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跨学科视角传染病
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跨学科视角传染病/2011年/文章

研究文章|开放获取

体积 2011年 |文章的ID 291513年 | https://doi.org/10.1155/2011/291513

法Pantanella,弗朗西斯卡Berlutti、丹尼尔·Passeri Daniela Sordi,亚历山德拉Frioni, iziana Natalizi,玛丽亚·莱蒂齐亚•马尔科·罗西,Piera瓦伦蒂, ”定量评价的细菌在生物膜附着和着单壁球长大的碳Nanotube-Coated表面”,跨学科视角传染病, 卷。2011年, 文章的ID291513年, 9 页面, 2011年。 https://doi.org/10.1155/2011/291513

定量评价的细菌在生物膜附着和着单壁球长大的碳Nanotube-Coated表面

法布里奇奥Pantanella,1,2 弗朗西斯卡Berlutti,1,2 Daniele Passeri,3 丹妮拉Sordi,4 亚历山德拉Frioni,1 iziana Natalizi,1 玛丽亚莱蒂齐亚•艾伯特,4 马尔科·罗西,2,3 和 Piera瓦伦蒂1,2

1Dipartimento di Sanita Pubblica e Malattie Infettive Sapienza-Universita di罗马,那里a·莫罗5,00185罗马,意大利

2Centro di Ricerca / le Nanotecnologie家庭所有'Ingegneria,参股,Sapienza-Universita di罗马那里a·莫罗5,00185罗马,意大利

3Dipartimento愿望e di基地家庭每l 'Ingegneria Sapienza-Universita di罗马,通过a斯卡帕16,00161罗马,意大利

4Dipartimento愿望e Tecnologie Chimiche、MINASlab INFN,意大利罗马Tor Vergata,通过德拉Ricerca Scientifica, 00133罗马,意大利

学术编辑器:伊丽莎白Bukusi
收到了 2011年1月13日
修改后的 07年7月2011年
接受 2011年8月11日
发表 2011年10月05

文摘

生物膜是一种常见的细菌的生活方式,它起着至关重要的作用在人类健康,导致biofilm-mediated感染。最近,来抵消生物膜发展,新的纳米结构生物材料。然而,关于纳米结构表面的抗菌性能数据是断断续续的和有争议的,,特别是,纳米结构材料的磁化率殖民和生物膜的形成细菌病原体尚未被充分考虑。在这里,致病的能力变形链球菌和铜绿假单胞菌坚持并形成生物膜表面涂着单壁球长大的碳纳米管(SWCNTs)进行了分析。我们的研究结果表明,表面SWCNTs-coated玻璃珠(SWCNTs-GBs)殖民地在同一程度的裸GBs变异链球菌和铜绿假单胞菌。总之,我们的结果表明,单壁SWCNTs-coated表面不适合对抗细菌粘附和生物膜的发展。

1。介绍

传染性疾病是死亡率的最重要原因之一。尽管伟大的寿命与先进的卫生保健,越来越多的复杂医疗感染仍然是一个重大的公共卫生挑战。越来越多的证据表明,细菌生物被膜比浮游生活方式是相对更常见,在人类健康起着至关重要的作用,尽管使用抗生素治疗(1- - - - - -3]。此外,biofilm-mediated感染变得更加严重的问题时,生物膜在医疗器械和生物材料4- - - - - -6]。

因此,可能抵消细菌殖民化的医疗器械和生物材料表面代表一个在人类健康至关重要。纳米技术在过去的几年里已经分为医学像海啸涉及在这些新领域研究人员用不同的技能。纳米结构材料最近提出的实用的方法发现新的生物材料,以抵消细菌殖民化和生物膜的发展。特别是,抗菌活性已经探索过的碳纳米管(碳纳米管)。文献资料显示,以及包含碳纳米管分散进入不同的聚合物产生抗菌活性。特别是,碳纳米管显示杀菌活动对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌(7- - - - - -10)在碳纳米管的antibiofilm活动已经证明仅对革兰氏阴性大肠杆菌K12的应变(11]。然而,纳米结构表面的易感性殖民和由致病性细菌生物膜的形成还没有充分考虑效率和纳米结构表面灭菌过程的影响。受细菌污染的潜在风险的低估能够坚持并形成生物膜的纳米结构表面可能导致意外出现细菌感染像发生在早期的生物材料时代。

在这里,两种细菌致病性的能力,也就是说,变形链球菌和铜绿假单胞菌,坚持并形成生物膜表面涂以单壁碳纳米管(SWCNTs)评估。变异链球菌和铜绿假单胞菌已被选定作为著名的坚持能力和细菌模型在生物膜生长的生活方式和他们的影响在人类疾病中,像其他地方讨论12- - - - - -17]。

探讨细菌病原体的殖民能力SWCNTs-coated表面,传统的方法如结晶紫染色法(CV),污渍和细菌细胞矩阵,BacLight生活/死亡能够检测和死亡细胞生物膜以及原子力显微镜(AFM)了(11,18,19]。然而,一个基本前提在研究细菌粘附在医疗器械和生物材料和生物膜的形成是实际的细菌数量的定量评价。事实上,细菌数在诊断和治疗的治疗有很深的影响,以及在质量控制20.- - - - - -26]。标准方法用于评估细菌的数量根据测定集落形成单位(cfu)可以被认为是完全合适的只有当细菌在浮游生活但不可靠计数细菌附着在生物膜的生活方式(27]。因此,附着细菌的数量以及SWCNTs-coated表面细菌生物膜的生活方式是评估使用michael化验(BTA)允许轻松地计数附着的细菌和生物膜的生活方式没有样本操作(20.,21,28,29日]。

2。材料和方法

2.1。菌种、培养基

变形链球菌写明ATCC 25175T和铜绿假单胞菌写明ATCC 15692 (PAO1)保持在Trypticase酱油汤(TSA;Difco实验室、医学博士、美国)与甘油(25%)−80°C和检查纯度哥伦比亚CNA琼脂(Difco)与5%红羊细胞和TSA,分别使用前。变异链球菌和铜绿假单胞菌生长在1% sucrose-brain炉注入(BHI;Oxoid有限公司、英国)和BHI (Oxoid)肉汤,分别在37°C没有搅拌18到24小时。

2.2。单壁碳纳米Tubes-Coated玻璃表面

商业玻璃珠(GBs)的5毫米直径和商业盖玻片(CSs)被用作实验中,表面为裸露的或涂以单壁碳纳米管(SWCNTs)电影。

SWCNTs涂布GBs和CSs(即SWCNTs- - - - - -GBs和SWCNTs- - - - - -CSs、职责)由第一次清洗购买GBs为30分钟和CSs解决方案组成的H的三分之一2O2三分之二(30%)和H2所以4(18米)。GBs和CSs随后用蒸馏水洗净,干下N2流。后立即清洁,涂上SWCNTs GBs和CSs。这一目标,商业SWCNTs(便宜管公司,根据制造商,碳纳米管是由催化化学汽相淀积技术,纯度> 90%,外直径1 - 2海里)以前CHCl分散3解决方案,然后沉积在基板的两种不同类型铸造。

意识到表面的整体质量验证灭菌过程前后AFM成像,我们将在下面进行讨论。

2.3。灭菌的裸和SWCNTs-Coated玻璃表面

裸和SWCNTs-coated玻璃表面被高压灭菌法灭菌15分钟在121°C,浸泡在3%的H2O210分钟的解决方案。H后2O2杀菌、裸和SWCNTs-coated玻璃表面在无菌蒸馏水洗了三次去除残余H2O2。

2.4。细菌粘附和生物膜的形成

一夜之间获得细菌粘附和生物膜发展sucrose-BHI和BHI文化变异链球菌和铜绿假单胞菌,分别是3和24小时孵化37°C的裸和SWCNTs-coated玻璃表面。

2.5。检测细菌殖民化裸和SWCNTs-Coated玻璃表面

孵化后,裸和SWCNTs-coated玻璃表面在无菌生理盐水洗了三次(0.9%氯化钠)解决方案和细菌数量是由michael估计化验(BTA) [20.,21,28,29日]。BTA雇佣不同的特定的试剂链球菌和假单胞菌属。BioTimer-phenol红试剂(BT-PR),发酵之前设置计数葡萄球菌种虫害生物膜(20.)被用来计数变异链球菌,发酵细菌。最后BT-PR出现明显和红色(pH值7.2)(20.]。BioTimer-resazurin试剂(BT-RZ)开发的计算铜绿假单胞菌,一个nonfermenting细菌29日),准备如下。3.7 g BHI在940毫升蒸馏水溶解。在121°C灭菌15分钟后,试剂补充50毫升的10%无菌10毫升的0.1%葡萄糖溶液和无菌刃天青(Sigma-Aldrich、意大利)的解决方案。最后BT-RZ试剂出现明显和蓝色(pH值7.0)(29日]。

BTA措施微生物代谢:BTA试剂的颜色切换所需的时间(即。,BT-PR: red-to-yellow;BT-RZ: blue-to-pink;图1),由于细菌的新陈代谢,是最初的细菌浓度相关。因此,颜色切换所需的时间决定了样品中细菌的数量在时刻0到相关行。画线数的相关性变异链球菌和铜绿假单胞菌,串行双倍稀释1毫升的隔夜汤文化BT-PR BT-RZ试剂,分别表现在24-well板块(BD、意大利),同时用CFU计数方法。颜色切换所需的时间的接种BT-PR BT-RZ试剂被记录和绘制与相应的CFU值(图1)。方程和描述相关性的线性相关系数计算为每个微生物对整个数据集,y=−0.21 32x+ 7.9597和 = 0.9899变异链球菌和y=−0.4675x+ 8.5421和 = 0.9968铜绿假单胞菌。殖民GBs沉浸在1毫升的特定的BTA试剂。颜色切换所需的时间的接种BT-PR BT-RZ试剂被记录和用于评估的数量变异链球菌和铜绿假单胞菌,分别,通过特定的相关行。作为相关行相关BTA试剂的颜色切换时间浮游菌落的数量,附着和生物膜的数量变异链球菌和铜绿假单胞菌被表示为planktonic-equivalent cfu (PE-CFUs) [19,20.]。

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图1
0 变形链球菌 T 铜绿假单胞菌 y x 变异链球菌 y x 铜绿假单胞菌 颜色BTA试剂和BTA相关线路的开关,(a) (b)光学吸光度表示为光学密度与波长在可见区域BT-PR (a)和BT-RZ (b)试剂。实线:光的吸光度BTA试剂前开关;虚线:光学吸收后的BTA试剂开关。插入:(a) BT-PR试剂颜色前(左)和后(右)开关(红色和黄色,职责);(b) BT-RZ试剂颜色前(左)和后(右)开关(蓝色和粉红色,职责)。(c) - (d)相关行关联的时间(小时)颜色开关BT-PR (c)和BT-RZ (d)试剂和日志的初始数量N浮游的写明ATCC 25175(c)和写明ATCC 15692 (d)。相关线路所描述的线性方程:=−0.21 32+7。9597和= 0.9899(c)和=−0.4675+8。5421和= 0.9968(d)。

评估附着的生物量和生物膜细菌裸和SWCNTs-coated玻璃表面,结晶紫检测使用协议(11]。

可视化细菌殖民化裸和SWCNTs-coated玻璃表面,原子力显微镜(AFM)和BacLight住/死epifluorescent显微镜被[11,18,19]。AFM形态特征已经使用一个标准的执行装置(能手P47H NT-MDT,俄罗斯联邦)配备标准的硅悬臂梁。图像采集标准AFM semicontact模式在空气和在室温下。显微数字化、无菌裸——或者SWCNTs CSs被沉积在底部24-well平面微量滴定板(BD猎鹰、米兰、意大利)。变异链球菌和铜绿假单胞菌在孵化37°C。孵化后,盖玻片洗了三次蒸馏水和染色使用BacLight生活/死可行性调查后(分子探针)制造商的指示。15分钟后在黑暗中孵化,可行的(绿色)染色和不能存活的细胞(彩色红色)通过使用epifluorescent光学显微镜观察(Leitz则,Dialux 20 EB)。

2.6。统计数据

所有的实验都重复至少五次获得平均值和标准偏差。相关线路是通过线性回归分析,线性相关系数计算从以下方程:

3所示。结果

3.1。灭菌裸和SWCNTs的CSs

评估灭菌过程的效率,裸和SWCNTs CSs被高压灭菌法和H2O2解决方案(参见2),然后沉浸在BT-PR BT-RZ试剂控制没有发酵和nonfermenting可行的细菌,分别。BTA试剂不切换的消毒裸SWCNTS-CSs也经过长时间的潜伏期(48小时)展示活细菌细胞的缺失(数据没有显示)。

评估nanocoated表面灭菌过程的影响,SWCNTs CSs被AFM观察灭菌前后流程和多个随机图像在不同的拍摄点的样品表面。显微镜图像显示,纳米管形成密切,几乎统一的电影,从而证明了采用nanocoating方法能够确保制服nanocoated表面由随机纠缠SWCNTs包。没有观察到显著差异在SWCNTs涂层电影之前和之后灭菌过程。在图2裸的,代表图像(图2(一个))和SWCNTs CSs(图2 (b)后灭菌过程。

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(b)
图2
AFM图像uncoated-CS (a)和(b) SWCNTs CS基质。

两个灭菌过程给了类似的结果,由高压灭菌法灭菌是用于进一步的实验。

3.2。变异链球菌和铜绿假单胞菌殖民的裸和SWCNTs-GBs

评估的粘附能力变异链球菌和铜绿假单胞菌,不同的细菌培养液浓度是用来征服裸和SWCNTs-GBs。经过三小时的潜伏期,BTA附着细菌的数量估计法(表1)。有关变异链球菌,附着细菌的数量取决于细菌培养液浓度至少对培养液从105到107cfu /毫升(表1)。可比价值附着细菌裸和SWCNTs-GBs被记录了下来。关于铜绿假单胞菌部分,附着细菌的数量与培养液浓度有关。喜欢观察变异链球菌的数量铜绿假单胞菌细胞粘附的裸,SWCNTs-GBs可比。有关细菌生物量形成三个小时孵化后,类似的筛选了CV值在所有实验条件都被记录下来,从而表明生物膜在孵化(表并不发达1)。
细菌 培养液(cfu /毫升) 裸GBs一个 SWCNT-GBs
结晶紫(OD570年) 附着细菌(PE-CFUs)b 结晶紫(OD570年) 附着细菌(PE-CFUs)
变异链球菌 4.2±0.8×108 0.009±0.001 3.0±0.3×107 0.007±0.001 2.5±0.4×107
4.2±0.5×107 0.006±0.002 1.5±0.5×107 0.011±0.001 2.0±0.3×107
4.0±0.6×106 0.008±0.001 2.0±0.4×106 0.006±0.002 1.8±0.3×106
3.2±0.3×105 0.006±0.002 1.2±0.3×105 0.005±0.001 1.0±0.5×105
0 0.005±0.001 0c 0.005±0.002 0c
铜绿假单胞菌 2.4±0.3×109 0.008±0.002 8.0±0.9×106 0.009±0.002 8.0±0.6×106
2.1±0.4×107 0.006±0.000 6.4±0.7×105 0.010±0.001 6.4±0.6×105
1.2±0.7×106 0.009±0.001 1.2±0.5×105 0.007±0.002 1.2±0.2×105
2.7±0.2×105 0.007±0.002 3.2±0.3×104 0.006±0.001 4.0±0.3×104
0 0.005±0.001 0c 0.005±0.001 0c
一个uncoated-GB:裸玻璃珠;SWCNT coated-GBs:玻璃珠涂以单壁碳纳米管;b附着变异链球菌和铜绿假单胞菌是使用BTA方法计算。附着细菌的数量表示为planktonic-equivalent cfu (PE-CFUs;参见2详情);cBTA的潜伏期延长至48小时。
表1
粘附的变形链球菌写明ATCC 25175T和铜绿假单胞菌写明ATCC 15692裸,SWCNT-coated-GBs。

为了让微生物生物膜的发展,裸和SWCNTs-coated GBs的孵化变异链球菌和铜绿假单胞菌为24小时。不可能三个小时后观察孵化,附着细菌的数量是不受培养液浓度和裸和SWCNTs-GBs相同。的数量变异链球菌和铜绿假单胞菌在生物膜为3.4±0.5×108和4.3±0.4×107,分别。控制生物膜发展裸和SWCNTs-GBs殖民GBs沾染了简历。结果表明,生物膜是在同一裸和SWCNTs-GBs程度。事实上,的值从裸SWCNTs-GBs殖民和简历筛选了变异链球菌分别为0.7851±0.1856,0.8331±0.235,和那些来自裸SWCNTs-GBs殖民铜绿假单胞菌分别为0.7515±0.216,0.8131±0.314。在控制实验中,无菌裸和SWCNTs-GBs沾染了简历。的值筛选了两裸-结晶紫和SWCNTs-GBs 0.005±0.001。

3.3。显微镜

可视化附着细菌,裸和SWCNTs CSs注射108生/毫升和109生/毫升变异链球菌和铜绿假单胞菌分别。3和孵化24小时后,CSs沾住/死污点并使用epifluorescent显微镜观察。显微镜图像显示,3小时后的孵化几乎所有附着细菌还活着裸和SWCNTs CSs。代表图像的附着变异链球菌和铜绿假单胞菌如数据所示3(一个)和3 (b),分别。孵化24小时后,大骨料的活细菌细胞被认为是多糖矩阵表明生物膜的生活方式裸和SWCNTs CSs。代表性的图片变异链球菌和铜绿假单胞菌生物膜所示数据3 (c)和3 (d),分别。

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图3
变形链球菌。 T 铜绿假单胞菌 变异链球菌 铜绿假单胞菌 变异链球菌 铜绿假单胞菌 Epifluorescent SWCNTs CSs殖民的光学显微镜写明ATCC 25175和写明ATCC 15692(一)和(b)附着细菌SWCNTs CSs 3小时后孵化;(c)和(d)生物膜在SWCNTs CSs孵化24小时后。

SWCNTs-GBs殖民3和24小时也分析了AFM。尽管小区域可视化,多个随机AFM显微镜图像的代表进行显微镜观察SWCNTs-GBs殖民变异链球菌和铜绿假单胞菌分别(图4和5)。这两个变异链球菌和铜绿假单胞菌3小时后殖民SWCNTs-GB表面孵化(数字4(一)和5(一个)),在生物膜的生活方式所显示的存在细菌的细胞外基质包裹(数字4 (b)和4 (c);数据5 (b)- - - - - -5 (d))。

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图4
变形链球菌 T 变形链球菌 T 变异链球菌 变异链球菌 T 变异链球菌 原子力显微镜的图像写明ATCC 25175殖民的单壁碳纳米tube-coated玻璃珠(SWCNT-GB)。(一)SWCNT-GB殖民写明ATCC 25175经过三个小时的潜伏期(附着);(b) SWCNT-GB殖民写明ATCC 25175孵化后24小时(生物膜);(c)的三维视图(b)的同一区域。
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图5
铜绿假单胞菌 铜绿假单胞菌 铜绿假单胞菌 原子力显微镜的图像写明ATCC 15692殖民单壁碳nanotube-coated玻璃珠(SWCNT-GB)。(一)SWCNT-GB殖民写明ATCC 15692经过三个小时的潜伏期(附着细菌);(b): SWCNT-GB殖民写明ATCC 15692 24小时后的孵化(生物膜);(c)更高的分隔区域放大(b)显示细菌细胞之间的细胞外基质;(d)的三维视图(c)的同一区域。

4所示。讨论

由于细菌生物被膜感染是人类健康的一个关键问题。此外,生物膜感染变得更加严重,当生物膜附着和殖民医学生物材料(1- - - - - -3]。一些生物材料的涂有体内抗菌药物开发和应用,但细菌殖民化和生物膜发展只有部分抑制(30.]。纳米科学的发展导致了纳米结构材料能够抵消细菌殖民化和生物膜发展(8,9,31日]。的纳米结构材料具有巨大的影响材料本身的性质(32]。事实上,改善表面性质可能阻碍医疗设备发挥关键作用——和implant-related感染。因此,粘附能力的评估以及生物膜细菌病原体的发展必须考虑的关键一步的设计新的纳米结构生物医学的兴趣。这意味着物理和微生物的多学科的参与能力。

在这里,我们评估两个细菌病原体的能力遵守和非生物表面涂上SWCNTs形成生物膜。为此,我们选择了两个菌属,参与不同的医疗器械感染:变异链球菌代表牙科植入口腔感染(12- - - - - -14,33),铜绿假单胞菌导管相关性感染的15- - - - - -17,34,35]。

首先,灭菌过程的效率和效果进行了分析。我们表明,灭菌协议(即。、高压灭菌法或H2O2治疗)是有效的,不改变SWCNTs涂层玻璃表面的整体质量。

变异链球菌和铜绿假单胞菌能够坚持三个小时后裸和SWCNTs-coated表面显示类似的附着力效率(表吗1)。此外,类似的细菌种群生活在裸和SWCNTs-coated表面被epifluorescent观察显微镜(数字3,4,5)。潜伏期延长24小时时,生物膜发展到裸SWCNTs-surfaces相似(数字3,4,5)。细菌生物膜的数量上裸GBs是类似于上形成SWCNTs-GBs细菌种类和类似的生活沉浸在细胞外基质epifluorescent和AF观察数据3,4,5)。

总的来说,我们的结果表明,SWCNTs镀膜玻璃表面并不影响附着力和致病菌的生物膜的形成能力变异链球菌和铜绿假单胞菌。SWCNTs无力抑制生物膜的形成之前报道了邓et al。36)显示大肠杆菌和金黄色葡萄球菌碳纳米管在生物膜的生活方式聚集发展。相反,其他作者表明,碳纳米管抑制细菌粘附,生物膜的形成和表现出杀菌活动(11,37]。这些相互矛盾的结果可能是由于不同的实验方法。事实上,我们使用两个菌株,通常认为是研究生物膜的模型开发和是众所周知的人类病原体。此外,它应该强调我们的实验进行了使用SWCNTs-coated表面而不是SWCNTs分散在水溶液或聚合物(8,36,37]。

5。结论

考虑到多学科的方法最近纳米技术和纳米技术发展非常迅速,一个伟大的护理必须完成关于新产品是用于人类健康。

研究SWCNTs的假定的抗菌性质纳米结构表面,住附着细菌的定量评价是强制性的。在这方面,我们的结果表明,SWCNTs-coated表面不适合抵消变异链球菌和铜绿假单胞菌附着力和生物膜的发展。

确认

摘要部分由罗马诺阿Giona Sapienza大学Piera瓦伦蒂“纳米技术和纳米科学实验室”,Sapienza大学意大利罗马。

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