应用顺序相依电泳指纹在探索人类肠道菌群的生物多样性和种群动态:能显示什么呢?

文摘

顺序相依电泳(SDE)指纹识别技术,如变性梯度凝胶电泳(DGGE)在分子微生物生态学领域已属司空见惯。SDE的成功的事实,它允许可视化技术将复杂的微生物生态系统的主要成员独立culturability和没有先验知识的复杂性和多样性的生态系统。主要利用原核16 s rRNA基因PCR扩增目标,SDE-based社区指纹变成一个领先的分子工具来解开人类肠道菌群的多样性和种群动态。本文的第一部分包括SDE指纹的方法论的概念和技术障碍分析肠道样本。随后,DGGE和相关的当前最先进的技术来分析人类肠道微生物群健康个体和肠道疾病患者调查。此外,SDE的适用性分析监测肠道人口变化对营养或治疗干预是批判性的评估。

1。介绍

哺乳动物肠道包括人口高度复杂的微生物达到10¹⁴大肠中的细菌(1]。开始作为一个无菌系统在出生时,微生物殖民的肠发展以连续的方式沿着较低数量的archae细菌占优势,酵母、丝状真菌、寄生虫和病毒(2,3]。最初的统治由兼性厌氧菌,肠道微生物群变得逐渐居住着专性厌氧菌在成年后仍将是其主要成分(4- - - - - -7]。引发的越来越多的16 s rRNA (rRNA)的方法,观察在进化成人肠道菌群的多样性在最近几年变化很大。基于描述16 s rRNA基因序列相似性水平的98%,目前的估计表明,人类胃肠道,拥有超过1000个细菌的系统发育类型,也称为phylotypes或“分子物种”8- - - - - -10]。这些库存分类研究表明,肠道微生物群的成年人在很大程度上是由成员只有两个细菌类群,即拟杆菌门和厚壁菌门,古生菌的一名成员,Methanobrevibacter smithii。通过复杂网络的共生互动,肠道微生物群有深远的影响对病原体的宿主的健康作为一个障碍,导致食物成分的降解,刺激宿主的免疫系统,并产生一系列基本的维生素,酶,和短链脂肪酸(11- - - - - -14]。

直到十年前,知识分类组成和代谢活动的肠道微生物群主要是基于文化相关的技术的使用。引发的越来越多的人意识到,只有一小部分的肠道微生物群可耕种的是在实验室条件下,各种文化无关方法一直在评估肠道微生物生态学(15- - - - - -19]。根据科学原理和技术的设计研究中,分子对肠道菌群的多样性和动态评估方法包括人口指纹(综述),克隆库(20.- - - - - -23],点状杂交[24,25),荧光原位杂交(FISH) (8,26- - - - - -29日),实时PCR (30.- - - - - -33),DNA微阵列(34- - - - - -36),和宏基因组9,37- - - - - -39]。

与上述的几个技术,专门针对一个或多个原地肠道的成员或需要大而复杂的数据集的分析,指纹是一个普遍的概念,它允许一个人口特征和监测肠道微生物群没有既存知识的结构或成分。最常用的指纹识别技术领域的肠道微生物学是基于顺序相依电泳(SDE)原则,包括变性梯度凝胶电泳(DGGE),温度梯度凝胶电泳(TGGE)和时间温度梯度凝胶电泳(TTGE)。相比传统的基于片段大小的凝胶电泳,SDE的原理依赖于顺序相依的电泳分离的混合物同样大小的PCR产品包含线性梯度聚丙烯酰胺凝胶的化学变性剂(DGGE)或一个线性温度梯度(TGGE和TTGE)。这种方式,分离是通过逐渐减少部分熔解的电泳淌度,双链扩增子的变性梯度。PCR片段长度相等但不同序列有不同的行为和融化将停止在不同的位置沿凝胶迁移,最终产生一个带型或指纹。一定程度上,也以单链构象多态性(SSCP) [40)和terminal-restriction片段长度多态性(T-RFLP) [41]分析已经应用于微生物群落分析。SDE同样方法,这两个方法依赖于特定的目标序列的PCR扩增电泳分离扩增子紧随其后。而这种分离是基于sequence-specific融化SDE扩增子的行为分析,分类解决SSCP和T-RFLP的二级结构是由ssDNA或核酸内切酶的分布限制站点,分别。SSCP分析的原理本质上是基于顺序相依微分分子内折叠的ssDNA改变分子的迁移速度(42]。ssDNA片段来自使用统一的PCR扩增子分离,低温,nondenaturing电泳保持单链的二级结构片段。T-RFLP分析,另一方面,基于尺度依赖的电泳分离消化荧光end-labeled PCR产品。在电泳凝胶使用,或者要系统,只有“终端”end-labeled限制片段检测。虽然不如DGGE和相关技术,常用的SSCP [43),尤其是T-RFLP [44- - - - - -48)已经应用于研究肠道菌群的多样性和动态。本文将特别关注使用钻技术,尤其是DGGE)领域的肠道微生物学。

因为他们介绍在微生物生态学在1990年代早期(49SDE),指纹识别技术已经用来分析在各种环境中微生物群落包括水生网站(50- - - - - -52)、土壤(53),发酵食品(54,55),和人类肠道(综述)。SDE-based指纹识别方法在肠道微生物的价值了,它们允许基于模式的可视化的主要细菌群体包括可耕种的不良,目前无教养的细菌被认为是代表50 - 90%的肠道微生物群。

本文将处理所有的不同方面SDE方法包括其可能性和局限性的再现性,敏感性,和数据分析。通过讨论的选择造成了该领域的研究,将概述SDE-based研究的方法来研究人类肠道生态系统与健康的微生物生态学和流感传染人群。综述的范围不包括空间数据应用处理人类上消化道或动物肠道生态系统。

2。方法

2.1。原则

钻技术的原理依赖于电泳分离的PCR扩增子与sequence-specific方式等长的聚丙烯酰胺矩阵包含一个定义变性梯度的尿素和甲酰胺(DGGE)或温度梯度(TGGE和TTGE)。在创建TGGE沿着温度梯度凝胶,而在TTGE时间温度梯度电泳运行期间逐渐形成。双链扩增子的电泳淌度越来越变性梯度凝胶矩阵是弱智在给定化学变性剂浓度或温度导致融化(部分)序列的熔化温度最低的地区()。的物理变性dsDNA片段因此很大程度上取决于其核苷酸序列和% G + C含量和收益在离散的部分片段或所谓的融化域。这些领域干扰DNA分子的螺旋结构,最终会停止进一步迁移。扩增子不同序列层面上可能会显示一个不同的融化行为和意志,因此,停止迁移在不同位置的线性梯度凝胶,在可视化将导致带概要文件代表扩增子的序列多样性混合物。

在实践中,SDE-based社区分析包括四个步骤:(i)提取的总DNA社区样本;(2)PCR-controlled放大使用特定寡核苷酸引物;(3)顺序相依电泳分离的扩增子使用DGGE TGGE或TTGE;和(iv)指纹处理和分析。

2.2。抽样和总DNA提取

2.2.1。样品采集和处理

内生微生物群沿着不同的肠道56]。除了纵向梯度,多样性也有代表性的微生物种群的分化已经观察到在腔,粘膜和上皮表面(56,57]。主要是由于取样困难,这些隐居的分类构成肠道的记录不良的。由于这种空间分布,获得微生物数据的子样品肠道通常不能借此推断全球整个肠道菌群组成。大多数时候,粪便样本用于研究肠道微生物群,因为它们是最容易收集的标本类型从这个环境。也在特定的临床情况下,腔的内窥镜检查样品,粘液,活检,气孔液体可以分析。

在大多数研究中,即时处理的样本不可行是因为需要运输和/或(长期)存储的标本。它已经表明,在室温下储存粪便样本,甚至在4^°C显示大量减少细菌多样性和细菌DNA的降解后8小时(58]。因此,它通常是建议结肠癌样本应立即(深)冻结在收集和储存在最大限度−20^°C和70−最好^°C,直到进一步的处理。然而,它应该记住反复冻融的样本可能导致负面影响细菌生存能力和恢复率(59- - - - - -61年]。虽然记录不良,后续样品操作影响DNA提取和由此产生的DNA的产量和品质可能是不那么引人注目的62年]。

2.2.2。提取DNA的社区

一个有效的、可再生的和高收益总DNA提取方法是必不可少的为了获得代表视图的实际肠道的微生物组成样本。任何DNA提取过程中最关键的一步是细胞溶菌作用。一系列的方法包括商业工具和自身的实验室协议描述和评价了总从肠道细菌DNA或RNA的提取样本利用化学、机械(如珠子),和/或酶裂解(63年- - - - - -67年]。因为不是肠道微生物群的所有成员显示相同的灵敏度的裂解条件给定的过程,它是极其困难的,如果不是不可能的话)提取所有组成物种的DNA相同的效率。此外,DNA隔离程序还应该能够消除潜在PCR抑制剂可能出现在粪便样本如酚类、胆盐,血红蛋白的降解产物,植物来源的复杂多糖。选择标准通常用于评估一个DNA提取方法的有效性包括DNA电泳验证完整性,测定DNA的产量和品质使用获得的光谱分析和质量控制端配置文件(64年- - - - - -66年]。此外,不同DNA提取协议的裂解效率可以比较基于复杂性和带钻强度社区指纹。DNA提取,解决方案通常存储在−20^°c .储存条件的影响和持续时间的存储的完整性和质量总DNA提取肠样品还没有详细研究。

根据(临床)应用程序的类型,高质量的社区获得的DNA可能需要从一系列不同的样本类型如digesta、粘膜和粪便样本。出于这个原因,DNA提取技术应该精心挑选并可能进一步评估或优化与特别注意标本的类型和数量66年]。在这方面,它可能不太适合使用商业DNA提取试剂盒给有限的可能性来优化程序,例如,通过改变浓度或提取试剂的成分。另一方面,商业工具可以大大减少对时间的手相比更复杂的自身的协议。在表1,技术细节的常用的总DNA提取程序,用于SDE-based剖析人类的肠道微生物群(6,21,24,32,33,43,63年- - - - - -66年,68年- - - - - -109年]。

2.3。社区聚合酶链反应

DNA提取和纯化后,使用不同分类覆盖多个底漆集可以申请社区PCR扩增。通用PCR引物的使用允许任何微生物群落进行分析,尽管在生态系统多样性高的像只肠道(前)主要成分在钻效果产生一个可见的乐队。为了专注于整个社区内一个特定族群,群特异性PCR引物可以使检测细菌类群在肠道更普遍。传统上,通用和特定的社区空间数据应用PCR引物设计使用16 s rRNA基因作为目标分子。这种偏好源于这一事实四核糖体rna基因镶嵌结构组成的不变,相对保守,高度可变区域(V)地区。SDE-based人口指纹识别,使用引物退火基因的保守序列部分以三个变异度高的地区之一。在表2,提出了选择的通用和特定的引物集用于SDE-based剖析人类的肠道微生物群(6,30.,64年,65年,69年,71年- - - - - -74年,76年,77年,79年- - - - - -82年,84年,85年,86年,88年,90年,91年,94年,95年,96年,98年,99年,101年,102年,105年- - - - - -130年]。以瘤胃为模式系统复杂的微生物群落,Yu和莫里森131年)系统相比,一组DGGE概要文件获得通用引物针对不同V地区。基于序列差异性和异质性最低的温度域的V区域和数量,分辨率,和相对强度产生的DGGE乐队的形象,V3地区最喜欢分析肠道微生物组。此外,作者推荐使用V3-V5或V6-V8地区如果再扩增子者优先。旁边四核糖体rna基因,还其rRNA同行可以coextracted和用作PCR模板在钻分析肠道生态系统之前逆转录(70年,71年,75年,93年,95年]。这样,SDE概要文件生成代表(前)占统治地位的新陈代谢活性细菌基于假设这些生物体的细胞通常具有更高的核糖体RNA含量和核糖体RNA / DNA比值相对于静息细胞。

额外40-nucleotide GC序列丰富,所谓GC-clamp,通常是连接到结束的一个或两个PCR引物,参与PCR反应。这种方式,年底GC-tail生成产品的扩增子将防止完全变性,需要获得一个稳定的融化行为片段在电泳(49,132年,133年]。GC-clamps可以在序列不同,长度和位置(One hundred.,134年- - - - - -136年),他们的设计需要根据目标序列和所使用的引物。突变分析数据表明,GC-clamps短片段的熔化性能最强的影响(< 300个基点),而且这一影响可能会大幅减少对大型碎片(> 400个基点)136年]。也已经证明GC-clamp长度60 bp可能有效检测的碎片价值近80^°C而碎片可能需要更长的GC-clamps结合天然高熔点(因此GC-rich)域136年]。

2.4。顺序相依电泳

2.4.1。电泳条件

从本质上讲,DGGE系统由一个缓冲罐操作严格控制加热温度和稳定的缓冲循环。多个系统目前可用,其中DCode (Bio-Rad实验室;http://www.bio-rad.com/),INGENYphorU (Ingeny;http://www.ingeny.com/)和DGGEK-1001/2001/2401/4001/4801 (CBS科学;http://www.cbsscientific.com/)似乎是最常用的。Bio-Rad提供的设备和Ingeny也可以申请TTGE分析而TGGE温度梯度块应该集成系统中。以防需要大量的样本进行分析,如在监测研究中,系统的样本容量是一个重要的标准。每个运行前面所提到的三种系统的最大容量变化从60岁(DCode), 96 (INGENYphorU)到128 (dggek - 4801)样品。

一般来说,DGGE利用平行凝胶电泳系统越来越垂直梯度的变性剂和电泳的方向平行。在许多研究中,最优变性梯度产生的最高决议首先取决于垂直梯度凝胶。为了这个目的,一个示例包含一个或多个片段PCR electrophoretically分离在变性梯度垂直于电场的方向导致sigmoid-shaped曲线。从这些凝胶,中间的变性剂浓度范围,在不同的电泳的机动性得到PCR产品之间,被认为是最优的变性剂梯度多车道DGGE并行分析。电泳可以确定的最优时间通过一个“时间旅行”的实验期间,PCR片段的混合物被加载到一个平行的凝胶在恒定的时间间隔。DGGE的最佳时间可以从运行所需的时间获得最大的扩增子的分离。

演员和运行的详细程序,DGGE凝胶已经被Muyzer et al。134年,137年]。本质上,所需的低和高变性浓度的解决方案是通过混合0(0%)和高浓度丙烯酰胺(80 - 100%)变性解在适当的比率。ammoniumpersulphate和tetramethylethylenediamine,两个垂直玻璃板之间的混合物倒为了产生一个线性变性梯度。丙烯酰胺的浓度通常范围从6 - 12%,取决于尺寸范围的片段分离。一般而言,高浓度变性解决方案包含7 - 8 M尿素和甲酰胺20 - 40%。电泳是在0.5×1×TAE-buffer固定电压50 V到250 V和55岁至65岁之间的一个恒定的温度^°c运行时一般从3 - 17小时,虽然更长的运行时间较低电压会产生更好的凝胶质量。

对于TGGE TTGE,线性增加的温度梯度电泳方向平行或形成电泳的长度,分别应用结合统一,high-denaturant聚丙烯酰胺凝胶分离PCR碎片。确定平行TGGE或TTGE分析的温度范围内,融化的DNA序列可以生成使用专门的软件(例如,波兰分析软件;http://www.biophys.uni-duesseldorf.de/local/POLAND/poland.html)。理论上最优温度梯度是划定的最低和最高在融化的概要文件获得的值。的理论值可以降低添加变性凝胶组件,例如,一个尿素摩尔将降低理论用2^°C (138年,139年]。一般来说,使用6 - 8 M尿素凝胶结合一个典型的温度范围在35和70之间^°C。

与许多其它指纹识别方法,利用商用规模标准,钻技术遭受缺乏共识关于规范化标准。因为变性梯度可以稍微不同凝胶,标准参考的扩增子从纯粹的文化组成的跨度最大范围的应用梯度应该经常包括在几个固定在每个凝胶内部职位允许数据规范化和gel-to-gel比较高度的信心。这本书,莫恩(140年]提出的方法促进和改进的归一化的样本来自多个凝胶包括标准在每一个车道,而不是使用interlane标准。这些intralane标准引物中含有荧光标记包含多姿多彩在另一个波长的荧光分子连接到未知的PCR产物。此外,fluorophore-labeled引物的应用不需要凝胶电泳后染色,这提高了人口的总体敏感性指纹识别过程,使额外的DGGE多功能性包括同步分析的DNA, RNA-derived混合物在同一车道上。

2.4.2。凝胶染色

在电泳,凝胶染色和数字捕获进行进一步分析。三种染色剂常用的可视化片段。最初,SDE凝胶与溴化乙锭染色(EtBr)由于其广泛使用作为一个插入荧光染料用于检测核酸。下一代的荧光核酸染料SYBR绿色和类似的污渍等提供了一个更加敏感而EtBr由于较低的整体背景信号允许检测DNA片段在低浓度(64年,134年,137年]。这些新染料的额外优势,他们通常被认为是更少的有毒或诱变可以兴奋比EtBr和波长400 nm使以上non-UV照明的使用。一个特定的成员SYBR绿色家庭,SYBR黄金,结合dsDNA和ssDNA。这个特定的特性可能会进一步提高检测灵敏度自DNA扩增子SDE的凝胶中部分单链。虽然不常应用、银染色通常被认为是最敏感的染色过程。DNA固定后用乙醇和酸(如硝酸)⁺在硝酸银离子选择性地降低甲醛在碱性条件下的金属银(Ag)可视化为黑色沉淀。这个过程的潜在缺陷包括银彩色凝胶的事实阻碍后续印迹实验或乐队序列分析和蛋白质的非特异性的检测如BSA和组件Taq聚合酶PCR中混合,可能会产生额外的背景信号(134年,137年]。

2.5。数据分析

规范化SDE指纹可以分析视觉和/或数字。目视判读时实现复杂性较低的只有数量有限的资料进行比较。然而,一旦条带模式变得更复杂如从肠道获得样品或概要文件的数量增加时(如在监测研究),分析空间数据指纹需要实现的数值方法141年]。为此,数字化SDE凝胶进一步加工使用专用的图像分析软件像GelCompar和BioNumerics(应用数学;http://www.applied-maths.com/),数量和分子分析(Bio-Rad实验室),GeneTools (Syngene;http://www.syngene.com/)和Photo-Capt (Vilber Lourmat;http://www.vilber.com/)。这些程序允许带模式的数值分析,通常还包括统计方法对数据的解释。程序已经使用专门为空间数据统计分析指纹数据包括R (http://www.r-project.org/)和DGGESTAT(荷兰生态研究所开发的NIOO-KNAW, Nieuwersluis,荷兰)。

2.5.1。多样性和相似性分析

大多数情况下,数值分析空间数据概要文件依赖于使用的多样性指数和/或聚类分析。指纹分析多样性措施如辛普森指数和Shannon-Wiener /韦弗指数表达生态系统多样性的程度作为乐队的函数复杂但无法表达基于带位置概要文件之间的相似度。分层的聚类算法,如未加权的pair-group使用算术平均法(UPGMA)产生一个可视化表示SDE概要文件之间的相似度表示为相似度指标,例如,使用曲线皮尔逊积差相关系数波段的骰子系数或索伦森的成对系数。其他作者使用多元分类方法,如非度量多维标度(142年,143年),主成分分析(109年,144年),对应分析(145年),典型变量分析(146年),和典范对应分析(147年]。这些方法用于复杂数据集的集成,如乐队在一个端模式到新的数学变量,可以投射到一些尺寸的角度或减少空间。更详细的描述这些统计过程据报道其他地方(148年]。Gafan et al。149年)评估使用逻辑回归统计分析复杂的DGGE概要文件。这种分析方法考虑了结果除了总体差异带概要文件的复杂性和个人带的位置。毋庸置疑,分析的数值方法和统计工具列表数据概要文件在未来几年将进一步扩大。虽然方法(s)的选择是根据研究的目的和对生态系统的复杂性,社区指纹通常包括更多的信息比通常显示当前可用的方法。出于这个原因,应该投入更多的努力开发新的和扩展SDE复杂数据的处理方法。

2.5.2。识别分析

旁边的第一个钻分析水平基于多样性和相似性系数的使用,一个二级可以定义,允许一个识别和监控特定的肠道生态系统的成员。从本质上讲,在SDE指纹识别个人的乐队的乐队可以获得位置分析(BPA)和/或通过乐队测序分析。从本质上讲,双酚a依赖迁移距离的比较乐队片段分类学的良好参考菌株与未知的乐队出现在示例配置文件。BPA可以由分析样品和参考菌株在相同的凝胶(即相邻车道。,comigration analysis) or by comparing unknown band positions with those of reference strains present in a user-generated SDE database. In intestinal ecosystems, BPA-based identification may not always yield a conclusive result given the possibility that a single band may consist of multiple amplicons from different species or that two or more (phylogenetically related) species are characterized by the same band position in the sample profile. Ideally, each band position in a sample profile should represent one species. In practice, however, the multioperon effect observed for some taxa when using 16S rRNA gene primers may lead to an overestimation of the number of predominant species in the sample (e.g., see Section4所示。2)。与SDE概要文件与通用引物,获得识别分组人口档案的乐队BPA可能更可行。应用程序数据使用属类属特异性的引物拟杆菌(81年,90年),双歧杆菌属(74年,90年,108年,117年)表明,物种的身份可以解决通过BPA。Temmerman et al。117年)描述了协议识别bifidobacterial社区基于nested-PCR-DGGE方法组成双歧杆菌属特殊PCR一步之后,第二个PCR一步V3和16 s rRNA V6-V8区域的基因被放大。混合的扩增子DGGE凝胶进行了分析,之后乐队头寸与参考株的用户数据库。

BPA可以或者应该识别结果验证了乐队测序,并可能有助于确定未知的系统发育关系。各种程序描述了特许权和恢复PCR碎片从聚丙烯酰胺凝胶矩阵从常规洗脱电泳缓冲到专门的协议使用扩散缓冲区和商业工具(74年]。关键的postextraction一步在这个过程涉及reamplification和后续钻切除片段的分析与原环境样品为了验证提取正确的乐队。经确认,恢复PCR直接测序片段没有额外的克隆。后续的识别获得的序列信息可以通过比较序列存储在公共数据库,例如,EMBL的(http://www.ebi.ac.uk/embl/)或基因库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)。

下面将进一步讨论,获得物种信息的意义依赖于片段的长度和它所代表的高变区在目标基因。这个序列信息也可以用来为应用程序开发探测器在鱼类和实时PCR化验检测和量化目标生物。测序分析,个人乐队的身份SDE概要文件也可以揭示了南方与分类探针杂交150年]。

3所示。人类肠道微生物群的分析

人类的肠道港口高度密集和复杂的微生物群落中起着举足轻重的作用在维持肠道的健康状况。尽管SDE-based方法只允许一个表面的微生物多样性和种群动态的观点被认为是主要的复杂的生态系统的一部分,其使用领域的肠道微生物呈指数增加在过去十年。以下部分旨在回顾SDE人口指纹识别的主要贡献我们当前的知识构成和人类肠道菌群的生态平衡与健康、疾病和饮食干预。

3.1。正常肠道菌群

一个相对少数的生物属于其他微生物领域,人类的肠道菌群主要由细菌。虽然微生物发酵的主要网站是大肠(结肠),细菌种群遇到在消化道的总长度。从上面的肠、细菌浓度逐渐增加到10¹¹-10年¹²在结肠/ g。平行于细菌密度的增加,细菌多样性从小肠结肠(扩展151年,152年]。从社会的角度来看,重要的是意识到肠道生态系统的发展从最初无菌系统先后成为殖民地的各种各样的微生物。

3.1.1。从新生儿到成人

几项研究已经使用SDE-based技术监测新生儿肠道微生物群的发展在人类6,96年,101年,102年,106年,107年]。出生时,最初的直觉就居住着各种各样的细菌类群。连续不断在断奶之前建立一个更复杂的和稳定的微生物群。两项研究由Favier et al。6,96年]表明,肠道细菌的新生儿是极其不稳定的社区就是明证,许多主流乐队DGGE的粪便样本健康足月婴儿减少强度,逐渐消失了几天后,被其他的乐队取代。在生命的头几个星期,DGGE概要文件获得与环球16 s rRNA V6-V8基因引物包括只有少数乐队,但随着时间的推移逐步增加复杂性。结合克隆库由16 s rRNA基因序列,鉴定细菌种类对应于特定的乐队在BPA DGGE概要文件是可能的。这种方法表明,大肠杆菌和梭状芽胞杆菌种虫害的主要群体在最初的殖民者,迅速,取而代之的是一个更复杂的微生物群组成的双歧杆菌、梭状芽孢杆菌、肠球菌瘤胃球菌属、肠杆菌属、链球菌属、拟杆菌属,放线菌。DGGE分析所暴露出的多样性与先前的见解是相当一致的婴儿继承模式基于传统文化研究(5,7]。此外,连续殖民的婴儿肠道双歧杆菌监测在第一次出生后5个月双歧杆菌属特殊引物(96年]。而一些研究对象显示非常稳定的DGGE图谱,揭示颞bifidobacterial人口的变化。在每个时间点,1到4双歧杆菌属有关的DGGE乐队观察它总是包括在内双歧杆菌属对象。在另一项研究中,动态发展中新生儿肠道的细菌社区9日本婴儿监控在生命的前两个月(102年]。虽然个别物种的发展是不同的主题中,DGGE概要文件的主要粪便微生物群一起16 s rRNA基因克隆库测序揭示全球逐步进化的有氧厌氧微生物生态系统。最初的有氧生物等假单胞菌立即取而代之的是兼性厌氧菌包括吗肠球菌,链球菌,肠杆菌科在第一个月。最后,严格厌氧双歧杆菌和梭状芽胞杆菌出现了。细菌社区的建立和连续住院早产儿往往遵循一个不同的模式相比,足月的婴儿(101年]。粪便样本来自29个早产儿住院新生儿重症监护室和15个足月的婴儿使用DGGE分析描述和比较细菌的占主导地位的大肠细菌物种。在生命的前4周,DGGE模式对所有早产儿随时间增加的复杂性。在这段观测时间内,个体内的乐队模式相似性表示随着时间的推移增加了增加索伦森的成对相似系数()从0到80%。此外,个别间值增加(18.1 - 57.4%)所有这些都表明收购一个高度相似的细菌社区在这些婴儿。相比之下,母乳喂养足月婴儿显示大幅降低个人间值(11.2%)。惊人的高相似性细菌社区从不同的早产儿被认为是与住院治疗,因为发现的主要细菌群体DGGE BPA属于类群,通常隔离在婴儿护理单元等大肠杆菌、肠球菌spp。,肺炎克雷伯菌。这一发现因此表明最初的殖民新生儿的肠道是高度依赖于个人的直接环境。在另一项研究评估全球早产儿的粪便微生物群的多样性(n= 16),一个非常low-species多样性和high-interindividual可变性报道(106年]。low-bacterial多样性被随机测序显示16 s rRNA基因的克隆和TTGE分析。这里的主要粪便团体遇到包含的成员肠杆菌科家庭的属肠球菌,链球菌,葡萄球菌。7个早产儿被厌氧菌殖民地,其中4名婴儿被港口双歧杆菌。

几项研究已经证明,母乳喂养的婴儿双歧杆菌粪便菌群为主,而在formulafed婴儿,其他细菌群体如大肠杆菌群,enterococci,拟杆菌代表的主要成分(7,153年]。相比之下,可能影响膳食补充剂的护理婴儿的肠道发育不太好理解。纵向研究,TTGE是用于监控的主要微生物群和bifidobacterial 11阿尔及利亚在母乳喂养婴儿,母乳喂养和人工补充牛奶(断奶)和人工牛奶独自(开启时间较短,也就是说。,停止母乳喂养)[107年]。TTGE概要,主要乐队是由随后的克隆和测序大肠杆菌、瘤胃球菌属spp和几个双歧杆菌属物种包括b . longum对象,b .谕令。对于细菌和bifidobacterial TTGE概要文件,距离分析显示预期的成熟粪便微生物群5至20周的年龄,但没有透露任何相关的膳食补充剂。尽管high-interindividual可变性,观察到粪便微生物群的构成更同质断奶后可能出现的相关建议停止母乳喂养。在另一项研究中,65年长达10个月的婴儿相比,随机膳食干预研究,包括牛奶(CM)的影响与婴儿配方奶粉(如果)有或没有鱼油(FO)补充粪便微生物群的多样性(80年]。基于聚类分析的V3和V6-V8-16S rDNA DGGE分析使用皮尔逊相关系数,据报道,补充厘米或者似乎会影响肠道菌群的组成而FO摄入CM组中只显示效果。作者推测这些差异可能是影响铁的摄入n3多不饱和脂肪酸,DGGE的分别,但进一步深入的分析资料结合其他分子工具需要证实这一假说。

除了环境和饮食因素的影响,还宿主基因型可能有重大影响肠道微生物群的物种组成。斯图尔特et al。84年)使用TTGE分析主要细菌生物调查的影响宿主基因型在粪便微生物群遗传相关和无关的孩子。在这个研究中,同卵双胞胎TTGE概要文件(n= 13),异卵双胞胎(n= 7),和不相关的控制对(n= 12)比较可视化和数值。虽然社区每个人的指纹都是独一无二的,水平的提高TTGE概要文件之间的相似性被发现基因相关个人,最高的相似度值获得基因同卵双胞胎(中位数的82%)显著不同异卵双胞胎(中位数的68%)和对照组(中位数无关的45%)。这TTGE研究的结果因此建议宿主基因可以影响主要粪便细菌的组成社区的儿童。同样,DGGE分析肠道菌群中占统治地位的成年人显示不同程度的遗传相似度表明,宿主基因型的物种组成有很大的影响肠道社区(122年]。

接班后,认为建立一个相对稳定的肠道社区成人肠似乎具体为每个单独的。Zoetendal et al。95年)是第一个报告的稳定性和独特性主要成人粪便微生物群,可以与SDE-based可视化方法。TGGE分析从两个健康人粪便样本显示稳定的概要文件在一段至少6个月,除了独特的对每个人来说。这些发现被合并在后面的研究(64年)的宿主特异性和时间稳定性DGGE模式被证明四个科目在16周内视觉检验和聚类分析。在后者中,还选择亚种群的时间稳定性监控使用类属特异性的引物。DGGE概要文件获得与引物设计的可视化Lactobacillus-Leuconostoc-Pediococcus-Weissella组织倾向于显示出强劲的时态变化。原地等团体拟杆菌fragilis子群,然而,DGGE分析使用类属特异性的引物没有揭示这种差异。重要的是,这些类属特异性的引物的特异性只是使用一组分类参考菌株进行验证。阐述了策略之后的验证的DNA, RNA-based DGGE协议专门设计的多样性和稳定性进行评估梭状芽胞杆菌coccoides-Eubacterium rectale(梭菌属的系统发育集群XIVa)组在粪便样本70年]。在这研究中,Ccoc-f和Ccoc-r引物的特异性是评估通过构造一个克隆库中所有205 DGGE碎片属于梭状芽胞杆菌集群XIVa。作者得出结论,这个集群的成员,代表一个最主要的细菌组在正常肠道微生物群,都遵循同样的模式相对稳定的主要人口在12个芬兰健康成年人在六个月到两年。虽然在样本使用不同协议类型,SDE法和底漆目标,当前视图的唯一性和时间稳定性主要肠道菌群在成年个体也被证实在其他人类志愿者研究使用SDE-based粪便样本的分析(77年,81年,83年,98年,99年,118年,154年)和粘膜样本来自不同地区的大肠79年,98年,123年]。

虽然绝大多数SDE-based研究肠道微生物依靠直接从人类中提取DNA样本为了获得微生物多样性的文化无关的库存,也有兴趣使用专门探索DGGE和相关指纹识别技术的构成可耕种的肠道的亚种。例如,DGGE分析resuspended细菌生物量从琼脂板不同媒体的选择性和非选择性乳酸菌(实验室)已经被用来评估媒介的选择和孵化条件在实验室复苏和了解的多样性可耕种的粪便实验室在健康成人(129年]。

3.1.2。空间分布

pH值等不同的物理化学条件和发酵产品的浓度普遍提升,横向和结肠的下降部分155年)也表明细菌构成这三个隔间是独一无二的。然而,这种假设不证实SDE-based研究[30.,79年,91年,115年,123年]。在这些研究中,DGGE和TTGE指纹档案反映的主要细菌社区结肠活检样本中不同站点的主机具体但高度相似的网站。这些发现可能表明,至少主要mucosa-associated细菌群落的空间分布相对均匀沿着结肠及其物理化学梯度。尼尔森et al。79年)报道,DGGE bifidobacterial社区的资料相对简单,由一个或两个乐队的网站采样以及结肠的长度。然而,mucosa-associated subcommunity包括属乳酸菌、明串珠菌属、Weissella、片球菌属,气球菌属产生相对复杂的DGGE概要文件之间的不同主机之间和采样站点在结肠。相比之下,Zoetendal et al。123年)DGGE概要文件获得较低的多样性和很少或没有变化沿结肠当使用同一组群特异性PCR引物。据推测,上述两项研究的矛盾的结果是由于抽样程序的差异,DNA提取方法,和/或主题组织的成分。

考虑到每一个显示一个独特的粪便SDE指纹(64年,95年),空间分布最好应该调查分析的基础上的一系列特定站点活检样本来自同一个人。在某种程度上,这可以解释为什么个人间的比较DGGE的单一活检样本不同站点没有提供任何证据存在的特定站点殖民模式在人类结肠(30.]。

大量的研究也调查了粪便微生物群的构成在多大程度上反映了mucosa-associated结肠微生物群的组成(91年,123年]。在这些研究中,DGGE / TTGE概要的扩增子变量V6-V8 16 s rRNA基因区域反映的主要细菌社区活检样本显著不同的粪便样本在同一个体,表明不同的细菌种类支配人类的粘膜和粪便。SDE-based社区的人口多样性显示指纹的粪便样本可能不一定反映生态系统成分在肠道的其他部分包括结肠粘膜。这导致的结论是,最准确的信息的多样性和稳定当地肠道社区因此只能获得通过样本期间通过内镜或结肠手术。

3.2。肠道疾病

许多慢性肠道疾病的发病机制,甚至许多nonintestinal疾病被认为是直接或间接地与土著微生物群的一些成员。几项研究已经实施了一个SDE-based方法分析和监控的肠道菌群的组成和时间稳定性患有肠道疾病。最初的方法一样,钻技术允许快速和全球评估而没有以前知识的成分和微生物多样性是适合分析肠道菌群在不同的实验条件和参数如健康和疾病状态,积极与疾病静止阶段,肠道和响应的不同部分营养或治疗干预措施。此外,结合使用数据技术和定量分析实时PCR和鱼等,使确定具体指标的相对浓度生物在这种类型的研究提供了巨大的潜力。以下部分的评估是基于选定的研究实现SDE-based方法评估的肠道微生物群的潜在作用(etio)慢性肠道疾病的发病机理。

3.2.1之上。炎症性肠病

虽然炎症性肠病(IBD)的确切病因尚不清楚,一般认为由于不适当反应的粘膜免疫系统正常的肠道微生物群在遗传易感个体(156年]。被假定特定的遗传多态性,比如那些在胞内NOD2传感器功能异常,导致未能有效调节表达Paneth细胞来源抗菌肽(157年,158年]。这种保护作用的部分损失可能允许共生体破坏上皮细胞在此诱导炎症反应。克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)是两个主要的IBD表型和特点是肠道粘膜的慢性炎症导致严重的水和出血性腹泻和腹痛156年]。而CD几乎可以影响肠道的任何部分,加州大学通常局限于结肠和直肠。

大多数SDE-based IBD研究主要是试图找到CD /加州大学之间的差异和健康的粪便或粘膜的人口。因此,V3-V5-16S rDNA DGGE分析和后续带新鲜的粘膜活检样本的测序分析显示显著的患病率更高梭状芽胞杆菌spp。瘤胃球菌属扭矩,大肠杆菌在CD患者样本(n= 19)相比,健康的标本(n= 15)[159年]。反过来,butyrate-producingFaecalibacterium prausnitzii在后者更常见。总体而言,DGGE指纹的粘膜CD数量显示病人可变性与健康受试者相比更高。作者推测,这种差异可能反映了病人的困难CD基因倾向于维护和调节肠道菌群的稳定。•等的研究。160年]表明biopsy-associated细菌的系统发育构成新诊断治疗CD之间的不同(n= 20)和UC患者(n= 15)和健康受试者(n= 14)。活检的发炎和noninflamed网站收集的回肠末端和各种结肠地区被DGGE分析,16 s rRNA基因克隆库和定性和定量PCR检测选择细菌组。DGGE的普遍V3-16S rRNA基因扩增子在每个主题(平均非常相似%),无论地区肠道。然而,枚举定量PCR显示大约两倍biopsy-associated细菌数量比CD患者和健康者为UC患者。此外,克隆库组成表明,活检人口的构成在加州大学和CD患者(P< . 05),与健康受试者(P= . 05)在统计学上不同。这种比较突出的患病率显著高于非保密门拟杆菌门的成员在CD患者中,这可能表明加州大学和CD是细菌不同的疾病。

根据个人有效性,IBD患者免疫调节治疗活动性疾病和缓解状态之间不断平衡。然而,目前还不清楚如果和以何种方式这些患者的肠道微生物群进行成分变化在这些后续转换。在这种背景下,Seksik et al。24)监测患者的粪便微生物群活跃的结肠CD (n= 8),患者在缓解期(n= 9)和健康志愿者(n= 16)。TTGE概要文件的通用16 s rRNA V6-V8基因扩增子在健康对照组,但非常稳定,随着时间的变化明显的患者(n= 4)监测活动和静止阶段的CD。这四个病人粪便TTGE资料透露只有轻微下降,乐队在活跃阶段的数量(意味着损失乐队),这表明,主要的粪便微生物群保持高度的多样性在这两个阶段。基于TTGE带剖面组成,没有特定的细菌组可以分配给活动或静止的CD。相比之下,定量点污点杂交的粪便样本显示,患者的粪便微生物群CD(活跃的和不活跃的)明显不同于健康的人。这两个拟杆菌集团(包括属拟杆菌,普氏菌,Porphyromonas)和双歧杆菌往往不代表在CD患者而更肠道菌可被检测到。此外,大约30%的内生微生物群的CD患者不属于主流系统组通常存在于健康对照组。

尽管目前可用的数据从数据分析和其他分子工具影响肠道细菌在CD发病机理中的作用,局部定性失调的不利影响CD-associated溃疡迄今为止不证明了社区指纹。TTGE活检样本分析和相邻nonulcerated粘膜溃烂患者15活跃的CD没有透露定性差异占主导地位的细菌人口状况(V6-V8地区16 s rRNA基因)在一个给定的病人虽然高生物多样性是保留在这两种情况下(92年]。意味着TTGE概要文件之间的相似度值和nonulcerated粘膜溃烂表达的皮尔森相关系数没有显著差异在不同肠段(回肠、结肠,左结肠和直肠)分析和不等%,%。仅仅基于TTGE分析使用通用引物,看来当地溃疡与明显没有联系当地的细菌多样性的变化。这一结论进一步证实在后面研究同一组的基础上V3-V4-16S rDNA TTGE剖析和鱼分析(94年]。也在其他的研究中应用SDE-based人口指纹,没有特别mucosa-associated微生物模式可以与(etio)炎症性肠病的发病机制91年,123年]。可能,当地少之间的失调主要物种可能在溃疡的发病机制中发挥作用。因为这些细微的差别在多样性将在很大程度上仍未被发现在SDE指纹使用通用PCR引物或难以用常规方法揭示乐队模式分析,未来的研究应采用类属特异性的引物专注于特定人群的构成和/或应该使用微分概要分析更深入的数学方法。

而大多数研究集中在inventorization和监测细菌群体的潜在与CD,很少研究旨在解决同样的问题在肠道微生物群的新陈代谢活跃的隔间。索科尔et al。93年]分析了活性细菌的生物多样性在粪便微生物群的UC患者(占主导地位n= 9)与健康受试者(相比n= 9)通过应用DNA, RNA-based TTGE V6-V8核糖体扩增子的分析。乐队的数量DNA-derived TGGE概要文件明显高于RNA-derived概要文件为UC患者(和乐队,职责。)但不是控制(和乐队,职责。),表明生物多样性减少的活跃部分粪便微生物群在UC患者相对于健康对照组。无论初始模板(RNA或DNA), Pearson-UPGMA TGGE资料往往组织样本的聚类分析的基础上,临床联系(UC与控制)表明每个组织都有其特定的细菌签名。个人间的比较“活跃”的微生物群(RNA-derived概要文件)显示一个乐队,UC患者显著相关控制(89%比22%)。序列分析认为这个乐队大肠杆菌或相关的肠道菌。显然,这个群体的可能的病理生理作用的活性微生物群UC患者应该进一步评估在缓解和mucosa-associated内微生物群。

3.2.2。其他肠道疾病

肠易激综合征(IBS)是一种肠道疾病,特点是肠功能障碍和疼痛161年,162年]。肠易激综合症是一种非常异构条件和症状包括三个类别:diarrhoea-dominant(我),(2)constipation-dominant, (iii)交替类型(163年,164年]。虽然肠易激综合症的病理生理学不是完全理解,极有可能改变肠道菌群的多样性和稳定性中发挥作用的开发和/或维护这种疾病(165年]。在芬兰的一项研究[121年),培养技术和DGGE分析被用来比较的粪便微生物群的组成和时间稳定性21 IBS患者和17名健康对照组。培养了略高于大肠杆菌数量以及需氧菌和厌氧菌增加比率IBS组。DGGE分析16 s rRNA V6-V8基因扩增子显示相当大的生物多样性和主题的特异性主要微生物群在这两个学习小组,但没有确定IBS-specific细菌组。视觉比较DGGE指纹显示更高频率的时间的不稳定主要细菌IBS受试者(43%)相比,控制人口(29%)。然而,剖面相似性分析使用皮尔逊相关系数显示类似个人间相似性百分比两组的意思是相似的IBS组和%%为对照组。不过,肠易激综合症的不稳定性在某些科目部分可以解释为扰动的肠道微生物群,由于抗生素疗法在研究过程中。此外,作者认为,这些发现可能与肠易激综合症的一个子集主题分享特定的症状,因此不一定反映所有IBS患者的一般微生物状态。在这方面,未来的研究应该包括主题组与症状IBS参数评估协会定义良好的肠道不稳定与特定的IBS症状或与特定的细菌群体和物种。在随后的研究同一组(71年),主要和梭菌的粪便微生物群的IBS患者和健康对照组比较,揭示可能的差异组成、丰度、稳定选择团体通过应用DNA, RNA-based DGGE分析和文本分析的帮助下亲和捕获、多路复用和定量hybridization-based技术。梭状芽胞杆菌,c . histolyticum c coccoides-Eubacterium rectale, c . lituseburense,c . leptum占主导地位,被证明代表粪便微生物群在26日32名受试者在研究中,贡献共29 - 87%。的比例c . coccoides-E。rectale组被发现显著降低constipation-type IBS科目比控制。虽然DNA, RNA-derived主导社区的档案显示相当大的生物多样性和subject-specificity, RNA-based DGGE概要文件包含扩增子明显减少(相比扩增子)。此外,只有RNA-based DGGE概要IBS受试者表示更高的不稳定的细菌数量与对照组相比。虽然个体内的时间不稳定的主要微生物群观察IBS和对照组(DNA——和RNA-based DGGE),只有RNA-derived DGGE IBS主题的概要文件显示更广泛的相似值(39 - 95%)与对照组相比(68 - 94%)。当考虑IBS症状子组,观察DGGE相似度值最大的个体内的可变性diarrhoea-type子群。这些观察表明,梭菌属的微生物群,除了积极的不稳定主要粪便细菌种群(RNA-derived概要文件),可能参与IBS。为未来的研究,使用类属特异性的引物在钻分析关注显然影响团体(例如,大肠菌和梭状芽胞杆菌)可能是一个有价值的和有效的方法来识别潜在的IBS的生物指标。

SDE-based的使用方法来确定微生物群的多样性和稳定性的炎性疾病同时扩大炎症性肠病和肠易激综合症和其他肠道疾病在人类肠道菌群的失调被认为扮演一个角色,如新生儿坏死性小肠结肠炎(116年和腹腔疾病130年)或超出了肠道系统疾病如(过敏性)过敏82年,85年,166年和强直性脊柱炎113年]。

3.3。干预研究

除了组件自然发生在正常饮食,也功能食品(包括预处理和益生菌)和抗菌药物能产生有益或有害的肠道生态系统的变化。从出生后第一周开始,人类饮食能够调节肠道菌群的组成和平衡(7,153年]。SDE的方法是经常应用于政府监控对肠道菌群的影响研究在各种活性成分的消耗。

3.3.1。功能食品

饮食是一个主要因素控制人类肠道平衡,引发了新一代的食物特别设计的发展加强肠道微生物群通过调制。功能食品包括食品和食品有一个明确的健康益处除了基本的营养价值(167年]。在功能食品、添加或将支持和/或生命起源以前的组件作为活性成分中扮演着重要角色在功能应用程序针对调制的肠道微生物群。根据粮农组织/世卫组织定义(168年],益生菌是活的微生物,在足够管理时,赋予宿主的健康益处。这个定义的扩展版本仍在辩论,包括质疑益生菌所需的生活状态是真正行动169年,170年]。有利影响益生菌引起的活动是介导通过调制的土著微生物群或潜在的益生菌菌株免疫调节。细菌培养纳入"益生菌"产品供人类食用commonly-but不是exclusively-originate从肠道系统的健康(人类)主题和最常属于双歧杆菌和实验室等乳酸菌spp。生命起源以前的,另一方面,是一个nondigestible选择性发酵化合物诱发特定变化的成分和/或胃肠道微生物群的活动从而赋予利益在主机幸福和健康171年]。从本质上讲,生命起源以前的化合物的功能是由其潜在刺激有益的细菌土著肠道生态系统。复杂的低聚糖通常用作益生元包括乳果糖、galactooligosaccharides (GOS)和fructooligosaccharides(安全系数;例如,oligofructose和菊粉)。广泛的有利影响已归因于益生菌,益生元,或者一个组合(即。,synbiotics), including modulation of the gut immune system, resistance to microbial infections, antimutagenic/anticarcinogenic effects, reduction of blood ammonia and cholesterol levels, prevention and/or alleviation of diarrhoea and constipation, prevention and reducing symptoms of intestinal chronic disorders, relief of lactose intolerance and increased mineral absorption as reviewed in [172年- - - - - -178年]。

SDE-based方法发挥了关键作用在人类膳食干预研究旨在展示功能食品成分的功效,并证实潜在的健康声明。选择相关的研究导致了这个字段是列在表中3(68年,69年,72年,73年,75年,76年,88年,90年,98年,One hundred.,105年,110年,111年,120年,127年,179年,180年]。完全基于空间数据分析结果,似乎生命起源以前的政府可能会影响的主要细菌人口健康的人体,而大多数益生菌干预似乎只有诱导显著影响患者组。这可能表明,一些益生菌组件可能有更多的治疗效果在对象扰动和一般健康促进肠道平衡但不有效代理。另一方面,它应该记住SDE-based方法关注主要的肠道菌群的多样性和多变性,并因此不适合监控益生菌干预是基于管理机体的免疫调节潜力(年代)。•et al。110年DGGE)用来评估混合益生菌制剂的安全性和有效性:# 3^®(http://www.vsl3.com/)组成的三个双歧杆菌属菌株和5个实验室菌株(即。,四个乳酸菌压力和一个乳酸链球菌应变)轻度至中度UC患者的活跃。DGGE分析V3-16S核糖体rna基因扩增子来自七个病人收集的活检之前和之后六周:# 3政府显示相当大的变化的主要微生物群在4 5名患者在缓解期(平均骰子相似系数()%)。相比之下,DGGE概要文件的两个继续活动性疾病患者:# 3后保持相对稳定的消费(平均的%)。重要的是,需要注意的是,这项研究并没有报告的时间稳定性活检资料没有益生菌的治疗。在另一项研究中,四周的影响政府的候选人生命起源以前的di-D-fructofuranose-1,:2,二酐(DFA III)对人类粪便微生物群研究了使用通用V3-16S rRNA引物和DGGE分析脆弱拟杆菌subgroup-specific引物(73年]。视觉和数值分析的DGGE概要文件生成与引物组并没有发现明显的变化与DFA三世政府在健康受试者。在长期跟踪人类喂养试验和DFA III(2至12个月),然而,DGGE概要文件的主要细菌种群显示显著增加乐队相关的强度拟杆菌spp。72年]。在你消费的影响研究GOS-containing益生菌酸奶的粪便微生物群的多样性和时间稳定性在老年69年],DGGE透露,主要的细菌数量和梭状芽胞杆菌coccoides-Eubacterium rectale组在研究期间保持相对稳定。相比之下,乳酸菌显示时间变化,证实了此前的观测组织基底条件下(64年]。

在益生菌干预研究,DGGE和相关指纹识别技术已经用于验证如果管理应变(s)(是)在肠样品中检测76年,88年,98年,One hundred.,105年,110年,125年,179年]。基于文化的组合方法和16 s rDNA DGGE、墙等。86年]甚至报道益生菌菌株的复苏乳酸菌paracaseiNFBC 338和b . animalis无性系种群。lactis在回肠造口术Bb12废水的两个婴儿没有摄入益生菌的历史。在这种情况下,应该注意的是,SDE指纹并不是最优的工具检测菌株接种,因为相对贫穷的检出限(尤其是当使用通用引物)和缺乏解决歧视引入应变(s)与其他菌株相同或高度相关的原地物种成员的肠道微生物群。更合适的方法是应用毒株特异性引物(例如,传统或实时PCR)或探测器(如荧光鱼探针)不仅会提供更高的灵敏度,但可能也会允许相对量化的目标(益生菌181年- - - - - -184年]。另一方面,应该牢记的是,所有提到的基于dna的方法不允许区分生活和死细胞,因此不能提供的信息在整个胃肠道益生菌生存。

近年来,SDE-based社区指纹已经集成在较大的多相研究结合传统的培养方法和/或与其他分子文化无关的方法来检测和监测的变化人类肠道益生菌的生态系统管理,生命起源以前的或其他有机化合物与声称的功能。因此,DGGE和鱼方法结合选择性文化方法评估三星期的饮食补充剂的影响与生命起源以前的神仙或安全系数的粪便微生物群的组成和活动15名健康志愿者(75年]。V3-16S核糖体rna基因DGGE谱仍相对稳定在研究过程中,而明显改变针对膳食补充剂被观察到在rRNA-DGGE概要文件可以在检测其他碎片或增加乐队片段归因于的染色强度双歧杆菌adolescentis和/或Collinsella aerofaciens。相比之下,使用genus-specific DGGE分析引物来源于transaldolase粪便双歧杆菌的基因产生相对稳定的配置。尽管bifidobacterial分类组成的人口没有明显不同,表明DGGE和鱼双歧杆菌属和Collinsella数量保持相对不变,rRNA-DGGE提供的证据增加代谢活动,以应对生命起源以前的消费。DGGE和鱼也被用于调查的影响红茶饮酒对健康志愿者的粪便微生物群与hypercholesterolemy [120年]。DGGE V6-V8 16 s rRNA基因的扩增子显示每个主题怀有一个特定的人口占主导地位的细菌,展品随时间变化不大,没有明显改变了喝红茶。虽然红茶并不影响分析的特定细菌组鱼(即,双歧杆菌、拟杆菌和普氏菌、梭状芽孢杆菌系统发育clustersIV XIVa,Atopobium组,Faecalibacterium例如物种和大肠杆菌),并减少细菌普遍检测到的细菌总量调查。在一项研究中,结合TGGE和鱼的使用分析,这是证明补充异黄酮和不赞成或益生元诱导显著的动态变化的主要肠道菌群的组成39绝经后妇女(105年]。鱼的结果分析表明,几个主要的粪便组刺激仅靠异黄酮,而TGGE剖析V6-V8 16 s rRNA基因的扩增子显示主要的肠道菌群的变化。皮尔逊TGGE指纹的个体内的比较显示平均相似度值为73%补充异黄酮的之前和之后的一个月。结合职业或生命起源以前的化合物,异黄酮引发类似的人口变化就是明证意味着指纹的相似性值71±18%和68±16%获得了益生菌(双歧杆菌animalisdn - 173 010)和生命起源以前的(FOS)提交测试组,分别。此外,鱼结果显示bifidobacterial增加生命起源以前的补充后,通常被称为bifidogenic效果。在别人(76年,125年,180年),上述研究表明使用SDE的潜在指纹和鱼在互补分析方法描述基本的肠道菌群之间的相互作用和功能食品化合物和量化亚种群应对引入组件(s)。

鱼,旁边还实时PCR与DGGE结合使用来验证和证实的半定量的方式的变化。后者两种方法被用于一个集成的方法来监测和量化明显改变粪便微生物群的健康受试者在长期管理生命起源以前的(乳果糖),益生菌(酿酒boulardii),他们的synbiotic组合(90年]。虽然DGGE概要文件获得的普遍V3-16S rRNA基因引物以及使用类属特异性的引物生成目标脆弱拟杆菌子群,属双歧杆菌属和lituseburense梭状芽胞杆菌和梭状芽胞杆菌coccoides-Eubacterium rectale组仍相当稳定,一个明显的变化是观察乳果糖摄入后的通用指纹档案。DGGE乐队出现或加剧27 30受试者可以分配双歧杆菌adolescentis通过带位置分析和排序。在随后的实时PCR分析,这一发现是相关的显著刺激双歧杆菌和b . adolescentis。相比之下,益生菌酵母美国boulardii没有显示任何检测通用DGGE概要文件的变化也影响bifidobacterial水平。在一个双盲交叉研究的定性和定量影响新鲜和热处理酸奶在健康受试者的细菌性肠道菌群68年],DGGE分析显示整体稳定性的主要细菌人口和人口实验室基线,后热处理后新鲜酸奶摄入和酸奶摄入。然而,实时与类属特异性的引物PCR表明显著更高密度的实验室perfringens梭状芽胞杆菌的密度明显降低拟杆菌消费后的两种类型的酸奶。

3.3.2。抗菌药物

除了他们一般证据确凿的治疗效果在网站上的感染,抗生素也可以产生不利影响肠道微生物平衡的生态系统。到目前为止,研究分析抗生素疗法的效果之间的选择和抗生素耐药性的传播病原体和共生体在人类肠道菌群主要依靠文化相关的方法(185年- - - - - -187年)高度受限的媒体的选择性使用。在这方面,SDE-based技术提供一个更合适的方法来监测抗菌药物对整个社区的影响肠道菌群的结构。

在一些人类研究大多关注婴儿的数量,DGGE分析揭示了土著细菌多样性之间的激烈的改变在治疗各种抗菌素(77年,96年,101年,102年]。Antimicrobial-induced中断的指纹档案通常是伴随着减少带数字显示整体的肠道生态系统多样性的减少。Favier et al。96年)监测细菌的肠道在生命的头四个月的五个孩子,其中一个婴儿接受连续抗生素疗法组成的安灭菌(克拉维酸和阿莫西林)13天后跟Bactrimel(甲氧苄氨嘧啶的混合物和sulfamethoxazol)对抗尿回流。在出生后第一个月,通用16 s rRNA基因V6-V8 DGGE概要antibiotic-treated婴儿是高度不稳定的。被确定为主要细菌组大肠杆菌和肠球菌spp,尽管服用抗生素将抑制肠道细菌。一个月以后,DGGE模式表示的一个简单但非常稳定社会,直到研究结束。最重要的区别的资料antibiotic-treated婴儿和其他四个健康的宝宝的缺失有关双歧杆菌属尽管乐队部分母乳的饮食。同样,一项研究,九个日本婴儿在出生后的头两个月监测表明,抗生素治疗一开始生活的展览一个强大的影响建立正常肠道微生物生态系统(102年]。两个婴儿收到Cefalex(头孢菌素抗生素)疗法在生命的头四天显示显著偏离发展模式趋势观察到的其他参与主体。DGGE分析V3-16S核糖体rna基因扩增子生成的配置文件与一个总体低复杂性缺乏双歧杆菌和其他乐队相应严格的厌氧菌。事实上,乐队16 s rRNA基因的序列分析和随机测序表明克隆库肠杆菌科是最主要的组在整个研究期间。在上述两项研究的结果相比,SDE的指纹数据报道Schwiertz et al。101年)表示,婴儿的细菌成分不一定受抗生素治疗的影响。在后者中,新生儿的建立和继承微生物群在生活的第一个月29日早产婴儿住院的监控,包括七antibiotic-treated婴儿接受头孢噻肟和哌嗪在前三天之后,万古霉素和阿米卡星治疗直到炎症是减少到21天不等。总的来说,DGGE分析通用V6-V8-16S rDNA引物显示相对稳定的概要文件在抗生素治疗后,虽然带型的复杂性通常参与婴儿相比似乎较低。

不令人惊奇的是,它已经表明,肠道菌群在不同程度上影响成人在抗菌治疗取决于治疗的类型和/或活动谱组件(77年]。在后者中,DGGE分析粪便样本从一个病人进行12个月期间不同抗菌剂管理。视觉和数值分析的V3-16S rRNA基因指纹代表主要的微生物群保持稳定超过八个月没有抗菌素(88 - 91%),只有一个星期后摄入的影响最小的环丙沙星(的73%)。相比之下,克林霉素显著降低了微生物复杂性(11 - 18%)。然而,一旦克林霉素治疗停止,恢复一些肠道组织很明显在几天内增加相似性指数表示的模式相比,抗生素治疗前(36 - 44%)。在其他三个病人,头孢唑啉(即。,一个cephalosporin with relatively low activity against intestinal anaerobes) caused only minimal alteration of V3-16S rRNA gene patterns (81 - 83%),而阿莫西林/ clavulanate触发标志形象的变化成分(19 - 42%)。总体而言,相对的改变程度普遍DGGE模式倾向于对应的相对活性谱抗菌素对肠道厌氧菌。

为了减少可能的副作用的抗生素治疗,益生菌通常管理结合抗菌素期间和之后的摄入量(188年]。在这种组合方法,缺乏管理的潜在转移抗生素抗性基因的菌株被公认的一个主要安全critera人类益生菌(189年]。在这种背景下,益生菌菌株的生存和稳定在抗菌治疗尤其相关,但没有大的详细研究。在强力霉素(四环素)和益生菌疗法相结合,Saarela et al。190年)发现的复杂性V6-V8-16S rDNA DGGE的粪便微生物群较低(意味着许多乐队,14-25)相比(控制)组只服用益生菌(意味着许多乐队,25-42)。益生菌菌株嗜酸乳杆菌LaCH-5和双歧杆菌animalis无性系种群。lactisBb-12从管理商业制备特列维从粪便样本中恢复过来,表型和遗传型的特点是耐四环素(Tc)。Tc-susceptible应变LaCH-5仍在治疗,而恢复Tc-resistant应变Bb-12包含的隔离春节(W)耐药基因没有发现获得额外的Tc抗性基因。虽然这些观测证据益生菌菌株的稳定,然而,作者并没有引入的可能影响进行调查春节强力霉素治疗期间(W)携带病毒的传播这个基因在整个肠道微生物群。

4所示。限制和潜在的缺陷

尽管其在分子微生物生态学领域的使用增多,很明显,SDE-based社区分析存在许多局限性,不允许深入分析人类肠道微生物群一样复杂。其中的一些局限性,如检测水平和分类解析,可以被视为潜在的缺陷,应该仔细考虑在协议开发和数据分析。事实上,许多这些关键因素的阶段实际钻前一步如抽样和样本处理、核酸提取和社区PCR,当故障排除,剖析问题值得特别关注。

4.1。PCR的偏见

正如上面所讨论的,一个有效的选择和可再生的核酸提取方法确保最佳的细胞裂解和最大去除各种PCR抑制剂存在于肠道样品是非常重要的。同样,可能期间推出的偏差的微分或优先扩增PCR扩增靶基因从复杂的社区可能偏见的分析191年]。因此,SDE指纹档案可能不能完全反映实际的示例中的主要微生物群组成由于(部分)缺乏放大某些DNA / RNA模板。非比例放大可以归因于几个因素(192年),包括模板和目标序列属性(例如,GC-content,二级结构和模板浓度)(191年,193年),引物结合的效率影响底漆偏好,退火温度和底漆不匹配,和PCR的循环次数(104年,194年]。此外,它也被报道,在放大过程中形成嵌合和heteroduplex分子(99年)可能会产生一种扭曲的观点实际的微生物多样性(137年]。在这种背景下,彼得森和Dahllof195年)描述了一种新的协议,利用内部标准在DNA提取和PCR-SDE为了弥补实验的变化。这个修改允许分析个别物种的相对多度回到原来的样本,从而促进相对复杂的微生物群落的多样性进行比较分析。其他作者提出了将一个内部标准在PCR比较片段之间的染色强度资料,允许片段强度的定量测量75年]。

4.2。分类解决16 s rRNA基因

虽然理论上可以使用每一个功能基因,SDE目标基因指纹最好(我)应该出现在细菌基因组中一个副本;(2)包含成员的人口守恒的地区,允许合理的引物设计;和(3)构成区域有足够的序列变异在成员的人口生产指纹露出极大的多样性。尽管16 s rRNA基因原型目标端应用程序基于上述标准,应该牢记的是,可能发生的种内multicopy操纵子的异质性(196年)和缺乏足够数量的多态区域密切相关的分类单元之间的内在局限性可能影响分类数据分辨率和解释复杂化指纹。虽然大多不被认为是这样的,两种现象的系统误差来源在社区指纹分析135年,197年]。由于multioperon效果,一个单一的物种可能会出现几个乐队,而不是一个乐队在钻资料从而导致多样性的高估。例如,Satokari et al。99年)杰出的三个不同的DGGE乐队在分析的扩增子双歧杆菌adolescentis写明ATCC 15703^T获得与双歧杆菌属特殊技能PCR引物Bif164-f和Bif662-GC-r(表2)。进一步检查发现五核糖体rna基因簇的存在在这个压力,包括两个集群表现出微观不均一性,被可视化为两个单独的乐队。第三个可视化乐队似乎heteroduplex前两个片段。类似的观察发现使用其他类属特异性的引物定位乳酸菌集团(88年)和脆弱拟杆菌子群(64年]。另一方面,目标基因的多态区域数量不足可能会导致低估的两个或多个物种的多样性,因为乐队在社区有相同的位置指纹。例如,PCR引物Lac1和Lac2具体乳酸菌集团(88年表2)区分的成员不允许干酪乳杆菌组的结果相同V3-16S rRNA基因序列。从理论上讲,可以减少上述影响选择合适的V地区16 s rRNA基因(131年,198年]。另外,单份管家基因的特点是高替代率等rpoB(199年- - - - - -202年)最近被用作微生物群落分析的目标,但仍然等待实现肠道微生物学。据我们所知,使用transaldolase bifidobacterial种群的基因在一项研究中发现在粪便样本74年)是唯一的应用程序在肠道微生物使用另一种目标基因。

4.3。空间数据分类解析配置文件

几个作者已经确定扩增子的SDE comigration病例分析显示明确的序列变异(203年- - - - - -206年]。即使对系统压力无关,据报道,相应的扩增子可能有类似的融化行为导致贫困电泳分辨率钻(207年- - - - - -209年]。comigration也可能导致问题的现象来获取可靠的从个人乐队提取序列信息。在某种程度上,可以解决comigration利用典型的SDE的技术的优势,也就是说,使用更狭窄的梯度,以生产高分辨率SDE概要文件与特定原始配置文件的一部分。这种方法被称为变性梯度凝胶电泳凝胶膨胀(210年,DGGEGE]。

尤其是SDE概要文件从肠道等复杂的生态系统,乐队测序分析可能是少的预期有几个原因。首先,有多个序列存在的可能性在一个乐队由于comigration。在这种情况下,应该引入一个克隆的步骤之前的实际测序片段。此外,据报道,切除DNA片段通常含有ssDNA来自其他生物样本中导致基因序列剖面的污染。消除ssDNA产品通过绿豆或S1核酸酶治疗前筛选了DNA扩增(克隆)可以增加成功率获得纯粹的DNA序列SDE的乐队的目标(75年,211年]。另一种更复杂的方法来克服上述问题同时涉及到直接从原始PCR克隆个体克隆筛选后的产品与环境样品。在这种情况下,它应该记住片段的大小范围,可以可靠地隔开SDE仅限于100 - 600个基点(最优200个基点)。序列分析的相对较小的碎片可能阻碍可靠识别物种水平。此外,在硅片和DGGE分析揭示了大V3和V3-V5-16S rDNA引物与人类18 s rRNA基因(119年]。尤其是活检或blood-contaminated粪便样本,与16 s rRNA coamplification不属预定目标的真核生物的DNA基因引物可能导致细菌生物多样性的高估SDE分析当没有后续分析的个人社区扩增子进行克隆和测序。

旁边他们相对电泳位置和序列组成,钻的强度和清晰度乐队需要特别注意。Artifactual双波段,即每个著名乐队的情况由第二,伴随近距离通常没那么强烈的乐队,在几个钻已报告的应用程序。Janse et al。212年)建议最后的延伸PCR伸长步骤可以足以防止artifactual第二个乐队的形成。双波段的起源在钻被作者解释为次要产品的形成由于过早地终止伸长在每个PCR循环。延长高温孵化期间最终伸长应该破坏这种结构,同时允许TaqDNA聚合酶合成一个完整的扩增子。另一个观察可能阻碍SDE的分辨率分析模糊乐队与扩展的现象。这种不一致的来源是多个融化域的存在(mmd)放大碎片导致缺陷逐步增加,最终导致广泛的可视化和分散的乐队。是知之甚少的分布多依赖于目标片段和系统组。这一现象被观察到在使用通用16 s rRNA SDE基因引物分析不同类型的环境样品包括粪便(64年)、水(204年),和土壤(213年]。弱,模糊乐队错误可能被视作涂片背景导致误解的丰富性。弯曲或微笑的乐队在凝胶的边缘附近的车道似乎任何SDE协议的一个内在特征。尽管其真正原因并不完全清楚,微笑效应被认为源于尿素和甲酰胺渗入到缓冲区在运行期间,从而降低变性物质的浓度在凝胶的边缘。这种影响可以避免跳过外侧车道在加载和/或通过应用硅脂间隔器(214年]。

4.4。检出限

SDE-based方法的检出限,即最低(相对)浓度或数量的任何成员复杂的细菌生态系统需要出现在相应的可视化社区指纹,最初估计接近总人口的1% (49]。这个估计后来证实TGGE肠样品分析(95年),而Vanhoutte et al。64年]报道10⁶CFU / g粪便(湿重)作为检测水平可以达到DGGE粪便微生物群的主要成员。在这种情况下,应该强调,检出限是一个相对值,可能强烈依赖于几个参数包括生态系统分类的复杂性出现在示例中,DNA的提取效率,细菌总数,每个生物样本的相对浓度。人类粪便通常包含10¹⁰-10年¹²CFU / g的粪便,因此可能检出限可以提高如果10¹⁰10 CFU / g相比¹²CFU / g存在由于低构成DNA模板之间的竞争在PCR扩增。一般来说,可能可以提高检测特定的分类单元通过使用类属特异性的引物,可以缩小目标人群的规模。然而,即使使用genus-specific底漆的模板DNA比率仍可能影响某些种类的DGGE-based检测中未被充分代表的混合社区样本128年]。虽然缺乏研究SDE-based社区人类微生物群的指纹,多个位移放大(MDA)可能提供另一个策略来提高检测水平尤其是在较低的活检样本细菌计数。MDA的使用来核酸外切酶抗随机寡核苷酸引物和噬菌体Phi29 DNA聚合酶将丰富任何DNA目标(215年),以及由此产生的模板池可以用于16 s rDNA SDE PCR和随后的分析,例如,使用TTGE [216年]。

5。结论和未来的角度

综述强调了其广阔的应用光谱SDE-based技术领域的肠道微生物,包括细菌的主要评估肠道社区结构的复杂性和多样性,在不同人口成分变化的监测水平在饮食或治疗干预措施。在更高级的方法中,额外的工具,如乐队序列分析,带位置分析,和印迹分析允许进一步分类的探索在肠道微生物群落存在。总的来说,钻技术是技术上相当简单,快速,灵活的和可再生的。因为他们允许同时分析多个样品,SDE-based方法可能非常适合为人类metagenome研究候选对象的选择。结合可视化能力差或尚未unculturable细菌组,这些特性是导致当前钻技术的名望和声誉。

与其他方法一样,但是,也SDE的方法有一些固有的局限性。除了一般的偏见与抽样(包括样本大小),总DNA提取、PCR扩增,也更具体的限制如种内的16 s rRNA基因操纵子异构性问题,限制片段长度,或者模糊乐队可以限制SDE的适用性。另一方面,重要的是要始终考虑这些缺点的意义和可能的后果的研究,因为一些局限性不会同样重要的是,当监控社区稳定相比,当评估生物多样性。最重要的一个步骤的定义一个新的SDE协议是引物的选择目标,已经可以预防一些潜在缺陷相关的钻。仔细选择目标片段的序列变异和分布的多个融化域和一个明确的关注感兴趣的门有利于实现所需的分辨率。此外,还SDE的技术本身是不断发展的。变性高效液相色谱(DHPLC)最近被引入基于SDE的原理来检测遗传变异,但采用的高效液相色谱柱不是聚丙烯酰胺凝胶矩阵分离扩增子(217年]。在完全自动化的集成工具,如Transgenomic波系统(http://www.transgenomic.com/),DHPLC分析提供了几个优势传统的空间数据分析包括凝胶制备的缺乏,更高的吞吐量,并可能进一步自动收集样本分数(序列)的分析。DHPLC已成功用于分析微生物群落较低(218年,219年)或高(220年)的复杂性。一个特定的肠道微生物学领域的研究表明,DHPLC提供了许多技术的好处相比,DGGE但似乎有相同的限制在分类解析分析16 s rRNA基因扩增子(97年]。等其他新兴技术的结合isotopically标记底物分析RNA-DGGE [221年)可能会提供一个有前途的前景实现功能研究肠道微生物群。

在当代肠道微生物,SDE-based方法很少使用作为一个单一的或端点方法但是通常与文化相结合的方法和/或其他分子方法如克隆库、鱼、实时PCR和微阵列在一个互补的研究策略。毋庸置疑,这些多相研究设计应进一步追求和发展微生物多样性扩大目前的见解,动力学,肠道内的相互作用。在这方面,最主要的挑战之一在于结合分析微生物的存在和微生物活动。作为这样一个集成方法的一个例子,平行DGGE分析定位16 s rRNA基因分类标志和腺苷--phosphosulfate还原酶亚基基因功能基因的继承和多样性已经被用于研究硫酸盐还原菌在小鼠胃肠道(222年]。在这方面,大量的信息预计从大规模测序的努力如人类微生物组计划(http://www.nihroadmap.nih.gov/hmp/)可能为端引物的发展开辟新的途径针对特定功能基因。考虑所有即将到来的技术发展,预计SDE社区分析将保持甚至加强其地位目前巨大的分子光谱方法用来解开人类微生物组内的宿主和micromicrobe交互。成功的公司最近推出了DGGE分析的功能宏基因组的概念(223年),也就是说,transgenomic表征的关键功能微生物组的成员,大部分影响宿主代谢,进而影响健康,提出一线在这方面的证据。

确认

作者希望承认金融支持IWT-Vlaanderen,比利时布鲁塞尔(GBOU项目没有。010054,“发展一种快速、无创技术工具来调查支持的功能和功效和益生元在正常健康的人类:使用生物标志物”)和科学基金Research-Flanders (f . w . O。-Vlaanderen、比利时)g .驾车的博士后奖学金。m . Cnockaert的帮助非常感谢在文献调查。

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