文摘
本研究旨在检测耐药性的流行血清型的大肠杆菌印度科钦河口。大肠杆菌菌株分离自2010年1月- 2011年12月期间从五个不同的电台组在科钦河口。从五个不同的电台在科钦河口水样收集每月一段两年。分离血清型,antibiogram-phenotyped十二抗菌药物,基因分型的聚合酶链反应uid遗传密码的基因β-D-glucuronidase。这些大肠杆菌菌株从科钦河口与十二抗生素进行测试,以确定多种抗生素耐药性的流行。结果显示,超过53.33%的隔离是多种抗生素耐药。十三隔离显示抗磺胺类,其中两个包含了南1基因。第1类整合子中发现两个大肠杆菌菌株耐抗生素超过7。在目前的研究中,O血清型,抗生素敏感性,和聚合酶链反应了的目的建立多个耐药血清型分布现状,联系在一起大肠杆菌孤立的从科钦河口的不同部分。
1。介绍
的出现大肠杆菌隔离与多个耐药表型,涉及coresistance无关的四个或更多家庭的抗生素,之前已经报道过了,被认为是一个严重的健康问题1- - - - - -3]。抗菌素常用于治疗感染人类和动物以及预防和增长促进食品生产的动物。许多研究结果表明,选择和滥用抗菌素不足可能会导致电阻在不同的细菌和细菌感染的治疗更加困难(4]。抗菌药物可以在污水废水,特别是在这些药物是广泛使用的地方,如医院、药品生产工厂,农场动物饲料含有这些代理。有人建议,耐药性细菌种群可能从一个生态系统传播到另一个(5]。抗菌素耐药性的野生传播细菌人群越来越全球问题。
抗菌素耐药性的大肠杆菌据报道全世界。治疗大肠杆菌感染日益复杂,大多数一线抗菌药物耐药性的出现,包括氟喹诺酮类原料药(6]。磺胺甲恶唑和甲氧苄氨嘧啶(复方磺胺甲恶唑)仍然是常用的在人类医学治疗尿路感染(7]。抵抗至少两类抗菌药物大肠杆菌现在是一个普通的发现在人类和兽医,越来越影响可用的治疗选项。
血清学分型的检测致病性抗原是一种非常有用的方法大肠杆菌株在临床标本、食物和环境样品和理解病原体的流行病学8]。根据考夫曼修改方案,大肠杆菌是血清型的基础上其O(体),H (H)和K(荚膜)表面抗原的概要文件9]。共有170个不同的O抗原,每个定义一个血清群,是目前公认的。O抗原,作为有限合伙人的一部分(脂多糖)革兰氏阴性细菌的外膜,是一个主要的目标免疫系统和噬菌体bacterium-host相互作用中起着重要的作用。它是一种最变量细胞成分也扮演着重要的角色在毒性10]。
科钦河口,Vembanad湖的一部分,一个重要的湿地网站支持良好的贝类和长须鲸渔业。科钦河口,一个典型的热带河口,在过去十年里经历了相当大的污染产生的主要来自河口的卫星城镇的发展。房地产行业的发展主要是作为水公寓前面有巨大的需求。大部分的市场定位的海岸河口释放废水直接进入自然水体。大肠杆菌作为一个典型的粪便指示生物提供了杰出的方法来观察有机污染发生在科钦的河口。由于河口支持良好的贝类和长须鲸资源,形成大量的人民的生命线直接和间接地取决于它钓鱼,休闲,交通。日益流行的致病性大肠杆菌与多个抗生素耐药性可能影响到鱼类和贝类收获从河口间接影响人们的健康。本研究进行了一个客观的估算的多样性大肠杆菌血清型从科钦河口和他们带来的风险评估抗生素耐药性。
2。材料和方法
2.1。研究区域的描述
水从五个不同的样本收集站在科钦河口(图1)。车站选择基于他们亲近卫星城镇和浪费的输入。的两个电视台如Chittoor(1站)和Thevara(4站)是固定的上游,两个在河口的核心部分,即Bolgatty(站2)和海洋科学码头(站3),和一个Barmouth抽样电台(站5)。在科钦河口及周边固定他们怀疑接受高水平的污水输入。
2.2。收集的样本
水从五个不同的样本收集月度站在科钦河口一段两年的时间从2010年1月至2011年12月。水在无菌塑料瓶收集的样本(Tarson、印度)表面下一只脚的为了更好地表示水柱。水样本送到实验室的一个冰盒并受细菌检查在四个小时内的集合。
2.3。分离、鉴定、血清型大肠杆菌
样本分析粪大肠菌的最有可能的数量方法。最可能的(或然数)负载粪便大肠杆菌细菌的数量取决于三管使用MacConkey肉汤稀释法作为媒介。10毫升,1毫升,0.1毫升的水样本接种到各自的稀释管包含反向杜伦的管。接种管在37°C孵化24小时,观察到增长和天然气生产。隔离的大肠杆菌,一个铂环量从正面MacConkey肉汤管文化被飞跑到伊红美蓝(EMB) Hi-Media,印度板块和孵化在37°C 24小时。孵化后,盘子被检查,典型大肠杆菌-如选择殖民地和亚文化。隔离都提交给生化筛查包括吲哚试验、甲基红试验、柠檬酸Voges-Proskauer测试和利用率(IMViC)测试。文化给+ +−−反应被确认大肠杆菌。确认大肠杆菌文化在国家血清型沙门氏菌和埃希氏杆菌属中心,中央研究院,Kasauli、喜马偕尔邦,印度。
2.4。隔离的DNA从大肠杆菌
从细菌基因组DNA提取按标准蛋白酶k消化法(11]。细菌培养是悬浮在Luria Bertani肉汤(Hi-media、印度)和轨道的孵化器孵化(Orbitek、印度)37°C, 110 rpm为12小时。12小时的细菌细胞颗粒状在15000克10分钟,然后悬浮在十(Tris-HCl (pH值7.2),10毫米EDTA, 250毫米氯化钠)缓冲区有1%钠十二烷基硫酸盐(Hi-Media、印度)。蛋白酶k (GeNei、印度)然后添加到最后一个100的浓度μ轻轻地g / mL和混合。暂停在37°C孵化了60分钟。获得的DNA序列phenol-chloroform chloroform-isoamyl酒精萃取是通过添加2.5卷绝对乙醇沉淀,和DNA在100年暂停了μL (TE缓冲(10毫米Tris-HCl, 1毫米EDTA-pH 7.5)。DNA琼脂糖凝胶电泳的纯度检查。
2.5。聚合酶链反应(PCR)检测uid一基因大肠杆菌
采用聚合酶链反应(PCR)检测的存在uid基因,编码的β-D-glucuronidase酶。147年英国石油公司的编码区大肠杆菌uid基因是由PCR放大,使用20和21-mer引物ual - 754 (5′-AAAACGGCAAGA AAAAGCAG-3′)和uar - 900 (5′-ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG-3′) (12]。优化的协议进行了PCR的25μMgCl L包含2.5毫米2,2.5μL Taq缓冲区(三羟甲基氨基甲烷(pH值9.0)液25°C,氯化钾,和特里同x - 100),每个核苷酸混合物2.5毫米,1 pmol /μ每个引物的,1 U的Taq (GeNei、印度),和1μDNA模板的L。放大了的热循环程序1周期在94°C 2分钟;25的周期1分钟在94°C, 1.5分钟58°C,在72°C 2分钟;1周期5分钟在72°C。PCR产品然后在1.5%琼脂糖凝胶电泳(Hi-Media、印度),与溴化乙锭染色(GeNei、印度),由凝胶和可视化文档系统(美国医生EZ Bio-Rad凝胶成像仪)。
2.6。抗菌药物敏感性试验
抗菌谱和他们解释了使用磁盘扩散法(13后),临床和实验室标准协会(CLSI)指南14]。所有大肠杆菌隔离检查了抗氨苄青霉素(Amp, 10微克),阿米卡星(Ak, 30微克),头孢曲松钠(Ctr 30微克),氯霉素(C, 30微克),环丙沙星(Cip 5微克),复方磺胺甲恶唑(床,25微克),庆大霉素(创10微克),卡那霉素(K, 30微克)、萘啶酸(Na, 30微克),链霉素(S, 10微克),四环素(Te), 30微克)和甲氧苄氨嘧啶(Tr 5微克)。
2.7。PCR检测南1基因
的存在南1基因检测使用PCR方法描述Marynard et al。3]。使用的引物南1基因5′-TTCGGCATTCTGAATCTCAC-3′, 5′-ATGATCTAACCCTCGGTCTC-3′。放大PCR产品分离用1.5%琼脂糖凝胶(Hi-Media、印度),与溴化乙锭染色(GeNei、印度),由凝胶和可视化文档系统(美国医生EZ Bio-Rad凝胶成像仪)。
2.8。检测1类整合子
1类整合子的存在被发现使用PCR方法描述几何et al。15]。第1类整合子是放大使用简并引物5′CS (5′ggc ATC CAA GCA GCA AG-3′)和3′CS(5′亚美大陆煤层气有限公司CAG TGA有条件现金援助行动GA-3′)。PCR产品然后在1.5%琼脂糖凝胶电泳(Hi-Media、印度),与溴化乙锭染色(GeNei、印度),由凝胶和可视化文档系统(美国医生EZ Bio-Rad凝胶成像仪)。
3所示。结果
血清学分型的75大肠杆菌隔离,从科钦河口透露,他们属于25种不同血清型(表1)。12株大肠杆菌是粗糙的,因此不typable。所有隔离都证实了分子水平鉴定与引物聚合酶链反应ual - 754和uar - 900放大的氨基酸编码区uid一生产放大DNA的147个基点大肠杆菌隔离。站接近Bolghatty等城市和海洋科学码头产生更多的不同血清型的大肠杆菌。
结果(表1)显示显著的多样性大肠杆菌系统中病毒。的多样性大肠杆菌血清型高站2(32%),其次是站3(22%)、车站5(17%)、站4(15%),站1 (13%)。大肠杆菌血清型如O4, O5 O60与高频隔离,而O157 O153, O148很少遇到。通常与致病性菌株血清型相关,如O5, O4, O41,发现相当高的站2 (Bolgatty)(表2)。
抗生素耐药性的百分比大肠杆菌菌株分离科钦河口图给出2。大部分的大肠杆菌菌株被发现耐氨苄西林(65.33%),其次是萘啶酸(37.33%)、四环素(33.33%)、复方磺胺甲恶唑(17%)、甲氧苄氨嘧啶(17%)、卡那霉素(14%)、环丙沙星(12%)。阻力最小的检测对头孢曲松钠(5.33%)、链霉素(4%)、氯霉素(2.66%)、庆大霉素(2.66%)和阿米卡星(1.33%)。的大肠杆菌菌株表现出抗5个或5个以上抗菌药物属于血清型O5, O4, O60, O69, O1, O157, O20, O153 O22, O34。近的60%和50%大肠杆菌分别隔离在车站遇到3和2 5个以上的抗生素有耐药性。而18%的大肠杆菌隔离恢复从站4耐抗生素超过5,没有隔离从站5超过五抗生素都有耐药性。一个大肠杆菌隔离恢复Chittor(站1)对超过五抗生素都有耐药性。
总共24大肠杆菌菌株被分离从站2 (Bolgatty)。隔离都容易阿米卡星、氯霉素、庆大霉素、链霉素。大约29%的大肠杆菌菌株分离Bolgatty显示抗磺胺类测试。的大肠杆菌从分离到的海洋科学Jetty耐氨苄西林(76%);有些人耐四环素(41%)、萘啶酸(41%)、卡那霉素(35%)、环丙沙星(17%)。一个大肠杆菌隔离是对复方磺胺甲恶唑和甲氧苄氨嘧啶,和另一个隔离是耐氯霉素。总共有11株从站4 (Thevara)中恢复过来。所有大肠杆菌容易阿米卡星、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、链霉素。几乎81%的隔离隔离表现出四环素耐氨苄青霉素抗性和27%。而隔离都容易阿米卡星,头孢曲松钠、氯霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、甲氧苄氨嘧啶、耐氨苄青霉素、萘啶酸、四环素从15%到30%不等。
75株的大肠杆菌13是磺胺类耐药。其中,2在PCR阳性南1基因(图3)。隔离都高度对磺胺类耐药;一个应变(ES11)也耐氨苄青霉素,环丙沙星、头孢曲松钠、复方磺胺甲恶唑、庆大霉素、卡那霉素、萘啶酸、四环素、甲氧苄氨嘧啶;其他(ES44)也耐氨苄青霉素、环丙沙星、复方磺胺甲恶唑、萘啶酸、链霉素、四环素、甲氧苄氨嘧啶。图4显示了PCR扩增1类整合子的环境隔离。扩增子1.6 Kb的大小,得到了500个基点,250个基点,150年英国石油公司在ES11 ES44给1.6 Kb大小的乘积。这些测试结果表明,该菌株包含一个拥有一个或多个插入整合子基因,表明存在multiresistance整合子在这些压力。
4所示。讨论
大肠杆菌导致各种肠道疾病。Diarrheagenic大肠杆菌分为六大类:产肠毒素的吗大肠杆菌(ETEC),致肠病的大肠杆菌(EPEC),肠出血性大肠杆菌(肠出血性大肠杆菌),enteroaggregative大肠杆菌(EAEC) enteroinvasive大肠杆菌(EIEC),广泛地附着大肠杆菌(DAEC) [9]。Bej et al。12]建议的pcr方法uid一基因检测更加敏感大肠杆菌从水中分离出样品。的uid基因检测大肠杆菌隔离。根据血清学分型的结果,O4(12%)是主要的,其次是O5 (8%)、O60 (8%)、R (6.6%)、O41 (5.3%)、O59, O1群(4%)、O22, O21, O102, O103, O116, O69, O91(2.6%),和O157 O34, O35, O37, O20, O141, O103, O104, O49, O148, O64, O153 (1.3%)。当一个的地理分布的分析大肠杆菌O157是由Sehgal et al。16),观察到在印度各地广泛分布显示广泛流行的菌株在几乎所有地区和1.1%的O157隔离来自喀拉拉邦。尽管食源性和水源性腹泻疾病研究中是非常普遍的地区,调查通常限于描述大肠杆菌一个人。血清型的菌株并不是由大多数诊所。因此很难评论这些菌株的患病率从科钦的临床样本地区。
Perelle et al。17由致病性)报道,污染大肠杆菌血清型,包括O103 O157 O145,代表着一个重大的公共卫生问题。大量的孤立与血清型菌株O5, O1群,O104的原因问题,因为他们已经被认定为致病性大肠杆菌血清型。传统的血清型的方法大肠杆菌体细胞和鞭毛抗原仍然是重要的技术在许多实验室诊断和监测18]。此外,血清学的抗原不直接参与毒性但可以提供重要的信息传播在社区和血清型暴发(9]。
有趣的观察是,更多不同的血清型是孤立的从科钦市附近的车站,这表明可能释放这些生物通过医院浪费的许多医院在科钦及周边城市。医院废水通常由抗菌药物污染,即使在subinhibitory浓度可以促进耐药菌株的选择和生存(19,20.]。这些血清型可能代表一个重要的人类获得严重感染的风险和可能成为我国的一个主要公共卫生问题。
总共有75大肠杆菌菌株分离出五种不同的站在科钦河口进行对12种不同的抗生素。虽然是抗生素耐药性的空间变化模式,所有的大肠杆菌菌株在不同组合对两个或两个以上的抗菌素。一般来说,抗磺胺类的发生率增加大肠杆菌从研究区种血清型。从我们的研究小组先前的研究21)也显示抗生素耐药性的流行率很高大肠杆菌隔离来自同一地区,尽管阻力水平高于那些在目前的研究中获得的。抗菌药物治疗建议当腹泻病是严重减少症状的持续时间。关注正在增加在研究报告高水平的抗氨苄青霉素,氯霉素和甲氧苄氨嘧啶/ diarrhoea-associated细菌中磺胺甲恶唑(22]。肠杆菌科显示萘啶酸和对环丙沙星的耐药性礼物DNA-Gyrase的亚基变异,通常在一个位置,相当于83氨基酸大肠杆菌(23- - - - - -25]。
抗菌药物的不同使用模式预计将有一些影响抗菌素耐药性的分布表型(26耐)和可能的决定因素。抗生素耐药性分析的结果显示,超过53.33%的大肠杆菌多种抗生素耐药。检测的隔离(ES11)同时对10抗菌素是一个问题,因为它可能对公众健康构成风险,这些分离获得的食物链。血清型显示多药耐药性5个或5个以上抗生素已报告(27]。Integron-positive菌株显示抵抗不同抗菌药物(头孢菌素、氨基糖甙类、喹诺酮类、磺胺类、四环素)测试。隔离ES11和ES44筛查1类整合子。两个隔离1类整合子和南我的基因,这是符合的存在sul-associated 1类整合子(28]。在大肠杆菌甲氧苄氨嘧啶、电阻通常与二氢叶酸还原酶的存在(DHFR)和dihydropteroate合成酶(井下供电)基因整合子(29日,30.]。多种抗生素抗性基因可能通过移动元素如质粒、转座子、和1类整合子27,31日]。整合子发挥重要作用在促进抗性基因的转移,导致创建耐多药表型(32]。
我们得出结论,不同血清型的高患病率和多药耐药性在我们的研究中发现的问题,因为有一个大水库的抗生素抗性基因在社区内,和抗性基因和plasmid-encoded毒性基因很容易转移到其他菌株。病原体骑自行车通过食物是很常见的鱼类和贝类,港口这些diarrheagenic菌株可能对消费者构成潜在的健康风险。科钦河口支持良好的贝类和长须鲸渔业利用当地渔民的生计。贝类的滤食动物倾向于集中细菌在净化身体和缺乏实践研究区增加担保shellfish-borne食物中毒的问题。本研究有助于了解不同血清型的流行大肠杆菌抗生素耐药性及其模式。总之,我们想强调的多样性大肠杆菌血清型在科钦河口相比大大增加我们的先前的研究21)这可能是由于大规模涌入有机废物进入河口的卫星城镇在科钦河口。它也可能是有价值的临床实验室本地市场的进一步描述大肠杆菌从腹泻病人血清型孤立,以得到一个明确的致病菌株的出现大肠杆菌在研究区域。未来的实验研究来评估抗菌素耐药性转移的效率使用不同的供体和受体大肠杆菌组合将是有价值的改善我们的理解在株抗性基因如何流动。
确认
d . p . Sukumaran要感谢科学与工业研究理事会(CSIR),印度政府,研究奖学金来开展工作。作者也感谢美国海洋生物学,微生物学和生物化学、科钦科技大学提供的设施。