对小孢子虫目分子诊断测试

文摘

小孢子虫目是一群无处不在的真核专性细胞内寄生虫,认识到100多年前的描述疾病bombycis蚕的寄生虫。现在欣赏这些生物与真菌有关。小孢子虫目动物团体最常见的胃肠道感染所有主要的病原体;但是他们从每一个组织和器官,已报告及其孢子是常见的环境如沟水来源。不同属的生物感染人类,但大多数感染是由于Enterocytozoon bieneusi或Encephalitozoon物种。这些病原体很难诊断,但已经取得了重大进展在过去十年的发展对这些生物分子诊断试剂。这份报告回顾了分子诊断测试,描述了识别的小孢子虫目感染人类。

1。介绍

小孢子虫目是门的代表至少150属1200种(1,2]。自1980年代中期以来,越来越多的这些生物与代理的人类疾病,特别是在他们的能力机会病原体HIV感染患者(2,3)和其他免疫抑制个人,如器官移植或化疗接受者(4]。迄今为止,在8属14种感染人类发现了(5]。在艾滋病毒阳性患者中,最常见的临床表现是由于肠道感染慢性腹泻和浪费,但疾病由于这些病原体的谱很广,包括肝炎、腹膜炎,keratoconjunctivits、鼻窦炎、支气管炎、肺炎、膀胱炎、肾炎、肌炎、脑炎、和其他脑感染(4]。此外,小孢子虫目也被报道在孤立的案例报告病原学的尿道炎,前列腺脓肿、舌头溃疡,骨感染、皮肤感染(4]。越来越欣赏,这些生物显然也可以导致肠胃和眼部感染的免疫活性的个人。Serosurveys [6,7]表明microsporidiosis很常见,但在一般人群通常是自限性或无症状。虽然没有具体传播途径记录在流行病学研究中,有证据表明,感染可能发生由多个航线(枚举(2])包括水性、呼吸、性、先天性、动物传染病的传播,在眼部感染,创伤性接种到角膜。

所有小孢子虫目产生耐环境孢子能够挤压它盘绕,内部极丝(即。其中的内容,从而极管)接种到附近的宿主细胞。独特的结构和功能,识别门极丝的诊断。由于体积小的生物,例如,一些物种human-infecting测量1 - 2米(4),诊断microsporidiosis一直依赖透射电子显微镜(TEM)来识别极丝和其他门,特有的超微结构特征。尽管它仍然是黄金标准,TEM是劳动密集型和耗时,需要昂贵的设备,重要的专业知识,和一个专门的组织工作人员在数天。它也相对不敏感,由于少量的组织,可以检查和缺乏信号放大。光microscopy-based方法也被开发和运行速度更快,通常比TEM更敏感,但他们仍然需要有经验的病理学家成功的解释。这些方法包括常规组织学染色,如修改后的三色的染色剂单独使用或结合其他污渍,如克或Warthin-Starry银1]。尽管这些方法更方便比TEM检测小孢子虫目在体液和组织中,内部极丝不容易确定使用这些技术。相反,诊断主要取决于孢子壁厚检测的双折射和选择性染色特征提供了修改后的三色的染色。Chemofluorescent电镀(例如,Calcofluor白色,Uvitex 2 b, Fungifluor)已被用于目标孢子壁内的甲壳素。而敏感,潜在的交叉反应性真菌和artifactual物质存在,尤其是在粪便样本。因此,它被建议应该使用chemofluorescent电镀结合传统组织学染色,以提供更好的敏感性和特异性,当检查粪便样本。然而,即使最好的组织准备和染色,光学显微镜很少使microsporidian种特异的诊断。这是一个关键的缺点的需要不同的治疗感染人类的各种microsporidian物种(8]。

虽然TEM极地灯丝的证据或其他独特的超微结构microsporidiosis的门被认为是无可争议的证据,一个更具体的诊断并不总是可能的形态的基础上。尤其是密切相关的物种,区别特征可能只出现在某些生物的发育阶段,所有这些可能不会出现在一个特定的临床样本。在离体培养可以想象作为一种工具来帮助诊断数human-infecting物种,文化的方法是非常艰苦的,污染,和通常是不切实际的;此外,对于Enterocytozoon bieneusi最常见的microsporidium发现,在人类中,不存在体外培养系统(9]。因此,存在一个需要更快、更具体,更容易的方法来诊断在临床标本和环境样品。

在过去的十年左右,分子的基于程序已经越来越多地用于临床的诊断和鉴定微生物病原体。这些程序是用来检测核酸序列或病原体抗原特异性。与传统显微镜或培养方法相比,分子方法可以提供以下潜在优势:敏感性增加,由于信号的放大;更大的特异性,在适当的时候检测探针使用;快time-to-result;,以及更容易解释的非专业人士写的(10]。虽然临床实验室仍主要依靠microscopy-based小孢子虫目的诊断方法,在过去的15年里重要的努力已经针对分子方法在研究实验室的发展。本文将回顾这些新兴的进展分子诊断病原体。

2。核酸检测方法

核酸检测方法利用合成特定和互补的DNA分子在病原体的DNA序列。最早的方法标记DNA探针杂交的病原体和发射探测信号(如荧光)。这些DNA探针技术今天仍在使用,尽管它们在很大程度上取代了放大目标序列的方法;这些方法是最常使用的聚合酶链反应(PCR)(历史的角度来看,看到11])。在PCR,目标病原体DNA是受一套专门设计的引物和复制一遍又一遍的自由由themostable核苷酸聚合酶。目标的放大DNA(即病原体。,amplicon) confers two advantages: improved detection sensitivity relative to probe-based methods and facilitation of downstream analyses (e.g., restriction analysis, sequencing) of the amplicon.

分子诊断技术样品制备的小孢子虫目韦斯已详细审查和Vossbrinck [12]。这项技术来提取DNA用于放大可以显著影响PCR诊断技术的敏感性。核酸可能从临床样本中提取组织切片等角膜被刮削下的碎屑,十二指肠的愿望,和尿液标本以及体外文化与商业DNA提取试剂盒(例如,所生产的试剂盒,圣克拉拉,加州,美国,或者Promega,麦迪逊,威斯康星州,美国)或例行程序,如蛋白酶K消化phenol-chloroform提取和乙醇沉淀(紧随其后13]。DNA从石蜡包埋材料也可能是孤立的标准方法(14)或与商业用品如DexPAT(美国加州伯克利Takera生化)。从修改trichrome-stained DNA已成功放大15和几十年的Giemsa-stained16材料刮掉)显微镜载玻片的幻灯片之后机械破坏的小孢子虫目(使用玻璃珠)和随后的DNA提取使用标准技术。

粪便样本的DNA的隔离和放大是更具挑战性,一般要求机械破坏和/或恶劣的提取条件。成功的报道方法包括征服次氯酸钠(17),几丁质酶(17],lyticase [18),硫氰酸胍(19- - - - - -21),福尔马林或M氢氧化钾17,22,23),二硫苏糖醇(22],溴化hexadecyltrimethylammoniuim [24),或沸腾的样品(Ombrouck et al。25]。粪便样本经常包含聚合酶抑制剂(26]。如果他们不被上面的方法,样品的稀释(Ombrouck et al ., (27])或硫氰酸胍治疗(19)可能是必要的。粪便样本的extraction-free模板制备方法也被开发(28)使用自贸区过滤器和变性剂浸渍,螯合剂,和自由基的陷阱,这显然使大多数细胞溶解接触,使碎片和其他抑制因素从DNA冲走了被困在过滤器。在一项研究中这个自由贸易协定滤波器方法允许检测每毫升800 microsporidian孢子凳子的PCR技术(Subrungruang et al .,29日])。

为了应用pcr诊断病原体,必须提前知道一些基因序列信息。的human-infecting小孢子虫目属于一种种类繁多的“新兴”的病原体,和可用的遗传信息在这些生物是有限的但是不断增加。对于大多数的小孢子虫目基因库核糖体rna基因序列数据是唯一的遗传信息。存入基因库microsporidian基因的数量已经从1999年的不到200(调查中12)到今天的大约6000。大约二千提出的这些基因组sequence-related预测基因来自设在et al。30.)具有里程碑意义的人类病原体的基因组测序Encephalitzoon cuniculi第一,她们完全只有microsporidium基因组被测序。密切相关的物种Encephalitozoonhellem有75个条目。最近,基本上noncultivatable病原体的基因组调查Enterocytozoonbieneusi导致的另一个三千年假想的基因,其中一些是同源染色体的基因识别Enc. cuniculi(31日]。其他十一个human-infecting种小孢子虫目,零和几十个基因已经被存入基因库。

由于序列信息的可用性以及守恒和变量的存在区域内核糖体rna基因,pcr方法通常利用引物为特征的小孢子虫目这个基因。第一次报告的使用守恒rRNA的克隆的引物是小亚基(四)rDNAVairimorpha necatrix农业害虫的病原体(32]。引物互补基因保守序列被用来放大,随后获得的核糖体rna基因序列数据几个human-infecting小孢子虫目,包括内附。cuniculi,内附。hellem,内附。intestinalis,Ent。bieneusi,Vittaforma缘(综述[33,34])。这些核糖体rna基因已经被来自设在报道et al。30.)在20多万册内附。cuniculi基因组,因此,提供敏感性的增加(超过单拷贝基因)用于诊断PCR测试。

诊断研究使用不同的核糖体rna基因的引物小孢子虫目了维斯和Vossbrinck12)和弗兰岑和穆勒35]。序列的引物对用于各种小孢子虫目的放大,以及推荐的退火温度对PCR和预期的扩增子大小、编译表1(改编自12])。这些引物具有种特异性,而其他人更通用引物集放大所有的Encephalitozoonidae。这些下游引物组限制分析,其中扩增子由特定的限制性内切酶消化成小块,物种需要特定的诊断。

PCR也被用于识别未知的人类和兽医感染微孢子目。使用过去的保守引物放大的小亚基(四),大亚基(路易斯安那州立大学),和基因间间隔(IGS)地区,它已经可以克隆,然后核糖体rna基因的部分序列但一个个小孢子虫目从活检标本(表2,改编自12])。这些核糖体rna序列数据可以用于系统发育分析在计算机使用爆炸和类似的项目比较未知序列的核糖体rna序列在不同的小孢子虫目基因库。引物在表2形式的基础“分子工具箱”,允许来自小说的核糖体rna基因的克隆物种或品种的小孢子虫目。引物对V1 (18 f):: 1492 r和530 f:: 580 r在,他们通常被认为是“万能”成功放大未知rRNA小说物种或基因的小孢子虫目([36],也看到[12])。

几个研究人员发表了诊断程序使用实时PCR(小孢子虫目33,34,53,54,56]。实时聚合酶链式反应的技术,这项技术实时检测积累扩增子通过互动fluorescence-labelled或荧光染料探针的优点是定量在一个广泛的动态范围。此外,它通常采用多井格式和分配postamplification处理的样本,从而增加吞吐量和降低污染的风险中固有PCR (57]。海丝特et al。53)用探针具体的小亚基rRNA属Encephalitozoon和物种特异性引物Enc. cuniculi, Enc. hellem,和Enc. intestinalis。他们的方法验证时只对纯化microsporidian DNA,它可以用于临床样本。另一项研究利用泛”Encephalitozoon引物特定于小亚基rRNA和胍thiocyanate-based萃取系统为自动化工作站检测而设计的内附。cuniculi,内附。hellem,内附。intestinalis从粪便标本(56]。试验敏感(检测极限之间来孢子感染/毫升)和反射强度(线性范围之间和孢子/毫升)。此外,融化曲线分析的扩增子容易允许分化三个内附。物种。,which is useful for multiple or unknown infections. In 2003, a real-time PCR assay using primers for内附。intestinalis小亚基rRNA被用来检测这些病原体从已知的临床样本,包括粪便、尿液、组织切片,支气管肺的标本和血液33,34]。使用控制参考孢子,检出限估计20孢子每毫升,这是足以探测到一个相对低强度血液感染表明感染是传播33,34]。最后,多路实时PCR试验也被同时检测报告Ent。bieneusi,内附。cuniculi,内附。hellem,内附。intestinalis新鲜和formalin-fixed凳子与基因间区域和小亚基rRNA的引物Ent。bieneusi和Encephalitozoon物种。,respectively [54]。Ent。bieneusi中检测出30的33 microsporidia-positive样本。正面和负面的控制的研究包括了一系列验证试验特异性和防范假阴性由于抑制剂可能出现在凳子或外来DNA的存在,分别。

一些研究还利用荧光在原地基于杂交(鱼)方法检测小孢子虫目。从本质上讲,鱼技术利用fluorescence-labeled探针结合互补的核酸(DNA或RNA)标本(10]。PCR相比,总体形态和空间信息的probe-binding标本可能被保留,因为程序执行原位。鱼已经使用探针对小孢子虫目rRNA的小亚基或基因间区域检测Ent。bieneusi和内附。hellem(24,51,52]。这些方法与归档formalin-fixed成功使用,石蜡包埋(FFPE)临床样本,发现更多microsporidia-positive样品或感染细胞内样品比传统的组织化学染色。在的情况下Ent。bieneusi在核上的位置、特点染色的寄生虫在空肠切片上皮细胞(24和染色的发展形式52)导致诊断的确定性。虽然鱼是一个有吸引力的过程由于多方面的信息,它可以提供两个因素严重阻碍其潜力一般使用在临床诊断设置。首先,它相当费力,技术上的挑战,需要deparaffinization、脱水、补液(FFPE样本),由蛋白酶消化核酸访问调查,标签和一夜之间杂交的探针,阻塞,对比染色,许多清洗步骤之前查看epifluorescence-equipped显微镜。其次,它比聚合酶链反应不敏感的数量级由于缺少原始信号(即放大。核酸的目标)。尽管如此,它可能非常有用,特别是环境样品中歧视的生活和死亡的生物体是很重要的,它可以提供设计探针的RNA,而不是DNA较不稳定(在讨论51])。

感兴趣的是这份报告的同时一个寡核苷酸芯片检测的发展Ent。bieneusi,内附。cuniculi,内附。hellem,Enc. intestinalis从临床样本55]。这样的全基因组表达分析微阵列最初发达但最近被应用于分子诊断(10,58]。微阵列技术一般采用数组target-complementary寡核苷酸印在一个“芯片”,fluorescence-labelled核酸样品杂化;荧光的程度与大量的DNA样本。因为数组的格式和荧光强度的模拟自然,这种技术本质上是高通量和量化,分别。王等人。55)利用这些优势,结合PCR的灵敏度,首先利用守恒,family-specific引物扩增1.3 kb小孢子虫目从unextracted核糖体rna片段,FTA-filtered临床粪便样本之前小孢子虫目微阵列杂交。多个特定探测器被用来赋予属- - -了解杂交概要分析和敏感性增加减少扩增子的大小(即。,“嵌套”的方式)。数组能够同时检测所有四种小孢子虫目的敏感性孢子每100L的粪便样本。调查20粪便样本的艾滋病患者患有腹泻的病因不明,12个样本microsporidia-positive,除了一个显然是多重感染的。没有明显的掩蔽效应,更丰富的物种,每个物种和探针杂交概要文件提供了一个初步的评估感染强度。每张幻灯片打印四个人微阵列增加了这项技术的潜在吞吐量。

3所示。Antigen-Based检测方法

Antigen-based检测方法如免疫荧光分析(ifa)、ELISA和免疫印迹实验用抗体免疫动物病原体特定抗原识别特征。IFA可以使用在原地固定标本,但需要使用荧光显微镜检查。免疫印迹或ELISA测试检查标本的匀浆。可以是多克隆抗体(即。,purified from animal sera and directed against various epitopes of the protein, and possibly containing other, nonspecific antibodies which can increase background signal) or monoclonal (purified from cell culture supernatants).

许多单克隆和多克隆抗体human-infecting小孢子虫目包括Ent。bieneusi,内附。cuniculi,内附。hellem,内附。intestinalis开发(59- - - - - -65年]。通常这些抗体针对孢子壁或极地管小孢子虫目。这些抗体显示大不同种类的小孢子虫目IFA或免疫印迹。虽然一些调查人员IFA试验报告说,有一个平等的灵敏度参考PCR(例如,64年]),大多数的调查人员相信IFA检测比基于PCR的方法不太敏感。在任何情况下,特异性和灵敏度很大程度上取决于抗体本身和各个步骤的护理(如固定、阻塞、和洗)执行。基于抗体的检测是最好的作为补充常规组织学技术,在困难的情况下nucleotide-based检测也应该被利用。

4所示。基于抗体的检测方法

血清学测试如酶联免疫吸附试验(ELISA),免疫印迹和agglutination-based测试(66年,67年)可循环抗体检测诊断目前不推荐,因为变量表达的抗体在免疫功能低下的患者,无法区分急性和过去感染(68年),anti-microsporidian抗体的高患病率明显健康、免疫活性的数量(6,7不同物种之间,大的抗体。然而,这些血清学的分析可能是有用的诊断亚临床感染的潜在患者移植捐赠者或者可能的风险感染复活由于即将免疫妥协(在讨论8])。

5。检测环境样品的小孢子虫目

因为许多种类的小孢子虫目在人类和动物肠道病原体和传输环境的孢子(69年),很可能发生水媒传播的寄生虫。人类病原小孢子虫目已发现在地表水、地下水、和三级农业废水23,70年- - - - - -75年),构成污染风险饮酒,休闲、和农业供水。事实上,在1999年有一个水性microsporidiosis爆发证实,影响了职业和immune-competent个人76年]。由于这些研究,美国环境保护署污染物包括最近的小孢子虫目两个候选人名单(CCL-1和2)在1998年和2005年,分别。CCL-2目前由其他8位候选人微生物制剂和42化学药剂已知或预期在公共供水系统,可能需要在《安全饮用水法》规定。

水性原生动物通常从大容量水样本中检测到基于过滤器或离心净化和分子浓度或微观识别的生物集中材料(77年]。目前,方法浓缩的小孢子虫目水样尚未标准化,但相对有利的孢子浓度实现了连续流动离心(CFC) (78年)或连续通道离心分离(79年]。在水样中,净化的孢子immunomagnetic分离(IMS),它利用pathogen-specific antibody-coated珠子之前由实时PCR检测,显示敏感的孢子在超纯水(78年),虽然目前商用anti-microsporidia抗体的缺乏限制了这种方法的可访问性。在所有情况下要求从浑浊的样本中发现小孢子虫目如feces-impacted或浑浊的水环境,人类致病的小尺寸小孢子虫目阻碍检测灵敏度,因为它需要减少过滤孔径的膜污染增加,从而有效地降低水的体积,可以筛选(78年]。的粪便或严重feces-impacted废水,一个类似的问题,虽然小,过滤、或未经过滤的卷可能是为了分析方便,和最小化PCR抑制剂通常出现在其中的影响(26),这样的小卷不得代表整个样本或者可能不适用于检测低强度污染(在讨论80年])。尽管如此,检测的局限性来孢子每毫升的粪便或污水通过sucrose-flotation净化之后,DNA提取使用商业套装和PCR (80年),显著提高之前报道的方法甚至更少的浑浊的样品(71年,81年]。

而水性小孢子虫目可能造成更大的环境威胁,nonaquatic分散的小孢子虫目也是一个公共卫生问题。孢子已确定等新鲜农产品在波兰浆果和其他水果,豆芽,绿叶蔬菜(82年),可能由于microsporidial农业灌溉用水的污染(74年)或污水污泥最终产品用作肥料(83年,84年]。三种Encephalitozoonidae被鱼水平可能感染人类。在城市环境中在欧洲和北美,human-infecting小孢子虫目已确定从鸽子粪便排泄物83年- - - - - -86年]。一个孤立的基因被发现与之前报道的human-infecting隔离(86年),在一项研究中,鸽子的粪便样本被发现Ent。bieneusi艾滋病患者(85年]。Graczyk et al。83年,84年估计一个人可能吸入可行,雾化孢子在30分钟的职业或偶然接触到大量鸽子excrement-contaminated表面。此外,马西斯et al。87年)证明Ent。bieneusi在农场狗和猫的粪便;诊断PCR表明人类的分离的菌株是密切相关的。这些研究结果支持了这样的观点,即人类microsporidiosis是一种人畜共患疾病(69年,88年,89年]和突出分子方法识别的实用新能源对人类健康的风险。

6。结论

分子诊断的潜力,特别是核酸诊断超过传统方法的敏感性,特异性,速度和再现性已经完成概念验证其他病原体(10,11]。事实上,这已经证明的小孢子虫目分子检测研究,处理相应的光学显微镜标本(例如,24,51])。虽然瞎了,多中心的评估检测方法在1998年进行的小孢子虫目(果皮et al。90年)只显示适度敏感利用PCR ()在光学显微镜(),最大的各个实验室之间还是有差异的。因此很可能随着分子诊断方法完善了随着时间的推移和临床诊断技术人员习惯于他们,他们的优势将更加明显。虽然这种技术的成本和必要的培训人员一开始看起来似乎禁止,嵌入延迟成本和非特异性或不正确的诊断应考虑病人和卫生保健系统(见[11])。

总之,分子检测方法为所述小孢子虫目可能更敏感,具体,更少地依赖于观察者的主观比传统microscopy-based方法。此外,复杂的nucleotide-based实时PCR和寡核苷酸微阵列等方法本质上更高的吞吐量和量化,使标本的同时分析多个病原体感染强度以及初步评估。虽然time-to-result和再现性在临床诊断设置尚未评估,适度的学习曲线应该会考虑这些病原体的“新兴”性质(见[91年])。展望未来,随着越来越多的生理洞察这些病原体是最近的基因组测序项目提供的30.,31日),这些技术可能会根据需要适应strain-genotyping和药物sensitivity-profiling等应用程序。

引用

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