人类的阴道细菌生物群和细菌性阴道炎

文摘

细菌生物人类阴道可以产生深远影响的产妇及其新生儿的健康。阴道微生物群的变化与几个相关不良健康结果包括早产、盆腔炎和收购艾滋病毒感染。Cultivation-independent分子方法提供了新的见解关于细菌多样性在这一重要领域,尤其是在女性常见的细菌性阴道炎(BV)条件。PCR方法表明,女性阴道细菌与BV有复杂的社区,包括很多挑剔的物种,特别是从门拟杆菌门和放线菌。健康女性大多是殖民与乳酸杆菌等乳酸菌crispatus,乳酸菌jensenii,乳酸菌内心,尽管各种其他细菌可能存在。BV的微生物是异构的。的存在加德纳菌属鞘突和Atopobium阴道涂层阴道上皮细胞在某些科目与BV表明生物膜可能导致这种情况。

1。介绍

阴道的罗德尼人体;它没有得到尊重。虽然经常被视为一个纯粹的通道月经,精子,或新生儿,人类的阴道是一个高度通用的器官,可以深刻影响妇女和她们的刚出生的婴儿的健康。阴道的环境会影响受孕的概率,能够携带胎儿项,获得性传播疾病的风险,如艾滋病毒感染。微生物发挥重要作用在决定生化和炎症的阴道环境。尽管几十年的研究基于种植技术已经照亮了人类阴道微生物群,最近的研究采用cultivation-independent方法显著增加我们对细菌多样性的理解在这个重要的利基。本综述将集中在细菌生物在人类阴道,特别注意研究使用核酸序列的方法。我们将阴道细菌群落的变化与细菌性阴道炎常见条件相关联(BV)和将讨论使用科赫法则的挑战[1,2)的因果关系评估证据挑剔的细菌在这些微生物群落。有许多重要的病原体等阴道利基Neiserria淋病,Ureaplasma物种,尿道支原体,链球菌物种,大肠杆菌,沙眼衣原体,阴道毛滴虫我们不会研究综述。研究真菌、病毒、古细菌和原生生物的多样性在人类阴道很重要但不是本文的重点,由于缺乏分子调查发表。2009年人类阴道微生物的研究还在起步阶段。宏基因组和整个细菌基因组测序项目正在进行中,以帮助定义的集合微生物基因存在于阴道和理解他们的贡献主机正常生理和疾病。

大多数研究的照片上可以看出这里描述的阴道微生物群是静态的,因为它是基于横断面研究,评估微生物成分离散和罕见的时间点。然而,阴道微生物群在人类可能经历的变化表示和关键物种的丰度随时间所影响的因素可能包括年龄的女人,荷尔蒙的波动(如月经周期阶段,避孕),性活动(例如,类型的性活动,如通过阴道性交口交或肛交之后,生活的频率,性伴侣的数量,和这些合作伙伴的泌尿生殖系统微生物群),基础疾病(如糖尿病、尿路感染),使用的药物(如阴道内的和系统性的抗生素),阴道内的洗涤实践和卫生。未来的研究将受益于高通量技术的使用,以促进测量波动在人类阴道微生物群在纵向时间和更频繁的取样分析。目前的数据表明,这些研究将揭示一个高度动态的人类在许多女性阴道的生态系统。

2。阴道微生物群:“正常”和细菌性阴道炎

女性的阴道分泌物涂片革兰染色没有BV通常显示革兰氏阳性棒,与文化揭示乳酸杆菌的优势,尤其是乳酸菌crispatus和乳酸菌jensenii(3- - - - - -5]。乳酸杆菌被认为促进一个健康的生态系统通过产生乳酸,过氧化氢,细菌素具有抗菌性质从而排除病原体从这个利基(6]。乳酸菌内心是一个被低估了的正常的阴道生物群,因为它不长在玫瑰琼脂,通常用于分离乳酸杆菌(3]。相比之下,女性条件细菌性阴道炎(BV)已经损失很多乳酸菌物种(除了l .内心的),收购各种厌氧和兼性细菌(7,8]。革兰染色的阴道分泌物BV展示女性的损失及其替代革兰氏阴性和革兰氏阳性棒Gram-variable球菌和棒9]。文化通常BV患者阴道分泌物的产生加德纳菌属鞘突和其他细菌,可能包括的混合物普氏菌、Porphyromonas Mobiluncus,支原体物种。尚不清楚是否主要事件启动BV是关键乳酸杆菌的损失或收购的复杂细菌社区中找到这个综合症;这些可能是同步流程(图1)。也有可能其他一些因素是主要病因代理人,而阴道微生物群的变化反映出下游事件BV的发病机理。

3所示。细菌性阴道炎

BV的最常见原因是阴道分泌物和频繁的妇女就医的原因(10]。BV是非常普遍,影响10 - 30%的女性(在美国11),有更高的利率在非裔美国妇女和妇女从撒哈拉沙漠以南的非洲12- - - - - -14]。尽管BV是一个重要的疾病本身,它是与几个相关严重不良后果包括早产(15),盆腔炎性疾病(16),和收购艾滋病毒感染17]。BV的女性可能有一个不合法的阴道分泌物或局部刺激,但大约一半的女性可诊断BV没有明确的症状(18]。一些女性不报告不正常的阴道分泌物,但放电是由临床医生,然而在考试与BV并不突出,许多女性意识到自己的诊断或考虑他们的放电是在正常范围内。BV的高患病率和影响相当大一部分女性缺乏症状导致的问题是否应该考虑BV阴道微生物群的正常变异或疾病实体。妇女受到严重症状BV所体现的丰富的阴道分泌物,减少经常由当地燃烧或瘙痒,毫无疑问,他们有疾病。女性与BV的实验室证据,但没有症状,这种疾病名称似乎不合适,虽然这种情况仍然传授的风险增加早产等不良健康结果。抗生素如甲硝唑和克林霉素的耐药性通常是有效的治疗BV在大多数主题,导致解决症状,但复发的几率很高(19,20.]。系统(通常是口头)或阴道内的抗生素可用于治疗BV。

症状BV可以被描述为一个综合征基于一组临床特征的存在没有定义一个特定的病原体。BV的诊断通常是用一系列的临床标准收集的临床医生执行盆腔检查,或阴道分泌物革兰染色的解释。Amsel临床标准通常用于诊断临床因为BV的方法是快速的,但它确实需要访问一个显微镜(18]。必须提供至少3 4 Amsel标准建立BV诊断,包括(1)提升阴道分泌物;(2)积极的“气味测试”由检测可疑的气味在添加10%氢氧化钾幻灯片包含阴道分泌物;(3)存在的线索细胞(20%)阴道分泌物细菌脱落的阴道上皮细胞涂上创建模糊边界;(4)均匀,乳白色的阴道分泌物。请注意,可能有一个基于Amsel BV的临床诊断标准没有弗兰克阴道分泌物的存在。因此,认定女性阴道分泌物没有BV是无效的,和研究的“正常”的阴道应该使用一个客观的方法来评估BV。不幸的是有该领域的许多研究声称BV-associated细菌的正常微生物群没有评估BV地位,尽管自我报告的阴道分泌物可能是缺席。事实上可能是可能的,许多BV-associated细菌可以正常的人类阴道微生物群的一部分,但未能使用共识指南定义BV的研究背景是导致科学困惑与精心设计的研究是完全可以避免的。

BV的另一种方法诊断依赖于在阴道分泌物涂片革兰染色执行分析。这种方法是最常见的用于研究用于分类科目设置,革兰染色但不太适合临床因为阴道分泌物革兰染色的分析需要一定程度的专业知识很少提供实时当临床医生面对BV的决定是否治疗。不管是好是坏,阴道分泌物革兰氏染色剂被认为是目前诊断的金标准,因为它提供了更大的再现性和客观性相比Amsel的临床标准。例如,可能会有技术人员之间的变化评价阴道湿坐骑的线索细胞。几个评分系统用于阴道涂片进行分类。纽金特的方法等。9)评估的存在和相对量三个细菌形态类型,包括革兰氏阳性棒(乳酸杆菌),革兰氏阴性和Gram-variable棒(加德纳菌属鞘突,拟杆菌(物种),弯曲棒Mobiluncus物种)。纽金特得分0 - 3被认为是正常的(BV)和标记的存在革兰氏阳性棒,或者至少没有加德纳菌属鞘突或Mobiluncus形态类型。纽金特7 - 10分的授予BV的诊断并没有革兰氏阳性棒和高浓度的存在加德纳菌属或Mobiluncus形态类型。纽金特得分4 - 6指定中间植物和两极之间的有革兰氏染色剂的特性。选择评分系统的解释存在,阴道分泌物革兰染色,等关干草(21]。

4所示。的作用加德纳菌属鞘突在BV

在哨兵的论文发表于1955年,赫尔曼·加德纳和查尔斯公爵报道从主题小说的成功隔离细菌综合征非特异性阴道炎,现在被称为BV。细菌最初命名嗜血杆菌鞘突但后来改名为加德纳菌属鞘突。作者说,“我们准备目前证据表明,绝大多数的所谓的“非特异性细菌vaginitides”构成特定的单一病因引起的传染性实体代理(22]。“这些调查人员相信g .鞘突BV的唯一原因,开始为科赫法则疾病因果关系在一系列的临床实验。纯粹的文化g .鞘突被接种到13岁健康女性的阴道,导致BV的发展1的13个,与相应的疾病产量的7.7%。基于这些数据,研究人员得出结论,科赫法则被满足,尽管92%的失败率调用这个结论的质疑。调查人员继续执行一个额外的实验在整个阴道分泌物从主题与BV是用来接种15没有BV的女人的阴道。11这15个学科发达BV,产生疾病诱导率为73%。作者认为,这些数据进一步支持的因果作用g .鞘突BV,因为这种细菌从大多数诱导培养的情况。这是我们解释这些研究整个阴道分泌物是一个更加成功的培养液BV的传播比纯粹的文化g .鞘突此外,这表明还有其他因素g .鞘突重要疾病归纳。

其他的证据表明,加德纳菌属鞘突不是唯一病因在BV的代理。科赫法则要求病因微生物应该发现在任何情况下的疾病但不应在受试者没有发现疾病(1)(详见科赫法则)。g .鞘突失败后测试特异性,因为它可以检测到大约30 - 50%的女性没有使用栽培方法BV和70%的女性没有BV使用PCR方法(23]。半个多世纪之后,我们还在争论的角色g .鞘突在BV。虽然g .鞘突BV的发病机制中可能起着重要的作用,它不太可能是唯一的煽动者,因为它是唯一从来没有发现细菌阴道分泌物从主题与BV。我们的假设是BV是社区的细菌引起的综合征,包括不文明的物种,从而排除科赫法则的正式申请,需要新方法建立因果关系。

5。阴道微生物多样性:从栽培角度

随着分子技术用来测量细菌的多样性,很容易折的贡献研究基于种植,因为这些研究可能无法检测到大量的挑剔的微生物在任何给定的利基。然而,培养研究提供关键的见解的表型特征的微生物不易来自分子研究。此外,培养微生物允许实验操纵这些生物在实验室和测试假设的发病机理和毒力因素。因此,培养研究保持阴道微生物学的一个重要区域的调查,尽管这种方法的局限性(24]。追求一个原因使用栽培和cultivation-independent方法相结合的方法是,一些细菌更容易出现在低浓度时被种植。例如,Verhelst et al。25)报道,38阴道细菌物种鉴定的8科目没有BV, 5发现单靠培养。新型栽培的方法可能需要增加很多挑剔的细菌物种在人类阴道。

伯顿和里德的研究在2002年之前(26),几乎我们所有的知识阴道中的细菌利基来自栽培研究涉及隔离的生物选择性和非选择性媒体文化和随后的表型鉴定技术。就像使用各种广泛的细菌PCR引物有助于最大限度地提高物种多样性(见部分分子方法),很多媒体和生长条件可能需要不同的最佳隔离细菌物种。相对非选择性的媒体如MacConkey琼脂、甘露醇盐琼脂和胰蛋白酶的大豆基地羊血琼脂5%可能是有用的估计数字的有氧和厌氧细菌阴道样本。选择性或semiselective媒体包括Rogosa [27]或德曼,Rogosa沙普媒体(夫人),乳酸杆菌和人工双分子层渐变(HBT)琼脂的隔离加德纳菌属鞘突(28]。应该注意的是,乳酸菌内心的,出现在许多学科和没有BV,不长在Rogosa琼脂但能长HBT琼脂。

Cultivation-based方法已经确定了加德纳菌属鞘突厌氧细菌,如普氏菌,Porphyromonas,消化链球菌属,Mobiluncus,支原体很大程度上是与干扰微生物群与BV科目。健康女性通常殖民与过氧化氢生产乳酸杆菌被认为抑制BV的挑剔的厌氧菌的生长。特定的栽培研究将不会讨论进一步的细节,但可以从最近的评论29日,30.]。

6。阴道微生物多样性:分子的视角

Cultivation-independent方法一直记录了高比例的挑剔的细菌在不同的生态位(31日这些工具),最近被应用于研究阴道的生态系统。结果从许多不同的研究小组证实人类阴道携带大量的细菌物种要么不培养或使用种植方法不容易确定。这些结果有助于增强,但不要替换,人口普查数据使用cultivation-based生成方法。事实上每个方法描述人类的土著微生物群受到某种程度的偏见。因此,我们的立场是最完整的人类微生物群会从应用程序和合成不同的技术和方法,包括种植。我们强调各种分子方法的优势和局限性来描述下面的阴道微生物群。

最常使用的目标细菌的分子识别是小核糖体亚基或16 s rRNA基因。16 s rRNA基因是非常有用的,因为它是出现在所有细菌和序列的区域保护,可以有针对性的广泛PCR引物的序列异质性和地区可以用来识别细菌或推断系统发育关系(见[32- - - - - -36])。一旦16 s rRNA基因测序的细菌,变量可用于地区种特异的PCR定性或定量的方式。定量PCR尤其有用迅速识别细菌内部调查时使用,测量水平的阴道细菌如何改变。九个高度可变,因此系统发达的地区1540碱基对16 s rRNA基因被描述和指定V1 V9 (37]。引物的选择目标是守恒的区域在不同的侧面变量区域可以深刻影响细菌的多样性物种识别(38,39]。

理论上是可以检测到所有已知细菌物种如果合适的广泛PCR引物或组合不同的引物对就业。目前研究关注总基因组DNA的提取阴道分泌物拭子或从cervicovaginal灌洗液和16 s rRNA基因的扩增引物,结合守恒的网站出现在许多物种。获得的序列是一致的,而大型数据库的16 s rRNA序列(http://greengenes.lbl.gov/(40),http://rdp.cme.msu.edu/(41,42),http://www.arb-home.de/(43)来推断已知物种系统发育关系。一些研究依赖克隆库的建设和直接测序克隆一个特定数量的44,45]。这种方法允许好的系统分辨率如果合适的部分的16 s rRNA基因放大。然而,这种方法往往是昂贵的,缓慢的,乏味的。一些调查人员试图限制大量的测序样品通过电泳指纹识别技术,如变性梯度凝胶电泳(DGGE) [46]或末端限制性片段长度多态性(T-RFLP) [47]。在DGGE的情况下,放大产品通过变性凝胶,他们的融化行为主要取决于产品的长度和GC内容(48]。一般引物的之一gc丰富夹,大约40个基点,这是用于检测单碱基变化之间密切的产品。这个夹倾向于降低PCR扩增效率,可以提高PCR的存在的构件(如heteroduplexes [48]。T-RFLP涉及社区的PCR扩增DNA使用荧光标记的引物。结果与限制性内切酶消化和荧光PCR产品终端限制使用DNA测序仪检测到产品。DGGE远小于所暴露出的物种多样性多样性检测到T-RFLP [49),这可能反映出更大的敏感性的荧光检测平台。筛选克隆在图书馆通过放大核糖体DNA限制分析(ARDRA)为了限制克隆测序的数量也是常用的。ARDRA基于限制消化16 s rRNA基因克隆或放大DNA和电泳分离高百分比琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶(7]。

的方法补充广泛PCR是阴道细菌群落的特征利用核酸探针,寡核苷酸互补核糖体rna基因的目标。探针设计从广泛使用序列生成的PCR和测序实验可以有一个广泛的系统发育特异性从领域到应变水平。还有一个数据库维护探针设计的许多细菌从其他领域(http://www.microbial-ecology.net/probebase/)[50]。探针标记的荧光标记和杂化的临床样本。细胞可视化中使用荧光显微镜数字化过程称为荧光原位杂交(鱼)。收集的数据可以在两个定量和定性模式。例如,当荧光探针结合流式细胞术,可以快速统计和收集细胞。共焦激光扫描显微镜,可以想象的空间安排细胞在组织或体液。

7所示。基于16 s rRNA基因多样性研究:限制

尽管分子方法有很多优势栽培方法描述微生物多样性,有许多局限性(51- - - - - -53]。使用的一些所谓的“通用引物”针对16 s rRNA保守区域的基因可能无法检测所有样品中细菌的存在多态核苷酸在守恒的位置。引物更准确地指定为广泛。异质性的16 s rRNA基因在同一物种也可以阻碍指纹分析(39]。降低退火温度在PCR许可使用广泛引物时不匹配从而增加PCR产物的多样性形成,尽管这可能也会允许从人体组织非特异性扩增的DNA。退化核苷酸可以帮助克服缺乏广泛引物多态基础头寸时,遇到但会导致低效率的引物结合由于精确匹配的变体被稀释引物池。如果引物浓度增加到克服这种稀释问题,还有可能增加非特异性产物的形成。Inosine-based引物是另一种简并引物(54),但这些不能成功地使用空斑形成单位(55高保真聚合酶)。一个常用的例子广泛针对16 s rRNA基因PCR引物是27 f f(8)底漆16 s rRNA的基因。这底漆和许多披衣菌、双歧杆菌有多个不匹配,突出这个引物都可能高度效率检测细菌在这些系统组(38]。更频繁,个别物种系统发育组织可能不匹配,导致降低放大效率(30.]。弗兰克et al。38)评估了27个f f(8)引物(指定为27 f-cc 27 f-cm)常用在许多广泛PCR研究和制定一个27 f引物混合物(指定为27 f-ym + 3),包括三个序列通常不会占在许多当代的研究。这些引物更好的匹配与细菌衣原体目和Bifidobacteriales订单里的细菌包柔氏螺旋体属。使用线性的组合与27个f配方和定量PCR扩增,他们表明,制定引物混合物进行检测加德纳菌属鞘突即使在退火温度升高(序列)比27 f引物通常用于文学。几项研究试图描述使用传统的阴道细菌生物27 f底漆和这些研究似乎上会细菌等g .鞘突这是一个常见的阴道生态系统(25,56]。尽管使用复杂的引物混合物可能会增加细菌的多样性被广泛PCR,这种优势有代价的。使用引物混合物时,有轻微的放大效率下降减少引物浓度精确匹配。

我们看到类似的问题与我们广泛的27个f底漆细菌PCR阴道生态位的研究。我们放大的一个区域核糖体RNA操纵子使用27 f [57)修改一个简并度r (f-cm 27日)和189年(58的退火温度。克隆库分析模型与BV显示没有主题加德纳菌属鞘突(图2未公开的数据)。相比之下,利用不同的正向引物(338 f)和相同的反向引物,g .鞘突成为占主导地位的克隆在图书馆(图2)。此外,我们可以看到在图2,使用不同的引物在同一阴道样本结果大大不同等级丰富情节。例如,一个挑剔的细菌梭菌属的订单指定BV-associated细菌1 (BVAB1)使用338 f检测引物在所有三个小说里的细菌梭菌属的秩序与BV (BVAB1、BVAB2 BVAB3)发现了27个f底漆。5最普遍发现克隆序列匹配,包含了338 fg .鞘突1型,Atopobium阴道类型1、BVAB1g .鞘突2型,消化链球菌属而最丰富的克隆与27个f底漆答:阴道类型2、BVAB2Mobiluncus mulieris、BVAB1和一个Eggerthella -像细菌一样。使用两组引物,我们发现总共22 phylotypes其中10例表现为单物种(检测到单个克隆)。时相比,这是每一对引物,我们可以发现只有15 phylotypes,包括5单件338 f底漆和8个克隆与27 f底漆。我们也注意到,27日f底漆结合189 r往往是有偏见的答:阴道,因此没有提供具有代表性的细菌丰度的反射(图2)。然而,我们发现,创建两个克隆库与不同的正向引物导致检测phylotypes,再次强调所强加的限制一个引物对的选择。因此,我们建议使用的广泛引物组合在同一样本可能最大化发现物种的多样性,但这是有代价的花费额外的时间和金钱。

DNA提取是至关重要的一步。代表的DNA池将被用于PCR扩增。物种的偏见对不同的提取方法是众所周知的59,60]。抑制剂在临床样本的血液、粘液,或阴道的产品可能导致失败的放大或减少产品的数量。放大DNA质量控制是有用的跟踪在特定目标基因的PCR等β球蛋白(23)或18 s rRNA基因(61年)可以表明如果amplifiable从人体组织中提取DNA。使用内部放大控制通过添加一个外生模板在已知浓度的临床样本的检测可以帮助微妙的PCR抑制剂(62年,63年),特别是当执行定量PCR分析。

的另一个问题广泛PCR针对16 s rRNA基因是缺乏系统分辨率对一些细菌,即使在物种水平。例如,不同的物种内肠杆菌科有非常相似的16 s rRNA基因序列。其他基因目标提供改善了一些物种的系统发育决议,如σ因子rpoB现在在每一个副本基因组(64年- - - - - -67年]。使用的缺点rpoB作为一个标记缺乏可用的序列相比,16 s rRNA的基因。另一个选项是检查内部转录间隔区地区核糖体基因间的间隔分析区分密切相关的菌株(68年- - - - - -70年]。在这里,序列和异质性大小可以限制至关重要,数据库(http://egg.umh.es/rissc/)支持这个地区是小相比,那些支持16 s rRNA基因序列。

关联16 s rRNA基因副本的数量(因此克隆)细菌的数量通常是不可能的,不同种类的细菌可以有不同数量的每个基因组核糖体rna基因操纵子(1 - 15)和大多数物种的确切数字是未知的71年- - - - - -73年]。较高的细菌核糖体rna操纵子复制数字将过度代表在克隆库相比,细菌复制数字较低,从而引入偏见在社区分析(74年]。此外,不同的细菌有不同的敏感性溶菌作用的基础上,提取方法从而导致使用不同数量的细菌中观察到后续分析。

类似地,假阳性可以影响社区分析当针对16 s rRNA基因使用广泛引物。低水平的细菌的DNA可能出现在实验室或PCR试剂和DNA提取试剂盒。Taq聚合酶用于PCR扩增可以污染16 s rRNA序列(75年,76年]。监控这个问题的方法是包括PCR的负面控制在每一个运行。没有模板PCR控制允许检测PCR试剂引起的污染物和水被用于每个PCR实验。此外,它是非常有用的,包括提取控制在虚假的样品处理和提取以同样的方式作为实验样本。这些提取的控制应进行PCR和分析的产品(如克隆/测序)与样本识别感兴趣的任何污染物。限制的数量放大周期和使用大量的模板DNA也有助于减少放大介绍了低水平的污染物,可能在不同的样品制备步骤。PCR污染的一个重要来源是来自以前放大产品。这可以由分离预处理和post-PCR工作空间,使用气溶胶过滤吸管技巧,增加尿嘧啶糖基化酶灭活之前放大PCR产品。

PCR扩增步骤本身可以引入偏见等扭曲的代表样本的基础上,鸟苷+细菌的胞嘧啶(G + C)内容(77年,78年]。G + C含量较高的细菌可能会导致较低的低吞吐量与细菌相比G + C。PCR增强添加剂如甜菜碱(79年),二甲亚砜(80年),或甲酰胺81年)通常用于平衡的通读效率不同的模板不同G + C含量而减少环境创建的β巯基乙醇,二硫苏糖醇(82年]似乎提供未指明的PCR增强效果。商用的PCR增强剂(例如,Q-solution试剂盒,PCR增强器解决方案从英杰公司)可以是昂贵的和他们的成分是不清楚。低成本的内部试剂如甜菜碱、二硫苏糖醇、二甲亚砜已被证明提高定性和定量pcr的输出83年]。

PCR产物是一个著名的限制在使用广泛PCR方法。公司使用不正确的核苷酸Taqpolymersase可能导致错误的序列。Heteroduplexes时形成引物可能成为限制和/或有更大的模板多样性(84年,85年]。使用空斑形成单位聚合酶具有来核酸外切酶校对功能允许misincorporated核苷酸的校正,因此相比有更少的错误Taq聚合酶(86年]。还有其他的高保真当前可用的DNA聚合酶等发泄DNA聚合酶分离Thermococcus litoralis和Phusion DNA聚合酶海床如酶与双链dna结合域。前一个推荐的策略限制heteroduplex分子克隆是reamplify 10倍稀释PCR产品包含混合模板的过程称为“整理PCR”[85年]。形成嵌合体(87年,88年需要仔细监测和识别。嵌合序列PCR工件时出现两个或两个以上的系统不同的序列成为合并成一个序列,当聚合酶在扩展模板之间跳跃。等在线工具可用来检测嵌合体柏勒罗丰[89年],野鸭[90年),或针尾鸭分析(91年]。

虽然广泛16 s rRNA基因PCR方法提供了一个良好的人口普查的细菌存在于临床样本,没有功能基因组信息。宏基因组方法已经被应用于环境样品(92年,93年),但缓慢适用于阴道环境由于缺乏创建一个支架的整个基因组序列信息。目前有NIH-led倡议全基因组序列从阴道利基可培养的细菌宏基因组研究提供必要的基础(http://nihroadmap.nih.gov/hmp/)。

8。在阴道利基分子研究:一个重要考试

推进技术和降低成本的测序,最近有很多关于人类阴道微生物群增加我们的知识。阴道可能瞬态的条件,取决于众多因素,大多数分子研究提供在特定条件下阴道微生物群的快照。此外,不同的定义“正常”,很难在许多研究比较数据。我们目前的调查在阴道利基关键分子调查,突显出每种方法的重要贡献和局限性。

伯顿和里德26)是第一个调查人员分析阴道微生物群的利基使用广泛的分子的方法。他们应用广泛的结合细菌使用引物PCR HDA-1-GC GC夹(338 f)和HDA-2 (515 r)和DGGE阴道样本从20无症状的绝经后妇女获得和使用Nugent分数区分健康和患病的状态。有趣的是,70%的女性有中级植物或BV的纽金特得分,表明女性阴道菌群异常的患者占比例比一般人群在他们的研究。广泛PCR针对约200个基点的16 s rRNA V2-V3可变区域的基因和DGGE分析表明,纽金特分值较低的受试者只有一到两个乐队,主要来源于乳酸菌物种,而中间植物或纽金特得分较高的0到4乐队代表加德纳菌属,普氏菌,消化链球菌属,拟杆菌,乳酸菌,链球菌,Slackia物种。的检测乳酸菌内心在受试者通过革兰氏染色剂与正常菌群是一个新奇的发现。属特定PCR也用于监测细菌物种被广泛PCR。本研究利用的力量广泛和taxon-specific PCR方法,但DGGE方法可能限制了多样性检测。

从这项研究中一个重要的观察26)是不同的研究对象与BV有不同的DGGE图谱表明组成的异质性与BV受试者的细菌类群。我们使用不同的方法观察到类似的结果。例如,图3说明观察到细菌的组成和数量的差异与BV phylotypes在两个科目。阴道样品受到广泛16 s rRNA基因PCR引物338 f - 1407 r其次是克隆、测序,对齐,和系统发育分析。最普遍的phylotypes主题包括加德纳菌属鞘突,普氏菌BVAB2 sp. 1型,普氏菌sp.类型2,纤毛菌属amnionii。相比之下,最普遍的细菌克隆B包括BVAB1主题,Sneathia sanguinegens,普氏菌sp. 1型,候选人部门TM7,普氏菌sp. 2型,从而说明了细菌与BV phylotypes两学科之间的差异。

从这些调查人员在后续的研究中,同一引物HDA-1-GC和HDA-2 PCR条件应用于6样品获得每周从51岁女性复发性BV(由纽金特得分)。总体而言,7细菌物种被发现包括克雷伯氏菌oxytoca,沙雷氏菌属fonticola,枸橼酸杆菌属freundii,摩根氏菌属morganii, Kluyvera ascorbata,大肠杆菌,葡萄球菌epidermidis(94年]。没有细菌通常与阴道相关的利基在这项研究中发现了。同样,当引物HDA-1-GC和HDA-2阴道样本与BV 34 HIV-seronegative尼日利亚的女性群体的,非典型BV-associated细菌被广泛PCR检测和DGGE [95年]。令人惊讶的是,34个样本,10只4乐队,16日有3个乐队,6 2乐队,2有一个乐队。如果每个乐队都对应于一个细菌phylotype,细菌多样性与BV在这项研究是大大低于在其他的研究中发现,多样性可能反映了DGGE方法使用的局限性。35%的受试者的主要生物被发现支原体。一个未受教育的链球菌sp.被发现在24%的主题和相关的细菌虹鳟鱼肠道细菌被发现在26%的受试者。没有几个著名BV-associated细菌可能与引物的选择,尽管作者使用了相同的引物检测加德纳菌属,普氏菌,Mobiluncus,Atopobiumsp.在一项研究26]。在这项研究中观察到的不同的结果也可能是由于不同的退火温度:在前面的研究(26),在后来的研究中(96年),或由于不同的主体人群。在这些研究中使用的引物有40-mer GC夹已经包括了DGGE分析导致60基地长引物,这可能导致低效的放大。根据提供的数据,作者认为细菌与BV在尼日利亚妇女不同于细菌与其他人群BV的女性进行了研究。额外的分子研究评估相关的细菌社区BV来自各种女性代表不同的人群需要评估在女性阴道微生物群异质性的程度。

周et al。45)调查了5的细菌社区”显然健康”女性。妇女被列为健康使用结合妇科检查和自我报告的症状,但Amsel数据的临床标准或阴道分泌物革兰染色没有获得或提供。这是本研究的一个主要限制与许多女性BV是无症状的。920个基点片段的16 s rRNA基因放大使用引物8 f,也称为27 f(实际引物序列未指定),和926 r和产品是克隆和测序。在176年和250年之间克隆测序从每个主题导致2到7细菌phylotypes /主题。两个受试者阴道细菌占主导地位的生物群乳酸菌crispatus,而乳酸菌内心中检测出3个科目。这些调查表明,三个小说分类群与健康相关的阴道等Atopobium阴道,一个Megasphaera物种,纤毛菌属物种。然而,这些细菌已被其他研究者与BV (7,25,26,97年]。作为标准客观标准并非用于BV的诊断,很难得出结论从这项研究的成分正常阴道细菌生物群。

海曼et al。44]调查上的细菌阴道上皮广泛PCR、克隆库建设和测序大约1400个基点的16 s rRNA基因在20绝经前的女性可能是健康的。而在诊所进行了身体检查和妇女被报道是无症状的,作者没有报告数据使用Amsel BV状态的临床标准或阴道分泌物革兰染色;这是一个很大的限制。的基因组DNA进行PCR扩增使用传统的8 f (f-cm 27日)和1492 r引物。正向引物有一个不匹配Atopobium种虫害和反向引物也有可怜的同源性可能导致贫穷的代表Atopobium种虫害的库。一千年克隆被选为每个主题和测序从两端使用传统的测序。四只的20个受试者乳酸菌物种非常高的序列多样性表明这些阴道细菌没有克隆。九个受试者的组合乳酸菌种虫害和其他细菌包括双歧杆菌属,加德纳菌属,Atopobium。剩下的群7妇女没有任何细菌混合居住的乳酸杆菌,但殖民地,包括细菌与BV的其他调查。本研究提供了丰富的资源基因库的阴道细菌16 s rRNA基因序列,但都非常有用,如果额外的临床和微生物数据已经收集排除BV的女性或定义的条件。这些研究者发现序列等一些细菌假单胞菌和Stenotrophomonas物种已知PCR克隆库污染物。是有助于描述PCR和提取控制来证明这些细菌引起的阴道上皮和不虚假地探测到广泛PCR。

Verhelst et al。25)培养和分子技术的组合来确定阴道细菌8科目其中3有正常菌群,2有中间植物,3 BV是由关和干草的革兰氏染色法21]。隔离从文化研究发现使用16 s rRNA基因测序或通过评估指纹模式之间的间隔区域转移核糖核酸基因。广泛PCR引物10 f (27 f-cc,不包括前两个基地的27 f底漆)和534 r是用来放大500个基点的16 s rRNA基因片段克隆产生的854年的8个主题。分析了克隆使用ARDRA和克隆具有独特ARDRA模式被测序的细菌的识别。总共有38种确定使用这两种方法,其中18例被克隆,5发现单靠文化。健康受试者阴道细菌生物由乳酸杆菌而中间植物或BV植物细菌多样性。Atopobium阴道和几个BV-associated细菌中发现大量的克隆产生的不正常菌群的主题。PCR引物选择广泛被证明是一个贫穷的匹配检测加德纳菌属鞘突,孤立的种植。然而,g .鞘突特定PCR表明,这种细菌与BV。这项研究强调了使用的重要性相结合的方法来实现一个完整的图片阴道细菌多样性和广泛的需要优化引物PCR。革兰氏染色剂的使用分析来评估BV地位是值得称道的。

弗雷德里克·et al。7)评估阴道中的细菌群落生态位使用广泛PCR引物338 f和1407 r放大1000个基点从16 s rRNA基因片段。这种方法应用于阴道样本9主题BV和8没有使用Amsel BV的临床标准定义BV的横截面分析。此外,串行阴道样本还获得有限数量的学科来研究细菌组成的变化与事件有关,治愈,复发,持久BV。一百年从每个主题选择和筛选克隆用ARDRA两种限制性内切酶。插入与独特的模式被测序。BV的女性表现出高水平的物种多样性平均为12.6细菌phylotypes与没有BV的女人平均的3.3 phylotypes克隆库。乳酸菌物种,特别是乳酸菌crispatus和乳酸菌内心在没有BV的女人的。l . crispatus没有检测到与BV科目,虽然l .内心的被广泛流行。包括其他细菌中发现受试者BV加德纳菌属鞘突,Megasphaera,纤毛菌属,Dialister,Atopobium和一些细菌性阴道炎相关细菌(BVABs)梭菌属的秩序。三个小说的细菌梭菌属的秩序是非常具体的指标BV (7]。BVAB1、BVAB2 BVAB3属于门但不密切相关的任何梭状芽胞杆菌细菌16 s rRNA已知的基因序列。主题与事件BV转变从一个生物群由乳酸杆菌与多样性增加一个包括许多假定的厌氧菌。主题与治愈BV增加乳酸杆菌克隆物种多样性和萎缩。主题与复发与BV BV有伟大的多样性在0天,紧随其后的是主要的收缩l .内心的在28天治愈,然后扩大系统丰富的微生物群在100天复发。主题与持久BV有持续多样化的阴道生物群天0,24岁,到64年,尽管有一些物种的变化表示。本研究的一个限制是,使用ARDRA筛选克隆测序可能未被充分代表的细菌多样性的观察,这种方法往往归并到一起不同phylotypes相似的序列。此外,只有100分析了克隆库(或阴道样本)这有限的少数物种的检测。为了可视化细菌,鱼进行阴道涂片BVABs针对每一个小说。BVAB1被证实是一个薄弯杆(图4);BVAB2短,脂肪杆和BVAB3长,lancet-shaped杆。我们已经进行透射电子显微镜在阴道样本含有高水平的BVAB1由广泛PCR克隆库分析,种特异的PCR和鱼实验。电子显微图显示长弯曲半透明区域的细菌细胞的外边缘,我们认为BVAB1(图5)。这与更大的、更广泛的和均匀的电子致密细胞中观察到的透射电子显微照片Mobiluncus curtisii从一个纯粹的文化。

我们有进一步的编译克隆库数据对象有或没有BV(图6)。使用广泛的细菌与16 s rRNA基因PCR引物338 f - 1407 r, 1327个克隆测序来自13个主题没有BV(图6(一))。1327年克隆分析,65.4%的序列乳酸菌crispatus和28.8%的代表乳酸菌内心克隆。剩下的5.8%的克隆包括等其他细菌加德纳菌属鞘突和其他乳酸杆菌(图6(一))。这些数据进一步验证对象没有BV阴道细菌生物以乳酸杆菌为主。相比之下,分析23克隆库从17个学科BV生产了2577克隆,并演示了一个很高程度的细菌多样性(图6 (b))。平均每个主题与BV 14物种和顶部12 phylotypes占89%克隆测序。剩下的11%的序列32 phylotypes表示。目前,我们不欣赏“长尾”的作用不那么普遍的细菌虽然可能导致代谢和功能多样性在这个利基。此外,细菌的多样性中观察到的女性BV综合症。表明这可能是一个幼童腹壁薄弱

使用范围广泛的细菌PCR结合克隆和测序提供了一个合理的估计最丰富的细菌的多样性,但吞吐量较低是一个昂贵的方法。蒂斯et al。98年)使用范围广泛的组合16 s rRNA基因的PCR扩增结合T-RFLP指纹的阴道拭子从50名女性阴道细菌群落与BV和20名健康女性由纽金特得分。作者提出,PCR结合T-RFLP有用快速评估是最丰富的细菌,因此可以用作一个工具屏幕BV。引物对扩增包含27个f (f-cc 27日)和926 r和标记的使用6-carboxyfluorescein (6-FAM)和4个7,,,分别-hexachloro-6-carboxyfluorescein(十六进制)。限制片段长度是决定使用一个自动化的音序器和片段进行了分析使用一个内部的软件程序。识别的片段的测序验证了PCR产品。总共23 phylotypes与BV的样本被检测出对象,平均6.3 phylotypes主题(2 - 14)的范围包括Atopobium阴道,加德纳菌属鞘突,Megasphaerasp。乳酸菌内心,Eggerthellasp. BVAB1, BVAB2, BVAB3。注意,物种丰富度在本研究主题与BV是发现不到,由调查人员使用不同的分子方法。一致的结果在其他研究7,44),Mobiluncussp.中发现只有2 BV的50个主题。只有乳酸杆菌包括乳酸菌内心,乳酸菌crispatus组和加氏乳杆菌组样本中发现受试者没有BV。指纹识别方法的局限性之一是无法区分物种密切相关。例如,该研究的作者无法区分Mobiluncus curtisii和Mobiluncus mulieris之间也不同普氏菌phylotypes。这项决议的问题可以解释观察到的低数量的每个主题phylotypes在这项研究中。研究的一个关键优势是大量的样本处理从主题/ BV由革兰氏染色剂。

摩天et al。97年]PCR扩增300个基点的16 s rRNA基因广泛引物1055 f - 1392 r从阴道样品从受试者有或没有获得BV从阴道分泌物革兰染色确定。DNA受到DGGE和乐队确认Atopobium阴道被确定在12的22个科目与BV和只在2的24个对照组。答:阴道还通过培养分离出2主题和甲硝哒唑耐药。在另一项研究中,答:阴道特殊技能PCR引物扩增155 bp扩增子应用于同一研究对象(99年]。特定的引物进一步加强检测答:阴道这种细菌与BV科目而不是在BV发现负面主题的建议答:阴道对BV是非常具体的。通过全局细菌引物PCR扩增和T-RFLP研究还显示的相关性答:阴道BV的Verstraelen et al。One hundred.]。

弗雷德里克·et al。23)使用有针对性的PCR方法检测17个关键阴道细菌更敏感的方式比用广泛PCR是可能的。PCR结果与目前BV的共识诊断方法以确定定性PCR方法可用于BV的分子诊断。特定的引物针对不同地区的16 s rRNA基因特定细菌种类的设计。细菌是基于克隆选择库数据之前生成的(7BV),他们明显的特异性,或者他们的新奇。所有PCR产物测序证实他们相似的预定目标。引物是应用于264年获得81例阴道样本没有BV BV和183例。细菌的梭菌属的订单,Atopobium,一个Eggerthella例如细菌,Sneathia /纤毛菌属,Megasphaera类型1和2,细菌从TM7 BV内有非常具体。乳酸菌crispatus与BV反向相关的优势比0.02确认它在很大程度上是与健康阴道菌群。加德纳菌属鞘突通常与BV相关联,发现可怜的BV的特异性。g .鞘突被发现在96%的受试者BV但也发现70%的受试者没有BV。的组合检测的一个梭菌属的(BVAB2)或细菌Megasphaera1型生产最好的敏感性和特异性PCR诊断BV,无论金标准诊断标准(敏感性99%,特异性89%)。这表明,PCR扩增的关键阴道细菌确实可以用于BV的分子诊断。然而,这里使用的方法需要电泳检测放大产品可能不是最优在临床的设置。更好的方法是使用定量PCR,提供实时搜索结果和量化细菌的能力。水平的细菌疾病的可能是一个更好的指标比存在/没有特定的物种。

一些研究调查了实用的定量PCR (qPCR)作为BV诊断工具。沙et al。101年)第一组检查使用qPCR BV的诊断,定位加德纳菌属鞘突,支,乳酸菌物种使用203 BV的女性样本(纽金特得分7 - 10)和203样本没有BV的女人(纽金特得分0 - 3)。只有75的203名妇女与BV Nugent Amsel标准分数是积极的。增加的水平g .鞘突和m . hominis和减少乳酸杆菌与BV是显著相关的敏感性和特异性83%和78%相比,纽金特得分。这项研究并没有评估女性中间植物。

在随后的研究中,Menard et al。102年研究协会加德纳菌属鞘突以及Atopobium阴道负载由定量PCR和评估其效用作为诊断工具在231年样本204名女性。纽金特标准被用来评估BV状态,将167个样本分类为正常菌群,20个样本作为BV, 44样品中间植物。他们表明,组合的存在答:阴道在DNA水平拷贝/毫升g .鞘突在拷贝/毫升敏感性和特异性为95%和99%,分别。然而,主题与中间植物被排除在分析之外。不幸的是,这项研究的有前景的结果不能反映这些化验如何执行在临床环境中所有女性正在BV筛查,包括那些与中间植物Nugent得分。是帮助收集数据在这些女性Amsel临床标准评估BV状态使用另一种标准来确定所有女性的分子生物学方法的可靠性。另一个限制是相对较少的女性BV(20)的研究。小群验证的56岁女性被评估,其中7例认为BV通过革兰氏染色剂和10中间植物。11这些分子标准BV 56岁女性。目前还不清楚如果作者提出对所有女性中间植物BV时BV-associated细菌的分子证据。

Zozaya-Hinchliffe et al。103年评估患病率和大量的不文明的Megasphaera例如细菌阴道使用定量PCR瞄准两个利基Megasphaeraphylotypes 41的女性群体的。受试者诊断阴道革兰染色和Amsel的标准。引物专门针对每种测试大使用阴道克隆。Megasphaera1型中检测出76%的受试者Megasphaera2型被发现在52%的受试者。此外,Megasphaera1型与BV受试者的浓度高(5数量级)科目没有BV,和这种细菌明显与BV (),是Megasphaera2型()。的系统发育分析表明,序列数据Megasphaeraphylotypes形成两个支持演化支不匹配序列来自瘤胃,内脏,或口腔环境,表明这两个phylotypes可能是特定于阴道利基。

目前BV的治疗策略包括抗生素口服或局部的管理。7天或阴道的使用口服灭滴灵甲硝哒唑5天的结果有所改善的症状在83% -87%的女性(2到3周内104年,105年]。有类似的响应率与阴道克林霉素的使用。阴道再度移民率与乳酸杆菌是相似的两种抗生素,通过检测乳酸杆菌革兰氏染色剂定义21 - 30天后开始抗生素治疗(106年,107年]。虽然在许多女性应对抗生素,持久性或复发的情况发生在11% -29%的女性在1个月104年,108年,109年]。此外,长期复发率已被证明要大于70%19,110年,111年]。马拉佐et al。63年]调查几个风险因素BV坚持治疗后一个月,包括关键阴道细菌物种特异性PCR的检测。持久BV有25.8%的女性在1年期的随访中由Amsel的临床标准,由阴道分泌物革兰染色也证实。针对细菌16 s rRNA Taxon-specific pcr基因被用来检测BVAB1, BVAB2, BVAB3,Peptoniphilus lacrimalis,Megasphaera2型,Mobiluncus curtisii在基线和月后续访问。数据分析是否存在的细菌。Atopobium,加德纳菌属鞘突,Megasphaera1型,乳酸菌内心被发现在96%的受试者基线,因此,这些细菌并不包括在评估风险因素的持久性。女性BVAB1、BVAB2或BVAB3在基线2-8-fold增加持久BV的风险。同样的,存在的p . lacrimalis或Megasphaera在基线的2型三倍的风险增加持久BV。其他危险因素,如性行为通常与持久性也检查了,但没有与持久的BV在这个研究。这种方法的一个局限是,持久性数据是基于定性检测细菌而不是定量分析。定量PCR可以帮助确定细菌水平保持不变在抗生素治疗(抗生素耐药性),或者如果水平下降,但细菌不根除,允许未来的复发。本研究的另一个限制是关注女性与女性发生性关系。目前还不清楚如果相同的模式将与BV女异性恋者。

奥克利等人。112年)进行了系统分析的细菌多样性的女性没有定义BV,将数据从基因库,包括公开的16 s rRNA获得基因序列数据的阴道利基。共有969个序列对齐和分配分类学分类使用绿色煤电16 s rRNA基因数据库(113年]。基于自相似性的序列进行了进一步分析相比,而不是与外部数据库和分为操作分类单元(辣子鸡)使用DOTUR软件包[114年)以97%的序列相似性截止,这是通常用于物种定义(115年]。实际上,对象与BV有更大的细菌的多样性;截止在97%,女性与BV辣子鸡的数量(三倍15辣子鸡)相比,受试者没有BV (5辣子鸡)。这项研究取得的一个有趣的观察是,尽管有相当数量的变化与BV不同学科之间的细菌种类,在门级,拟杆菌的细菌和放线菌与BV密切相关。作者指出,研究评估细菌多样性阴道利基市场可能低估了真正由标记细菌多样性的NCBI-based名称肿块细菌与已知的物种。例如,序列分为普氏菌使用绿色煤电NCBI分类方案的分类工具实际上代表21辣子鸡基于97%截止使用DOTUR分析工具,揭示意外高阴道phylotypes或物种的数量在这个属。这些不同的阴道phylotypes可能有不同的功能,代谢和炎症属性。这项研究的限制奥克利等人。112年)是绿色煤电NCBI分类工具可以分配不同的身份相同的序列仅仅基于序列长度。例如,100%的身份但不同长度的两个序列可以被指定为加德纳菌属或双歧杆菌属。类似地,两个相同的Atopobium序列只在序列长度可以不同Atopobium或Olsenella。序列划分为双歧杆菌属NCBI分类方案的数据库被归类为绿色煤电加德纳菌属在RDP数据库中。这种差异强调定义细菌命名法的更大的问题,这是一个持续的挑战微生物生态学家。解决这个问题的一个方法是创建一个数据库的参考序列,所有新序列相同的利基提交。这也让小说严格跟踪序列。随着我们的发展更好地了解阴道的生态生态系统,我们希望所有的研究者能够使用相同的分类命名法便于比较研究。例如,有一个人类口腔微生物数据库提供相互参照分类和大约600个物种的基因组信息(http://www.homd.org/)[116年]。

周et al。56)研究了在白人和非洲裔美国女性阴道细菌社区在美国。等他们应用T-RFLP分析144名女性同样年龄和种族的不同地点在美国。受试者分为基于考试由医务人员健康,但是BV地位没有使用Amsel报道临床标准或阴道分泌物的革兰氏染色剂评估。限制片段模式分析鉴定了12个细菌社区出现在至少2女人,和8个社区出现在单一主题。使用广泛16 s rRNA基因PCR引物8 f (f-cc 27日)和RD1r [117年),57克隆库进行了分析6000个克隆测序。16 s rRNA的系统发育分析获得的基因序列导致细菌的分类生物群8”超群。“五8超群的以乳酸杆菌为主,占80%的女性。超群三世,占16.5%的女性样本,有低水平的乳酸杆菌和细菌多个其他团体的多样性与BV有关,如Atopobium阴道,细菌的梭菌属的订单,Megasphaera,Dialister,Anaerococcus,Finegoldia,Peptostreptcoccus,真细菌。因为客观标准不是用来评估BV状态(或没有),目前还不清楚如果这些受试者BV还是BV-associated细菌殖民没有BV的女人在这个研究。该研究的作者分析了细菌社区“超群”是否专门与种族有关。统计分析表明,超群三世和八世(包含一个进化枝Lachnospiraceae)经常被发现在非裔美国妇女。阴道细菌社区不是由乳酸杆菌被发现在33%的非洲裔美国女性和白人女性的7%。众所周知,美国黑人女性比白人女性有较高的BV (11]。阴道微生物群的种族差异“健康”女性指出在这个研究可能只是反映了BV的失败来评估。相当大一部分女性BV是无症状,因此评估BV状态基于自我报告的症状,在这项研究中,是不可靠的。然而,事实上,非洲裔美国女性的患病率较高BV,因此往往有更多样的阴道细菌社区乞求一个解释。论文的优点包括大量的样品处理,使用T-RFLP屏幕对于社区类型,和严格的统计分析应用。局限性是BV的缺乏客观的诊断标准和使用的27个f底漆广泛分析同源性较差一些阴道细菌可能占到几乎可以忽略不计的加德纳菌属鞘突检测到。细菌社区“超群”的意义是减少当阴道细菌的关键成员的社区往往未被充分代表,尽管这是一个由所有研究使用共享的问题广泛PCR在某种程度上。

一项研究评估了阴道微生物群从16名女性没有BV(评估Nugent得分4),用pcr方法针对chaperonin-60基因(尼泊尔共产党60)(118年]。Chaperonin-60存在于所有细菌和蛋白质的折叠和组装需要和蛋白质复合物。大多数受试者殖民与乳酸杆菌主要包括乳酸菌crispatus、加氏乳杆菌、乳酸菌jensenii,乳酸菌内心。其他序列识别包括那些相似加德纳菌属鞘突,Porphyromonasspp。Megasphaeraspp,Chlamydophila psittaci。这是唯一的研究,检验了阴道中的细菌的多样性利基使用不同的目标基因。这项研究的结果提供了一个不错的确证研究使用16 s rRNA基因作为目标,在乳酸杆菌已被证明没有BV主导细菌生物学科。的检测c . psittaci作为正常阴道菌群的一部分很有趣而奇怪因为这衣原体物种被认为是呼吸道和人畜共患病原菌和以前没有发现在人类阴道,尽管它已经检测到的绵羊的阴道。使用一个不同的目标基因提供了不同的视角在微生物群落的成分。然而,有限的数据库cpn60基因序列可能妨碍准确细菌鉴定和系统发育推断的一代。

9。焦磷酸测序:高通量测序的方法

虽然传统测序技术为我们提供了一个框架,阴道中的细菌多样性的真实程度细分市场了解甚少。序列数据的分析从100年甚至1000年克隆结果在图书馆与许多phylotypes发现的长尾单线态克隆数据代表在排名时丰富的情节。基于文化技术,据估计,每克阴道分泌物阴道细菌的密度范围集落形成单位(119年]。如果一个主题阴道分泌物的细菌/通用汽车和100克隆为特征,细菌出席CFU或低于不太可能被包括在分析中。此外,经典克隆库分析倾向于提供更少强调少数物种的长尾(51]。事实上,人口普查的细菌在低浓度可能提供重要的遗传和功能多样性的细节在这个利基(51,120年,121年]。这尤其BV等相关的综合症,我们仍然不理解感染的发病机理。

另一种方法来获得大量的序列是通过焦磷酸测序技术。焦磷酸测序是一个“合成测序”方法涉及的单链DNA测序,测序互补链酶同时监控光子生成的每个基本(122年]。技术应用水平确定隔离在小范围内通过分析V1和V3的签名序列区域的16 s rRNA基因在96孔板123年,124年]。早期的方法的一个缺点是获得的长度很短的阅读(25 - 100核苷酸长)限制准确的系统分类。

目前,焦磷酸测序技术进一步发展,现在可以实现再读250至300个基点的吞吐量400 000读取每7.5小时运行,可以生成1亿基地(基因组测序仪FLX系统- 454生命科学)。从阴道中提取DNA样本可以放大使用融合广泛引物(与适配器序列修改)针对16 s rRNA的可变区基因。适配器的PCR产物序列连接到显微镜捕获珠子。Emulsion-based克隆扩增(emPCR)可以创建多个副本的目标16 s rRNA每珠不需要基因序列克隆序列的细菌。然后这些珠子是转移到测序picotitre板。焦磷酸测序技术已被用于在各种环境中微生物群落分析(125年- - - - - -130年]。

Sundquist等人研究了阴道中的细菌生物样本6孕妇在怀孕期间使用的所有三个三学期制广泛细菌PCR与深焦磷酸测序(129年]。大部分的细菌16 s rRNA基因PCR和基因的部分被扩大了然后被焦磷酸测序。共有100 000 - 200 000序列读取100个基点平均长度得到的6个样品。每个阅读加工使用咩咩的工具,爆炸之类的对齐工具(131年),和一个数据库的细菌从RDP和古细菌序列获得的序列prokMSA。两个研究人员面临的主要障碍。首先,长度短的阅读难度分配顺序读取发展史。例如,尽管90%的读取识别域层次,确定了不到10%的物种水平。只有约50%的序列被明确分配类级别,这可能是因为两个守恒的放大和可变区域的16 s rRNA基因,限制了系统分辨率。作者还进行了模拟计算和显示增序列读取长度800 bp在系统分配有着重要的影响。目前的454技术允许读取250个基点和400个基点读取的长度在地平线上或在这次审查的时间。调查人员所遇到的第二个挑战是缺乏公共数据库序列导致许多细菌被归类为“未知。“这个问题将会改善随着时间的推移越来越多的序列被添加到数据库中。依照数据从传统的克隆和测序实验,获得Sundquist研究表明,受试者主要殖民地与乳酸杆菌和其他各种各样的细菌在低浓度中包括一些如Comamonas。在我们的手中,Comamonas种虫害是常见的PCR污染物通常出现在水样本。为研究并没有从消极控制如虚假的报告结果提取DNA, PCR和随后的焦磷酸测序,很难评估Comamonas的确是一个阴道细菌生物的一部分。必须进行适当的负控制特别是焦磷酸测序研究技术包括深度测序,因此可以轻松地拿起即使在低浓度污染序列。

10。细菌性阴道炎:生物膜综合症?

生物膜与人类感染密切相关,65%的感染治疗医师在发达国家已被归因于生物膜(132年,133年]。有新证据表明生物膜与BV (134年),有人建议,这种生物膜可能发病机制的关键。Swidsinski et al。134年]demonstated附着细菌生物膜的存在90%的受试者BV只有10%的受试者没有BV表现出类似的生物膜。附着生物膜的细菌被定义为草坪紧密附着在阴道上皮表面,含有特定细菌组。活检收集,没有女性的BV切割并且固定了鱼和各种细菌rRNA-targeted探针杂交。一般来说,主题与BV有细菌附着生物膜主要是由3组:加德纳菌属鞘突出现在60 - 90%的生物膜的质量,Atopobium占1 - 40%的生物膜的质量,和乳酸杆菌是目前在1 - 5%之间只有20%的活检样本。受试者没有BV要么没有与只有少数乳酸杆菌生物膜分散零星或有一个宽松的细菌生物被膜没有任何特定的结构和主要组成的乳酸菌物种。

我们实验室的初步数据也表明附着生物膜的存在与BV(图对象7)。活检获得,没有女性的BV在酒精福尔马林固定,切片和一套检查使用鱼细菌rRNA-targeted探测器和6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) DNA结合荧光染色。我们的数据也表明存在g .鞘突生物膜在女性与BV(图7),而主题没有BV没有生物膜分散乳酸菌物种。

最近,Swidsinski等人评估口服灭滴灵的效果在BV生物膜(135年]。一群18个受试者与BV诊断由革兰染色和Amsel标准,口服灭滴灵治疗,疗程1周。随后,进行了跟踪评估每隔1周5周,3主题代表每个时间点。阴道活检检查使用鱼探测目标所有细菌或特定的细菌等加德纳菌属鞘突,Atopobium,乳酸菌spp。拟杆菌/普氏菌,肠杆菌科。尽管如此,所有科目的研究被认为是治愈BV的抗生素治疗,阴道活检显示持久的生物膜。在抗生素治疗,生物膜可以可视化与DAPI (DNA染色),但有鱼吸收差探测目标rRNA表明细菌没有积极代谢。然而,5周结束时,一个积极代谢附着细菌生物被膜主要由检测g .鞘突和Atopobiumsp。135年]。临床上,BV复发没有记录由于在研究随访时间有限。重要的本研究的局限性,作者还指出,包括小样本大小和基线数据的缺乏。此外,数据集被当作一个纵向队列但每个时间点代表一群3种不同的科目。尽管有这些限制,这项研究代表了一个新颖的方式理解BV的发病机理。

生物膜中的细菌对抗生素治疗的反应不同与浮游同行相比(132年,136年- - - - - -138年),抗生素耐药性是假定为持久和复发性BV的原因之一。一项研究表明,浮游加德纳菌属鞘突对过氧化氢更敏感(5倍)和乳酸(4-8-fold)比g .鞘突生物膜细菌,突显出生理差异存在于相同的生物体在不同生长条件下(139年]。宽容的文学提供了几种解释由生物膜细菌抗生素包括减少生物膜内的抗菌素的渗透和改变生物膜细菌的生理压力(了140年])。为了规避问题的抗生素耐药性细菌生物膜,一项研究使用了益生菌的方法尝试的间隙g .鞘突生物膜(141年]。g .鞘突生物膜生长的体外流离失所这种乳酸菌RC-14和在一定程度上乳酸菌内心常见的阴道利基。未来的研究评估生物膜的结构和成分在BV将成为关键在理解这个共同的病理状态。

11。超越科赫法则:分子指南因果关系

罗伯特•科赫和他的学生阐述了一系列的假设,以确定哪些微生物引起的疾病和微生物被殖民者没有直接病因作用(表1科赫法则)。现代微生物学的诞生在19世纪下半叶的因果关系整合需要一个系统来衡量证据的发现许多人类和动物微生物通过实验室传播有关。这些指导方针,后来叫科赫法则,科赫公司的论文中阐述了“结核病的病原学”,他漂亮的展示了他的思想的基础。罗伯特•科赫是个有先见之明的巨大的微生物学思考得很好通过了一个多世纪的使用。然而,科赫法则的力量不是来自他们严格的应用程序,但从关键的判断,他们培养的精神。

受人尊敬的研究员爱德华·罗斯诺夫提供证据表明,链球菌是引起脊髓灰质炎的履行科赫法则(142年- - - - - -144年),只有与脊髓灰质炎病毒的发现这个理论推翻了几十年后。缺乏特异性的证明了罗斯诺夫的因果关系错误归因链球菌的脊髓灰质炎只突出了许多可能的限制出现的科赫法则经过一个多世纪的反射(表2)。这些限制不严重破坏通常非常具体的科赫法则来确定真正的病原体的能力。如果病原体满足科赫法则,那么它很可能是疾病的原因,但这些结果需要可再生的和一致的。在的情况下加德纳菌属鞘突和BV的纯培养的能力g .鞘突生产BV 13 1接种对象的因果关系不是一个非常令人信服的论点没有更好的解释92%的失败率(见部分4)。按照逻辑极端,艾滋病在1 1000例的成功诱导接种支原体也不是“完成”科赫公司的第三个假设的作用支原体艾滋病在任何有意义的或严格的时尚。然而,实验使用纯文化生殖疾病的微生物是最强大的单一方法的建立微生物与疾病之间的因果关系。另一方面,未能满足科赫的第三个假设并不意味着微生物并不是一种疾病的原因。对因果关系科赫法则有良好的特异性,但可怜的敏感性。例如,许多微生物没有在实验室成功地在纯文化传播;这些微生物不能满足科赫法则为最初的定义。在思考因果关系的历史演进和科赫法则描述其他地方(1,2]。

12。一个分子版本的科赫法则

科赫法则的主要限制是失败的可能性占不文明的微生物在疾病中发挥作用。分子的方法来描述微生物多样性的使用在许多领域显示,栽培物种构成少数微生物在许多生态系统,包括在人体。许多潜在的病原体可以方便地检测到使用PCR等分子的方法。科赫法则可以直接翻译成分子版本,如下。(1)病原学的微生物或其核酸序列应该发现在任何情况下的疾病。这意味着微生物(或其产品)是疾病的一个敏感指标。(2)病原学的微生物或其核酸序列中不应主题没有疾病。这意味着疾病的微生物是一个具体指标。(3)感染实验操作通过抗菌药物等因素或诱导免疫反应应该证明变化水平的一个病因学的微生物与宿主疾病状态。

13。疾病的微生物群落

有一些疾病的症状,可能是由于微生物的联盟,而不是单一的病原体。综合症的例子,这些幼童腹壁薄弱是牙龈炎,牙周炎,BV。证明一个培养或不文明的微生物疾病的原因可能是一个挑战。证明微生物财团是导致疾病的原因是更加艰巨。

微生物可能存在于社区为了利用syntrophic关系中一个物种的代谢终产物是第二个物种的能量来源。如果失去了社区的关键成员,然后崩溃的代谢网络和社区的所有成员会受到影响。然而,微生物之间的功能冗余可能意味着细菌没有必要为社区卫生只要细菌B存在重叠的代谢能力。这是什么意思,如果A和B是细菌致病性的社区的一部分吗?这意味着无论是细菌将被视为必要的疾病,因为科目可能疾病缺乏细菌或B时,虽然科目不会有疾病如果缺乏细菌。A和B的细菌被认为是足够的,当大社区的一部分,但不是单独建立社区和生产所必需的条件。为了解决这个问题,我们需要评估不仅致病性微生物群落的物种组成,而且这些社区的代谢功能和相互依赖关系。人类微生物组的研究将在填补知识空白是至关重要的。

14。结论

在过去的二十年里,出现了戏剧性的增加我们的理解的各种生态环境中细菌生物利用cultivation-independent分子的方法。这些方法已经应用于人类阴道微生物生态系统,增加了大量的细菌多样性的数据在这个利基。受试者没有BV细菌生物不太复杂,是由乳酸菌物种。主题与BV的损失乳酸菌crispatus和收购更复杂的阴道细菌社区,包括许多heretofore-uncultivated物种。从分子的调查数据表明,它有可能开发出一个pcr进行BV诊断策略。BV的可能是一个例子条件致病微生物群落产生的,而不是一个单一的病原体,提出许多挑战对于理解这种综合症的病因和发病机理。分子的科赫法则提出了收集证据的因果关系等不文明的微生物与BV。有新的证据表明BV在一些女性可能是生物膜条件,这可能会导致糟糕的治疗反应和高复发率。理解人类阴道细菌生物优化生殖健康至关重要,虽然进步了许多,有很多是未知的细菌社区如何在人类阴道促进健康和促进疾病。

确认

作者感谢蒂娜菲德勒进行广泛PCR、克隆和测序实验数据提出了审查已组装。他们也感谢刘Congzhou进行荧光原位杂交实验。

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