抑制生产伊诺的小鼠J774巨噬细胞通过一个发生phoP监管NF的微分表达式κB和AP-1

文摘

背景。没有报告数据来解释沙门氏菌在巨噬细胞或抑制亚硝酸盐离子生产这种现象是否独特typhoidal或non-typhoidal型。因此,本研究的目的是调查这些现象。方法。我们测量的生存美国沙门氏菌感染14028及其在小鼠J774 phoP突变体巨噬细胞,培养有或没有干扰素γ。我们比较的表达诱导一氧化氮合酶(间接宾语)mRNA和蛋白,和亚硝酸盐离子生产还研究了绑定的核因子B (NFB)和激活蛋白1 (AP-1)巨噬细胞DNA。结果。美国沙门氏菌感染14028年抑制NF的绑定B和AP-1在小鼠J774 DNA。巨噬细胞通过一个完整的phoP调节子。这与增加生存和减少伊诺表达式。抑制NFB活动是改善与干扰素-巨噬细胞培养γ这与伊诺mRNA的表达和亚硝酸盐离子生产增加,虽然干扰素-γ没有影响AP-1 / DNA的相互作用。我们显示,但有一个例外,抑制伊诺typhoidal特有型。结论。美国沙门氏菌感染抑制NFB和AP-1与巨噬细胞DNA通过PhoP调节子,这降低了亚硝酸盐离子生产和主要与typhoidal型。

1。介绍

美国沙门氏菌感染感染的老鼠是一个标准的实验室模型对人类伤寒,和以前的研究已经表明美国沙门氏菌感染突变体小鼠巨噬细胞无法生存的无毒(1]。因此,生存沙门氏菌在巨噬细胞似乎是一个关键的步骤,伤寒的感应。的沙门氏菌phoP / phoQ调节子调节基因位于沙门氏菌致病性岛2 (SPI-2)编码的生存所需的蛋白质沙门氏菌在巨噬细胞(2),Salmonellae哪有突变phoP / phoQ调节子在小鼠无毒(3]。的影响phoP在沙门氏菌生存是多方面的,但研究Svensson et al。4)表明,phoP突变引起亚硝酸盐离子生产增加了巨噬细胞与亚硝酸盐离子生产由亲本菌株,但本研究没有探讨这种现象背后的机制。研究使用和老鼠表明,活性氮物种(RNS)在控制很重要沙门氏菌在感染之前,这是活性氧(ROS)端依赖控制阶段(5,6),也知道一氧化氮增加细胞酸的敏感性phoP突变体(7]。综合这些研究表明的能力沙门氏菌抑制亚硝酸盐离子生产由宿主巨噬细胞的影响可能是由于SPI-2蛋白质的控制下phoP这带来的生存优势沙门氏菌在某种程度上感染,但潜在的感应机制尚未报道。

例如,核因子k B (NFκB)和激活蛋白1 (AP-1)都是已知的转录伊诺基因(8,9),但没有报道关于这些转录因子的活性与野生型或伊诺和上下文phoP突变体沙门氏菌。此外,没有报道比较typhoidal和nontyphoidal之间沙门氏菌型对伊诺抑制。

本研究的目的是研究野生型的影响沙门氏菌和phoP突变体在NFκB和AP-1活动及其随后的下游效应使用伊诺作为生物读出。我们也比较型的影响导致伤寒与那些没有老鼠。

2。材料和方法

2.1。细菌培养和紧张

细菌生长在Luria Bertani(磅)肉汤(生命科技有限公司,佩斯利,英国)18 h在37°C下风潮。细菌被亚文化在新鲜磅4 h后期日志阶段(由常规项建立cfu /毫升)。与J774.2细胞孵化之前,细菌被调整到感染复数(moi) 10。在这个研究中,以下压力/突变体被使用:美国沙门氏菌感染14028(写明ATCC应变),美国沙门氏菌感染CS022 (phoP14028年变异,s·米勒博士的礼物,华盛顿大学,美国),不生存在巨噬细胞10]。在另一项研究中,其他小鼠typhoid-inducing(的影响美国沙门氏菌感染4/74,美国肠炎KMS1977,都柏林美国2229年,美国choleraesuisA50)和nontyphoid诱导菌株(美国gallinarum9日,美国kedougou全科医生,美国蒙得维的亚公里)进行了分析。为每个型增长曲线得到如前所述。

2.2。细胞培养

J774.2细胞种植在96孔板的融合(美国Nunc Naperville, IL)包含RPMI 1640媒体37°C有限公司₂(5% v / v)。细胞被洗了三次磷酸盐(PBS),删除媒体和不依从细胞,孵化在PBS 22°C感染前15分钟。细胞通道,4-16之间,是本研究中使用。

2.3。亚硝酸盐离子浓度的测量

亚硝酸盐离子浓度在J774.2上层清液被格里斯试剂测量工具(WI Promega,麦迪逊,美国)按照制造商的说明书。简单地说,50μ50 L的上层清液混合着μL磺胺的解决方案和孵化22°C在黑暗中10分钟。50μL (napthyl乙二胺的解决方案是添加和孵化进一步10分钟和板的反应是读读者(Anthos Labtech仪器,汉堡,德国)在550海里。亚硝酸盐离子浓度是由与亚硝酸盐离子标准曲线的极限1000 - 5μM。

2.4。采用伊诺的分析表达式

伊诺在感染和未感染的J774.2细胞的活动是由标准采用的方法。沙门氏菌来华的细胞,或没有与100 U /毫升IFN -孵化γ洗,自由的媒体和permeabilised在环境温度为10分钟后在0.05% v / v Triton x - 100 2, 7日,12日和24 h postinfection。细胞被固定15分钟的5% v / v多聚甲醛在PBS的环境温度和清洗。固定细胞培养在黑暗中在一个端到端的瓶60分钟在4°C鼠标anti-iNOS免疫球蛋白(Autogen Bioclear,英国)PBS-Tween 20 (0.02% v / v渐变,PBS-T)给最后一个抗体浓度的1/100。PBS-T细胞被洗了三次,在相同条件下孵化,但二级anti-mouse抗体结合异硫氰酸荧光素(FITCσ)。样本在TCS NT共焦激光扫描显微镜观察配备一个氩激光器(徕卡,剑桥郡,英国)。控制包括J774.2细胞没有感染或与干扰素-孵化γ也未感染细胞与100 U /毫升IFN -孵化γ。

2.5。西方墨点法

进气阀打开蛋白质的表达沙门氏菌来华J774.2细胞被西方墨点法评估。J774细胞细胞溶解在冷水中含有蛋白酶抑制剂(抑肽素1μg / mL;氟化phenylmethylsulphonyl 1毫米和亮抑酶肽10μ米)(σ)和蛋白质浓度测定用bicinchoninic酸(BCA)试验(皮尔斯,英国柴郡,)。10μg / mL J774.2蛋白质是由标准方法在两个10%丙烯酰胺凝胶电泳跑背靠背。在蛋白质加载测试平价,凝胶是沾Coomassie蓝色而蛋白质第二凝胶被转移到Hybond-C硝基纸(Amersham,白金汉郡,英国)Trans-blot SD,半干转移细胞(Bio-Rad,赫特福德郡,英国)。硝基被封锁在室温下为60分钟PBS-T包含牛血清白蛋白(5% w / v,σ)。阻塞后,硝基被3 * 5分钟在室温下在一个端到端的PBS-T瓶。60分钟的硝基被孵化PBS-T包含1/200稀释anti-mouse伊诺(英国Autogenbioclear),洗的三倍和孵化前60分钟在室温下PBS-T包含兔子anti-mouse免疫球蛋白结合辣根过氧化物酶(σ,1/12000稀释)。硝基然后洗,使用一个增强开发3′,3′diaminobenzidine (DAB)工具包(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)。

2.6。伊诺mRNA表达

伊诺表达J774.2细胞感染沙门氏菌是衡量逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)使用之前报道的方法11]。简单地说,J774细胞悬浮在3毫升三试剂(σ)和存储在-70°C到所需(14天)内使用。样本在12000 g离心10分钟在4°C台式离心机。上层清液被转移到独立的管,每毫升200毫升氯仿添加三试剂孵化前10分钟22°C。样品当时离心机在12000 g和4°C,持续15分钟,水相被免职,同等体积的propan-2-ol是补充道。样品在10分钟12000克、离心机和RNA颗粒被1卷75%乙醇的混合物:1卷无菌水。混合物在7500克,然后离心10分钟,去除浮层后,颗粒被允许进一步10分钟的风干。焦碳酸二乙酯的颗粒被resuspended处理过的水。RNA纯度测定使用Ultraspec三世分光光度计(法玛西亚,赫特福德郡,英国),发现有一个典型的260/280 nm的比率1.9给收益率约为100μ克/毫升。RNA浓度调整为1μ克/μL RT前的反应。RT反应进行热循环(埃普多夫,汉堡,德国)使用以下之前报道(11引物序列:转发:5′gta AAC TGC亚美大陆煤层气有限公司AGA ACG GAG AAC-3′。反向:3′gag CTC CTC CAG gg GGT AG-5′。加载控制,以下glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPdh)引物序列被使用:转发:5′gtt CAG CTC TTG手枪广汽CTT gcc 3′。反向:3′太极拳TGC ACC ACC AAC TGC TTA GCC-5′。

2.6.1。制备的核溶解产物

核细胞溶解产物是由刮到5毫升PBS和洗一次缓冲区我(玫瑰10毫米,氯化钾10毫米,MgCl₂1.5毫米,pH值7.9)。细胞冻融破坏了两次1毫升缓冲区包含诺乃清洁剂p 40 (NP-40)(5%,σ)。所有后续在4°C程序进行。溶菌产物离心5分钟在桌上型microfuge 2000 rpm。缓冲区的颗粒就洗两次我和NP-40之前在12000转离心5分钟获得核子弹。颗粒的核蛋白质提取10和30 - 40分钟μL提取缓冲(消息灵通的20毫米,氯化钠420 mM, MgCl₂1.5毫米,EDTA 0.2毫米,25%的甘油,pH值7.9)。混合后,暂停离心机如上所述的两倍。未来的上层清液被稀释μL稀释缓冲(消息灵通的20毫米,氯化钾50 mM, EDTA 0.2毫米,甘油20%,pH值7.9)。蛋白酶抑制剂(抑肽素1μg / mL, phenylmethylsulphonyl氟1毫米,亮抑酶肽10μ米,σ)被添加到溶解产物当时立即使用或储存在-70°C 14天。

2.6.2。情况变化分析(EMSA)

EMSA被用来确定NF的DNA结合κB (p50)和激活蛋白(美联社)1 (c-Jun)感染后J774.2 DNA沙门氏菌和/或孵化与干扰素γ(100 U /毫升)。EMSA反应是使用一套执行按照制造商的说明书(美国Promega)使用以下寡核苷酸序列:

AP-1 (c-Jun)5′公司治理文化TTG ATG AGT CAG亚美大陆煤层气有限公司GAA-3′3′gcg AAC TAC柠檬酸GTC GGC CTT-5′

NFκB (p50)5′agt TGA GGG广汽TTT CCC gg颈- 3′3′柠檬酸法CCC CTG AAA GGG太极拳g5′设备控制包括海拉细胞与共识的核溶解产物低聚糖(积极控制)和海拉细胞的核溶解产物没有共识益生元(负控制)。作为额外的负控制,J774.2细胞没有感染或与干扰素-孵化γ被使用。

数字图像分析使用凤凰1 d分析器使用权力扫描仪V.3 (Phoretix、纽卡斯尔、英国)。

2.7。统计分析

Mann-Whitney分析(一款统计软件)是用来测量之间的显著差异在95%置信上限之间的不同的测试组和测试组在不同时间点相同。

3所示。结果

3.1。的影响沙门氏菌phoP在小鼠生存和亚硝酸盐离子生产J774.2细胞

亚硝酸盐离子生产由巨噬细胞显著(低时,与野生型细胞培养美国沙门氏菌感染14028年与14028年相比,亚硝酸盐离子由巨噬细胞培养生产phoP突变体。然而除了干扰素-γ文化媒体显著增加()亚硝酸盐离子浓度在上层清液从野生型和中恢复过来phoP培养的巨噬细胞(图1(一))。

14028恢复野生型巨噬细胞的数量也在1 - 2之间日志12 - 24 h后更大的文化相比,14028年的数字phoP突变体从细胞同期(图中恢复过来1 (b))。当巨噬细胞与干扰素cocultured -γ,14028恢复野生型细胞的数量减少,堪比14028年的数字phoP突变体在同一时间段(图中恢复过来1 (c))。

3.2。的影响沙门氏菌phoP伊诺mRNA和伊诺J774.2细胞蛋白表达

伊诺mRNA表达增加巨噬细胞培养中发现了14028年phoP突变体与14028年相比野生型沙门氏菌在这两种情况下伊诺信使rna信号被coculture干扰素,增加γ(100 U /毫升)(图2(a))。然而,当调整GADPH表达式,伊诺mRNA表达,在J774细胞,诱导干扰素-γ和14028年野生型,仍略低于被干扰素诱导-γ一个人。

共焦显微镜数据也清楚地表明phoP突变(图2(d))引起了更强烈伊诺J774.2细胞的细胞质蛋白质信号相比,感染巨噬细胞(图的控制2(b))或野生型14028 -感染细胞(图2(c))。伊诺信号的强度增加了共培养的巨噬细胞与野生型14028和干扰素-γ(图2(e))和更激烈的14028年培养的巨噬细胞phoP突变体和干扰素-γ(图2(f))。获得的结果通过共焦也重复西方墨点法(图2(g)),在这种情况下J774 14028野生型和干扰素-培养细胞γ产生更大的进气阀打开蛋白质J774细胞培养相比,只有干扰素-γ。

3.3。的影响phoP突变对NFκB和AP-1绑定到巨噬细胞DNA

我们的结果表明,突变沙门氏菌phoP调节子NF的数量增加κB和AP-1绑定2 h后巨噬细胞DNA,与野生型相比14028(图3(一个))。积极控制相比,NFκB / DNA相互作用14028年野生型感染平均降低了68%,但当被感染的巨噬细胞培养干扰素-γ(100 U /毫升),NFκB / DNA相互作用降低了42%(图3(一个))。相比之下,当巨噬细胞感染了14028人phoP突变体,NFκB / DNA相互作用只是减少了平均22%(相对于积极控制)和共培养后保持常数与干扰素-感染细胞γ(图3(一个))。与野生型巨噬细胞培养后14028年12 h, NFκB / DNA相互作用降低了平均66%,但当被感染的巨噬细胞被干扰素-培养γ,NFκB / DNA相互作用降低了76%(图3 (b))。当巨噬细胞被感染12 h和14028phoP突变体,NFκB / DNA相互作用只是减少了40%(相对于积极的控制),这也与干扰素-感染细胞的共培养后保持不变γ(图3 (b))。

14028年巨噬细胞感染与野生型2 h,结果AP-1 / DNA结合相当于那些没有获得负控制寡核苷酸(相比减少92%的DNA结合积极控制),这是改变很少通过coculture干扰素-γ(阳性对照相比减少88%)(图4(一))。然而,当巨噬细胞感染了14028人phoP突变体2 h, AP-1 / DNA结合只是相对于积极的控制和减少39%这个水平是保持与干扰素-共培养后γ(图4(一))。

与野生型巨噬细胞培养后14028年12 h, AP-1 / DNA相互作用增加了相对于62.9%的积极控制和减少AP-1 / DNA相互作用进一步提高培养后被感染的巨噬细胞与干扰素-γ12 h,平均减少55%(相对于积极控制)测量(图4 (b))。然而,14028年巨噬细胞感染AP-1 / DNA相互作用phoP突变体12 h只减少了53%相比,积极控制,但与干扰素-共培养后γAP-1 / DNA相互作用提高平均只有21%的减少相对于积极的控制(图4 (b))。

3.4。沙门氏菌型的诱导鼠伤寒抑制亚硝酸盐离子生产

当巨噬细胞培养沙门氏菌型来诱导鼠伤寒,亚硝酸盐离子浓度减少相比在细胞上清液上层清液从巨噬细胞分离培养与nontyphoidal菌株在同一时期(图5)。然而美国Choleraesuis诱导鼠伤寒而闻名,是一个例外,因为它刺激亚硝酸盐离子生产由巨噬细胞在相似的水平测量在上层清液从巨噬细胞分离培养与nontyphoidal型(图5)。

4所示。讨论

埃里克森et al。12)曾报道,hyper-survival突变体美国沙门氏菌感染TT16729,得到多个通过J774细胞,诱导降低亚硝酸盐离子浓度比父母压力,尽管一个减毒沙门氏菌突变体并不是比较的研究。然而,Svensson et al。4报道称,野生型美国沙门氏菌感染低14028诱导亚硝酸盐离子生产小鼠骨髓巨噬细胞相比,一个派生而来美国沙门氏菌感染本构突变体,但生存的phoP只是略微不同(< 0.5日志)14028年野生型。与这个结果,我们表明,存活率有明显增加的14028相比,其野生型phoP在J774.2巨噬细胞突变。然而,我们观察到的差异可能可以因细胞类型不同,或我,自从我们在10:我是恒定的,而先前的研究使用14028的莫伊15:1,莫伊的17:1 (4]。与这些研究相反,一项由Das et al。13)表明,在小鼠巨噬细胞细胞株RAW264.7,野生型沙门氏菌抑制干扰素-γ通过毒性基因nirC全身的生产,这与增加细胞的生存。然而我们的研究表明,伊诺mRNA,伊诺蛋白质,和亚硝酸盐离子生产时增加野生型14028 - J774感染细胞干扰素培养γ但总体来说野生型感染细胞引起较弱的反应比14028phoP来华的巨噬细胞,这发生在干扰素的存在与否γ。我们还发现,14028年野生型和14028年phoP外源亚硝酸盐离子比较敏感,如细菌生长曲线所示获得在不同亚硝酸盐离子浓度(数据没有显示)。没有生产的抑制作用可能通过伊诺抑制可能感染相关性在如图所示的Mastroeni et al。5)或者也有可能抑制伊诺本身(而不是下游没有)可能直接对其他因素的影响。例如,iNOS-dependant诱导8-nitroguanosine 3′, 5′环一磷酸(8-nitro-cGMP)诱导血红素加氧酶1所示(HO-1)既有cytoprotective和抗菌效果在鼠沙门氏菌病(14]。没有生产也可能增强其他抗菌通路,与活性氧(例如,通过互动15]。

我们的研究也试图联系改变进气阀打开两个关键转录因子的活动(NFκB和AP-1)感染J774巨噬细胞,有或没有培养与干扰素-γ。伊诺基因曾被证明是由核转录因子k B (NFκB) (p50/65) [16),可以把细胞核后刺激干扰素(IFN -γ)[17,18),这可能协同作用与细菌脂多糖(LPS),根据相对浓度(19]。

以及NFκB结合位点,基因启动子序列在小鼠伊诺也包含AP-1和干扰素-结合位点γ响应元素(γ愤怒)((8)综述(20.])。然而,AP-1激活期间沙门氏菌入侵巨噬细胞尚未全面研究但时间变化heterodimeric AP-1在小鼠巨噬细胞的文化结合美国沙门氏菌感染有限合伙人或名叫已报告(21]。

我们的数据是有趣的原因;首先我们表明,野生型14028抑制NFκB / DNA相互作用在第一2 h postinfection J774巨噬细胞,但这不是时的情况phop突变是引起。这表明,抑制NF的能力κ因此,B活动phoP端依赖。然而,NF固有的抑制κB活动14028年野生型巨噬细胞在培养时克服干扰素-γ,这是符合一项研究已经表明,干扰素-γ抑制phoP在野生型转录沙门氏菌(22]。NF的交互κB与巨噬细胞的DNA也进一步降低14028年12 h与野生型文化和培养干扰素-γ没有影响,而phoP突变体保持相对强劲NFκB / DNA相互作用(虽然这也是NF相比减少了一半κB / 2 h后DNA相互作用测量)。这些结果表明,一个完好无损phoP调节子促进NF的能力将发生重大变革κB与DNA相互作用,这可能产生重大影响的伊诺抑制我们观察到在野生type-infected细胞。01 et al。23)表明,干扰素-γ诱发核易位干扰素调节因子1 (IRF-1),然后把NFκB抄写进气阀打开。因此,它是可能的,这是一个额外的机制干扰素-γ伊诺转录增加在我们的研究中,以及增加NFκ我们展示了B / DNA交互。

然而,我们的研究也表明,有时间分离NF的感应κB / DNA相互作用和AP-1 / DNA相互作用在14028年野生型感染的巨噬细胞,但这不是观察到巨噬细胞感染了14028人phoP突变体。14028年2 h与野生型postinfection之后,没有任何可见的AP-1与巨噬细胞相互作用DNA测量但12 h后感染后AP-1 / DNA相互作用测量,这是细胞被干扰素-培养时增加γ,虽然这是平均55 - 63%低于测量积极控制。相比之下,与14028年巨噬细胞培养时phoP突变体,AP-1 / DNA相互作用只有53%低于积极控制但当细胞被干扰素-培养γAP-1 / DNA结合只有21%低于积极控制。这些结果也表明,一个完好无损phoP调节子阻止长期互动的AP-1 DNA和干扰素-γ增加全身AP-1 / DNA相互作用(与NF一样κB)。我们因此建议的影响phoP调节子,防止长期和强相互作用与NF巨噬细胞的DNAκB和AP-1和干扰素-γ刺激upregulation伊诺的相互作用将产生深远的影响表达和亚硝酸盐离子生产通过减少暴露伊诺启动子序列在巨噬细胞内DNA对这些重要的转录因子。

没有以前公布的数据存在伊诺活动相比,亚硝酸盐离子在小鼠巨噬细胞培养生产typhoidal和non-typhoid沙门氏菌型。然而,艾森斯坦et al。24)表明,美国沙门氏菌感染和都柏林美国小鼠脾细胞抑制亚硝酸盐离子生产,虽然该研究至少考虑不同伤寒诱导型,比较typhoid-inducing和non-inducing型没有报道。我们的研究是一个奇怪的例外美国choleraesuis未能通过巨噬细胞,调节亚硝酸盐离子生产。美国choleraesuis导致更大范围的typhoid-like系统性疾病比做哺乳动物宿主美国沙门氏菌感染,都柏林,或美国肠炎(25),我们不能,到目前为止,解释为什么这型不下来调节进气阀打开。然而,所有其他typhoid-inducing型能够抑制亚硝酸盐离子生产小鼠巨噬细胞而不引起伤寒无法这样做。这可能表明typhoid-inducing的能力沙门氏菌可以使传播更深层的组织,通过吗phoP全身抑制NFκB和AP-1伊诺和随后的镇压。

我们的数据可能在未来相关治疗伤寒的人类,因为它表明辅助使用干扰素-可能的作用γ(抗生素)克服phoP -伊诺抑制的依赖。因此,增加所需的重要转录因子核易位伊诺基因的转录和亚硝酸盐离子生产。

利益冲突

作者没有利益冲突。

作者的贡献

美国休姆EMSA执行分析和参与其他实验程序。p·巴罗coconceived的学习和参与其设计和协调,帮助起草最后的论文。n .培养进行分析(EMSA除外),所有coconceived的研究中,参与其设计,帮助起草最后的手稿。所有作者阅读和批准了期末论文。

确认

作者要感谢伊莱恩·班纳特与细胞培养寻求帮助。这项工作是由欧盟支持格兰特(公平,98 - 4006年)和美国食品、环境和农村事务部,英国。

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