育城市,CA)。PCR循环条件轻微修改之前发表的一个165个基点hsp基因片段(94°C 20多岁变性DNA,然后冷却到63°C 20年代,加热到72°C扩展为1分钟,重复30次循环最终孵化72°C 10分钟),365个基点dnaJ基因片段(94°C 30年代变性的DNA,然后冷却到65°C的60年代,加热到72°C扩展为2.5分钟,与最终孵化周期重复35次10分钟72°C)和541个基点IS6110序列(94°C 60年代变性DNA,然后冷却到65°C 1.5分钟,加热到72°C扩展为3.5分钟,最终孵化周期重复38次10分钟在72°C)的分枝杆菌DNA。图2显示所有上述遗传标记的扩增临床样本。

2.4。统计分析

敏感性,特异性,阳性预测值(PPV)以及阴性预测值(NPV)和卡方测试计算使用ACASTAT软件(10]。的结果卡方测试和值是未修正的,除非另有指示。一个值≤0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

60的研究样本,26日被诽谤Ziehl-Neelsen染色阳性,也是文化积极(Gr)。我们发现22个样品的Gr我积极的PCR (84.62%)。的15个样本组II(涂片阴性但文化和放射检查阳性),11(73.33%)样品结果积极的PCR方法。因此,我们基于trimarker系统聚合酶链反应检测33例(80.5%)阳性的病人41(结合Gr I和II)。我们还发现7样品(77.78%)的9集团积极为365个基点dnaJ基因(但不是休息两个基因)表明他们可能例mycobacterioses但不是肺结核。在控件(Gr四世),没有一个是PCR阳性的任何3标记用于这项研究。然而,Gr我有4个样品和2 Gr二世,这可能不被放大IS6110,可能由于PCR抑制剂的存在。同样的,2样品Gr二世并没有扩大hsp 65基因标记。Gr III的PCR扩增结果清楚地表明杆菌复合菌群感染非结核分枝杆菌。本研究的特异性为80%,敏感性(Gr.II) 73.33%到84.61%不等(Gr.I)。此外,PPV和NPV分别为77.78 -91.67%和66.67 -80%,分别。涂片和培养方法相比,结果具有统计学意义(和、职责),表明PCR技术检测结核有更高能力所致结核分枝杆菌复杂。这项研究的结果发表在表2,3,4。

4所示。讨论

肺结核是一种高度传染性疾病,主要流行在印度,但仍然需要明确诊断的问题。PCR扩增的分枝杆菌DNA是一个高度敏感的和特定的技术来检测结核病。这表现也优于涂片(需要> 10000杆菌/毫升样品检测)以及培养法(限制生长条件)。在这些情况下,PCR可以帮助诊断是否积极(涂片或文化)是由于快艇复合菌群细菌或其他非结核感染。负Ziehl-Neelsen染色,PCR有助于确诊。我们的数据清楚地表明,有一个显著区别涂片和聚合酶链反应(文化和PCR之间)和()方法,进一步表示PCR方法已被证明比涂片和培养方法。然而,很多分枝杆菌PCR分析用人种特异的引物可以检测单一或分枝杆菌物种的数量有限11- - - - - -16]。任何快速诊断PCR方法的效率和成功取决于适当的DNA序列选择放大目标。在这项研究中,标记系统选择理想的适用于大多数的分枝杆菌物种(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌卡介苗,m . africanum和m . microti)快艇复杂。这种方法的成功探测和识别的分枝杆菌进一步增加由于包含一个目标序列(dnaJ基因)特种加工。最近公布的一项荟萃分析(17证明使用IS6110作为目标的放大显著增加的准确性pcr检测测试。然而,尽管这个序列中存在多个副本在细菌基因组中,一些来自世界某些地区的菌株缺少它18,19),这可能会导致假阴性结果进一步影响的敏感性分析。这个问题可能的解决方案是放大超过一个目标序列。因此,我们也使用165年和365年英国石油公司在我们的研究目标DNA序列。365年英国石油公司dnaJ基因标记genus-specific,有更广泛的频谱检测和可以被放大分枝杆菌复合菌群(包括非结核和非致病性)物种,而541个基点IS6110和165 bp 65 kDa抗原蛋白基因序列是amplifiable从几乎所有的分枝杆菌物种快艇复杂的(但不是从特种加工)7,9),因此会计更高的灵敏度。到目前为止没有一个目标序列提供了100%的敏感性和单独使用时总没有假阳性。也观察到多重PCR并不有助于提高诊断准确性在大型荟萃分析研究[17]。我们trimarker基于PCR方法能敏感和专门检测临床上重要的分枝杆菌感染等结核分枝杆菌,结核分枝杆菌复杂的非结核分枝杆菌(特别是牛分枝杆菌)和区分的主要致病特种加工和非病原的分枝杆菌。因此,该方法提供了一个快速和有效的技术诊断结核感染和区分从其他分枝杆菌感染为了帮助病人更好的管理。然而,由于一些样品不能适当地放大特定的DNA序列在这项研究中,重要的是要考虑PCR抑制剂的敏感性分析可以进一步提高这类抑制剂的有效控制。

5。结论

这项研究提出了一个基于trimarker PCR技术,它也适用于各种各样的临床样本,因此评估作为一种有用的技术在肺结核的诊断。这个方法是非常有用的在这种情况下,Ziehl-Neelsen染色和/或文化的结果都是负面的。包括一个相对特定的标记(365个基点dnaJ基因),这也促进了歧视的PCR方法快艇complex-specific复合菌群感染非结核或不致病的分枝杆菌感染。DNA扩增可以检测分枝杆菌DNA序列中多余数量的人类DNA的存在使得它特别有用在某些临床情况下当需要立竿见影的效果。大规模筛选时这也可能是有用的分枝杆菌是必需的,比如在部分国家,结核病仍然是流行和仍然是一个主要的公共健康问题。

确认

作者表达自己真诚的感谢博士r . Trivedi她的建议。Indranath Ghosh博士为他协助收集临床样本,和s . k .萨哈博士为他的巨大帮助诊断和分类的研究对象。a·辛格是法医科学理事会的感激,民政、印度政府,高级研究奖学金。这项工作由财政拨款支持中央法庭科学实验室,加尔各答下印度政府的五年计划。作者没有利益冲突声明。

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