正常的结肠微生物群生态表征和腹泻的狗

文摘

我们使用终端限制片段多态性(T-RFLP)分析评估(1)稳定的粪便微生物群狗生活在环境中以不同程度的暴露因素可能会改变微生物群,(2)微生物群的变化与急性发作的腹泻。结果表明,健康犬胃肠道港口潜在的肠道病原体。狗住在一个环境提供最小的风险因素可能改变微生物群有类似的微生物群;狗的微生物群保存在变量环境更变量。大量的微生物群的变化发生在腹泻的事件,包括水平的提高perfringens梭状芽胞杆菌、粪肠球菌,肠球菌都有效。当一只狗的饮食和药物之前稳定的微生物群反复改变,微生物群也不断改变。时间趋势分析显示方向变化的微生物群扰动后,恢复到初始条件,然后波动会随着时间而改变。

1。介绍

急性感染性腹泻是一个世界性的公共卫生问题和一长串的鉴别诊断。在美国,负责大多数情况下包括主要的病原体弯曲杆菌,沙门氏菌,志贺氏杆菌,大肠杆菌O157: H7,隐孢子虫(1]。弧菌,鼠疫,李斯特菌,环孢子虫,艰难梭状芽胞杆菌,贾第虫属轮状病毒,痢疾阿米巴较低的利率也报道(1]。产肠毒素的致肠病的,enteroaggregative, enteroinvasive株大肠杆菌,产毒perfringens梭状芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌也和诺瓦克病毒导致感染类腹泻,但可能不包括在常规测试(1]。狗急性腹泻的主要病因是相同或相似的生物在人类[2- - - - - -6]。狗的其他已知病原体包括piliforme梭状芽胞杆菌(7),Brachyspira(Serpulina)。8),肠球菌spp。9),而幽门螺杆菌spp。10- - - - - -12]。在人类和狗,很多细菌,如肠球菌种虫害和某些梭状芽胞杆菌spp。被认为是机会致病菌,或从其他生物增强疾病时条件非常适合他们的增长和竞争对手缺席(13- - - - - -15]。大多数情况下急性感染性腹泻是自限性疾病,在几天内解决有或没有症状补液治疗以及抗菌或抗寄生虫药物针对“病因代理人”[16]。已知的存在胃肠道病原体恢复或演示了用于属性病因在腹泻的插曲;然而,因果关系是很少了。

一些功能性胃肠道疾病的动物模型存在,但狗胃肠道和人类微生物群熊的很多相似之处。狗是单胃的杂食动物的饮食操作很容易实现和一个小型盲肠只提供一小部分后肠道发酵。狗窝持有者短生育间隔,在家庭相关的个人很容易获取和管理可以操纵控制环境因素。早期的工作已经完成,并描述胃肠道微生物群健康的狗。微生物群落的分析粪便从4紧随其后的是拉布拉多品种的狗都使用文化16 s rRNA基因测序(17]。尽管花费了大量的努力,这些方法低估了社会多样性和倾斜的结果对生物在特定培养基更成功。这些结果支持使用的分子方法确定社区的档案,但是在当时,许多分离序列没有核糖体数据库项目中发现和EMBL的数据库。Suchodolski等人描述了微生物群落在十二指肠、空肠、回肠、结肠内容从六个健康无关的狗使用near-full-length 16 s rRNA基因PCR和克隆库(18]。在这里,厚壁菌门是最多样化和丰富的门;梭菌属的是最多样的细菌,形成几个梭状芽胞杆菌集群;厌氧Fusobacteriales和细菌性的沿着肠道,增加他们的相对丰度在回肠和结肠峰值;和Lactobacillales通常发生在小肠的所有部分。这些结果在厚壁菌门和梭菌属的人类是相似的(19)与梭状芽胞杆菌集群XIVa主要贡献者梭菌属的狗和人类的序列。此外,Fusobacteria似乎是一个小的一部分肠道社区在其他物种,包括人类[19]。同时,变形菌门包括大肠杆菌例如organisms-predominated在十二指肠和结肠中稀疏的狗(18)和人(19]。在另一项研究旨在定义主机分布模式的粪便细菌的秩序细菌性的作为粪便来源识别标记在水生环境中,人类,狗,猫,和海鸥序列在系统发育分析[被聚集到一起20.]。Swanson等人进行的一项研究使用健康的狗是否生命起源以前的(fructooligosaccharides)或益生菌(嗜酸乳杆菌)治疗会改变肠道微生物种群,发酵产品,和养分消化率(21]。在一个实验中,fructooligosaccharide治疗降低了c . perfringens和粪便丁酸和乳酸浓度增加,而在第二个实验中,这种治疗增加双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸粪和丁酸减少粪便氨、异丁酸盐,摘要,支链脂肪酸浓度。最后,近期全球脊椎动物肠道微生物群的研究表明,俘虏(动物园)布什狗肉食饮食与其他食肉动物,微生物群落,集群和杂食性饮食上灵长类动物粪便微生物群最像人类一样22,23]。在这些研究中使用基于树和基于网络分析微生物群落,集群通过饮食(杂食动物,食草动物或食肉动物)是非常重要的。然而,这些调查人员没有考虑现代宠物狗在精加工的微生物群与人类饮食和同居。综上所述,这些研究表明,狗是一个合理的模型来研究微生物群的作用在胃肠道疾病和胃肠道微生物群落的理解狗处于准备阶段这是追求。

许多腹泻疾病归因于特定病原体,交互,幼童腹壁薄弱、变化或微生物群落失衡的居民为了应对外部压力(s)。因此,急性类腹泻可以从无数的病因做出归因结果困难。最近,注意力一直集中在微生物群的作用。正常肠道生物或“enterome”是一个复杂的微生物生态系统中扮演着关键角色在维持胃肠道内稳态和某些疾病(24]。然而,据估计,300 - 500不同种类的细菌生活在人类结肠,其中许多是没有可耕种的25]。这估计的多样性改变了多年来,甚至与分子技术的应用研究结肠微生物群(26,27]。Eckburg et al。26)使用收集器的曲线估计,大规模测序揭示至少500种。期间增加了复杂性分析的是胃肠道微生物的数量,从而达到的密度生物/克粪便,总肠道的人口微生物(28]。狗的品种和年龄被证明有重大影响特定有氧和厌氧细菌计数使用变性梯度凝胶电泳的PCR扩增16 s核糖体碎片。这里,每个狗存在特有的粪便细菌社区是独立于饮食29日]。我们推测,狗有一个稳定的结肠微生物群落的组成和发作的腹泻导致持久的社区组成和/或功能的变化;此外,治疗特定的病原体可以复合这些影响。为了解决这个假设,我们需要(1)腹泻的扰动的胃肠道有或没有治疗研究,(2)文档在胃肠道病原体的存在,(3)具有成本效益的技术评估胃肠道微生物群的变化,和(4)保证一个人对我们来说是足够稳定的微生物群能够探测到有意义的变化。我们使用PCR诊断化验记录在胃肠道病原体的存在。我们研究胃肠道的扰动(1)急性发作的腹泻有或没有抗生素治疗和(2)改变饮食和药物。我们选择的技术评估胃肠道微生物群的变化是末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析。

T-RFLP是一个家庭的相关技术用于描述含有大量微生物群落的生物对鼻窦和/或难以培养。T-RFLP基于PCR扩增和限制性内切酶消化16 s rDNA PCR产品其次是毛细管电泳在DNA测序仪。这里,使用探索性数据分析统计技术帮助揭示模式而不是更熟悉推论统计,帮助区分假设。社区研究使用这些技术,迄今已报告涉及少量的样本。例如,尼尔森等人乳酸菌的数量和总细菌群落特征在一个示例分别来自三个四人体结肠段(30.]。在这项研究中,社区从结肠在同一个体的不同部位相似,但总社区个体之间的不同。在另一个试验中,粪便社区在八个人不同的年龄和性别进行了研究;五成人和两个孩子有类似数组的微生物粪便社区但不同比例的细菌物种,而降生的婴儿有一个更简单的社区(31日]。因此,T-RFLP数据显示有价值的结果尽管归因特定细菌属或物种的收益或损失是不可能的。同时,我们认识到,许多因素可能影响的结果T-RFLP技巧;这些因素包括引物的选择;限制性内切酶的选择;和各种由于PCR反应扩增偏差等参数的数量和复杂性的模板DNA,退火温度和周期数量扩增反应(32- - - - - -35]。不过,T-RFLP快速、敏感、和可再生的31日,34),与其他社区分析技术,它得到的关于生物在社区分类信息和估计总微生物种群的相对比例。它被认为是一个有用的工具在微生物群落的研究,可以用于生成数据,帮助确定是否进一步研究采用更精确,费力,和昂贵的技术,如目标实时PCR检测和量化的特定微生物或生成,测序,分析克隆16 s rDNA库,是合理的(31日]。

解决我们的假设,我们研究了微生物群落的狗在腹泻的情节和比较他们的健康控制狗做出初步评估正常社区的成员贡献的急性腹泻病的过程。这些研究结果表明,粪便微生物群中不同的狗,即使那些是密切相关的,在很大程度上受饮食的影响。一只狗用灭滴灵治疗腹泻并表现出丰富的损失之后,回到一个稳定的微生物群;相同的治疗旨在腹泻导致不稳定的微生物群的第二回合,最终失去了丰富度和均匀度。因此,我们假设,狗有相对稳定的结肠微生物群落和发作的腹泻导致的不稳定加剧了抗菌治疗特定的病原体,可以用这些方法解决特别是环境因素是有限的。这项工作表明,狗可以用来研究微生物群落变化与天然类腹泻相关联。

2。材料和方法

2.1。招生的研究狗和实验设计

我们建立了一个标准的操作程序样本收集和处理是密歇根州立大学机构批准的动物保健和使用委员会(2-16-2006)。这项研究还遵循的指导方针和标准协议密歇根州立大学(MSU)兽医教学医院(VTH)。所有动物的信息包含在表中给出的研究1。一组八个家庭宠物狗在一年参加这项研究。这八只狗包括两个从单个家庭宠物(宠物在表1和21;宠物1腹泻)的一个插曲,一个从第二个家庭宠物(宠物在表31;这个宠物遭受了两集的腹泻治疗MSU VTH),一个健康的从第三个家庭宠物(宠物在表41从第四个家庭),两个健康的宠物(宠物在表5和61),两个来自不同家庭宠物展示MSU VTH与腹泻(宠物在表7和81)。5控制狗从一个扩展相关基因家族被录取,被安置在一个MSU-closed研究殖民地,每天都吃相同的食物,在室内锻炼,以防止感染。从这些狗粪便收集评估重复性和技术质量协议和提供比较腹泻病例。

所有诊断测试(除了一个ELISA检测贾第虫属)和T-RFLP分析进行DNA分离粪便样本。T-RFLP分析DNA的质量不能孤立的两个样品从宠物宠物4或5,6,7,8。诊断PCR结果提出了对所有13狗:T-RFLP结果提出了五个研究蚁群狗和四个家庭宠物狗(宠物1,2,3,4)。T-RFLP分析粪便微生物群的随着时间的推移,我们收集粪便样本重复三个家庭宠物狗来评估变化的微生物群基于住房和喂养政权。正如上面提到的,其中两个三只狗经验丰富的腹泻,其中两次。因此,我们收集了这些狗在治疗期间和治疗后的样本,如果有的话,与规定的抗生素。

2.2。历史和临床检查

抽样的总体战略狗如图1。的情况下定义与腹泻是一只狗,一只狗出现急性腹泻。如果狗交给MSU VTH腹泻,我们制定了重采样后三到五天完成治疗。其中一个腹泻的家庭宠物(宠物3表进行了研究1),两个最初的抗生素治疗前采集标本和抗生素治疗期间及之后进一步采集标本;宠物在表11,最初的样本腹泻的和随后的采集标本后解决疾病,不及时治疗。

用例出现急性大肠腹泻的迹象,典型的密歇根州立大学小动物诊所协议包括粪便浮选,贾第虫属测试和粪便细胞学。灭滴灵治疗通常包括一个短期课程(10 - 50毫克/公斤报价)和机构的低渣饮食。在这项研究中,我们的协议涉及历史,进行体格检查,启动诊断测试根据标准方法目前受雇于MSU VTH。

2.3。样品处理和DNA隔离

初步研究进行了定义最好的方法处理粪便样本优化T-RFLP分析。使用干净的手套为每个动物,研究样本殖民地狗和宠物免费1和2被抓或直肠样本;样本其他狗排便后立即从地上被照顾,以避免采取任何样品接触地面的一部分。次级样本来自粪便的内部质量进行分析。粪便是放在胰蛋白示酱油汤与15%的甘油,混合好,整除至少4 - 5相同的次级样本;三个被冻结在80−人DNA提取。样品受到以下治疗方法之一:坚持只冰足够长的时间运输到实验室,保持在室温下24小时DNA提取前,控股在冰上DNA提取前24小时,制冷DNA提取前24小时,和冷冻24小时前DNA提取。这些条件是为了模仿临床标本的可能命运之前提交给实验室。DNA可以恢复量足以诊断PCR和T-RFLP分析从样品接受治疗,尽管收益率时更大的样本在冰只有足够长的时间运输到实验室。冻结时首选的样品不能立即处理,以避免微生物群的变化,记录在样品室举行或制冷温度36- - - - - -38]。

细菌种群被暂停从200毫克的粪便样本300毫米蔗糖溶液中紧随其后的是两个低速离心(描述39]。细菌被收集的高速离心和200毫升10毫米的小球resuspended三1毫米EDTA, pH值8.0。Klijn et al。39)报道,该方法结果的恢复80%以上的需氧或兼性厌氧细菌能够生长在哥伦比亚血琼脂培养基(他们没有化验专性厌氧细菌)。类似的差速离心的方法已被用于分离细菌的DNA从鸡digesta胃肠道微生物群落分析(40,41),大鼠盲肠的digesta [42),和人类粪便43]。社区收获的细菌细胞中DNA孤立使用试剂盒DNeasy组织工具包(美国加州试剂盒,瓦伦西亚)根据制造商的说明革兰氏阳性细菌,包括消化第一20毫克/毫升溶菌酶在37一小时^°C其次是蛋白酶K(20毫克/毫升)隔夜55岁^°C;然后从溶解产物纯化使用DNA试剂盒旋转列。

2.4。筛查常见病原体在正常和腹泻的狗

粪便样本筛选的寄生虫Cornell-Wisconsin饱和蔗糖漂浮技术(44]。贾第虫属测试执行使用Giardia-ELISA-microplate前景分析(Remel Lenexa,菅直人美国)根据制造商的指示。DNA准备筛选DNA的存在从以下标准聚合酶链反应检测细菌病原体的使用底漆对出版和循环条件:perfringens梭状芽胞杆菌(45),弯曲杆菌spp。5),肠球菌spp。46),肠球菌都有效(47),幽门螺杆菌spp。48),沙门氏菌spp。49),而Brachyspira (Serpulina)spp。50]。纯化的DNA样本的已知细菌物种被用作PCR检测阳性控制。此外,定量PCR检测(Q-PCR)进行使用引物和循环条件由Rinttila et al。51]拟杆菌种虫害和相关的生物,梭状芽胞杆菌组我,梭状芽胞杆菌XIVa组。然而,Q-PCR化验大肠杆菌进行发布(52];Q-PCR化验的肠球菌都有效,粪肠球菌进行如下所述(53]。

2.5。T-RFLP分析

终端限制片段多态性分析使用516 f - 1510 r引物,进行PCR反应混合物,PCR循环条件和限制性内切酶消化条件所描述的长岛et al。31日),除了反应进行了使用50 ng模板DNA总量100l .远期底漆6-FAM荧光探针。PCR产物纯化使用QIAquick PCR净化列(试剂盒;美国加州瓦伦西亚)根据生产的协议之前消化声波测井我(新英格兰生物学实验室,Inc .,伊普斯维奇,质量,美国);由此产生的碎片通过电泳分离DNA自动测序仪(ABI棱镜3100)在密歇根州立大学基因组技术支持设施。一个内部巷标准(MapMarker1000;美国田纳西州BioVentures,莫非斯堡)添加到每个样本,和使用的标准峰值大小的基因检测分析软件计算峰值大小。重复被存储为电脑文件供以后分析。

2.6。T-RFLP数据分析

分析T-RFLP声波测井我峰值模式进行如下。只有峰值对应于DNA片段长度从100年到990年,英国石油(bp)的长度,高度至少25荧光单位,造成至少1%的总面积electropherogram下被认为是;重复总面积小于5000荧光单位没有分析。可能的身份确定被检测出细菌的系统发育组手动通过比较峰值片段大小片段大小分配给不同细菌群体的长岛et al。31日),允许的误差±1 bp。山峰没有落入大小类定义的长岛et al。31日)结合形成一个“未知”类。细菌群体的身份和峰值大小的范围,将每组如表所示2。社区档案由细菌组的列表现在或缺席在样本和% electropherogram由每组下的面积。

聚类分析,% fourth-root区域数据转换,并使用Bray-Curtis相似性指数单链接聚类分析进行转换后的数据54];构建系统树图,其稳定性是评价使用重叠过程[55]。这些计算是使用实用程序执行由约翰Brzustowski公布于网上http://www2.biology.ualberta.ca/jbrzusto/cluster.php。Bray-Curtis相似性指数被广泛使用在群落生态学的研究,因为它比其他指标影响较小的差异涉及罕见、生物丰度低,它被认为与数据集包含广泛不同的社区表现得更好(55,56]。这个索引考虑高峰和差异的存在和缺乏的地区在重复同样的山峰下,标明特殊有机体的比例的差异在两个种群。

我们也计算了描述性的专为分子生态开发的指纹识别微生物群落参数Marzorati et al。57];社区参数总结社区丰富(),功能性组织(佛、均匀度)和动态(%和改变)。这些参数计算和解释为T-RFLP概要文件生成在这项研究中描述Marzorati et al。57),除了Bray-Curtis相似性指数的计算中使用参数变化百分比而不是使用的相似性指数Marzorati et al。57]。最后,模式的可变性T-RFLP概要宠物3的回归方法分析了随着时间的推移,柯林斯et al。58]。欧几里得距离微生物群落在不同时间点计算使用实用程序通过约翰Brzustowski公布于网上http://www2.biology.ualberta.ca/jbrzusto/cluster.php;回归分析是使用SigmaStat执行3.1(美国加州里士满Systat软件,点)。

2.7。实时定量PCR方法和分析

从粪便中提取DNA(如前所述)作为模板在菌种Q-PCR化验。拟杆菌/普氏菌/ Porphyromonas和梭状芽胞杆菌组我和XIVa化验进行使用的引物序列Rinttila et al。51]。大肠杆菌Q-PCR化验进行使用引物序列从汗等。52];粪肠球菌和肠球菌都有效Q-PCR化验进行使用的引物序列Firmesse et al。53]。在所有的化验,25岁L反应进行了一式三份为每个样本与智商SYBR绿色Supermix(美国加州Bio-Rad,大力神)和250 ng粪便DNA。以下循环协议被用于梭状芽胞杆菌组我,梭状芽胞杆菌集团XIVa拟杆菌,大肠杆菌:95^°C 3分40 95年重复^°C 10秒钟,特定的退火温度为30秒。循环参数大肠都有效是95^°C, 3分钟;63的循环^°C 10秒钟。循环参数粪大肠是95^°C, 3分钟;40周期为64.5^°C 10秒钟。每一种特异的引物浓度和退火温度的试验进行优化。拟杆菌物种的分析使用了6.25点的每个每个反应引物的退火温度65^°C。大肠杆菌化验使用6.25点每个引物的反应和63.3的退火温度^°C。梭状芽胞杆菌组我和XIVa使用7.5点的每个每个反应引物退火温度为58.9^°C和57^°C,分别。所有Q-PCR化验包括6个标准曲线一式三份()和三个没有模板控制包含所有其他反应组件Bio-Rad iQ5实时PCR检测系统(美国加州Bio-Rad,大力神)。三个DNA准备购买的标准曲线:perfringens梭状芽胞杆菌为梭状芽胞杆菌组我(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国),瘤胃球菌属长生蜿新品4299梭状芽胞杆菌组XIVa和脆弱拟杆菌新品2553 (DNA从美国购买类型文化收藏,马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。三个DNA准备标准曲线在我们实验室准备奥苏贝尔的CTAB方法等。59从菌株大肠杆菌DH5 -α,粪肠球菌19433年,肠球菌都有效19434年。

Bio-Rad iQ5 PCR检测系统软件(美国加州Bio-Rad,大力神)被用来计算每个反应的Ct值,每个组一式三份,平均Ct值和目标DNA的数量使用价值来源于标准曲线。人口统计PV,量化变化丰富随着时间的推移,计算每个生物的化验使用Q-PCR数据(60]。

3所示。结果

3.1。狗参加研究

信息在性别、年龄、品种和饮食的狗参加表中给出的研究1。5控制狗住在密歇根州立大学殖民地被确定,每天吃相同的食物,在室内锻炼。这些狗来自一个家庭开发研究一种遗传疾病与胃肠道无关。因此,狗全部或一半的兄弟姐妹,或者他们的父母。我们还收集粪便从四个正常狗生活在家庭评估变化的微生物群基于住房和喂养政权。家庭宠物,两人监督外(如走在皮带),一个是可以自由行走在郊区的环境中,和一个可以自由行走在农村环境中。此外,四条狗生活在家庭的两个经验丰富的腹泻,其中两次,收集后正常的样本。因此,我们收集了这些狗在治疗期间和治疗后的样本,如果有的话,与规定的抗生素。

粪便样本筛查贾第虫属通过ELISA。两只狗(宠物8表之一1)向密歇根州立大学小动物诊所,腹泻呈阳性贾第虫属;所有人都是消极的。粪便样本筛查其他寄生虫通过粪便浮选;都是负面的。粪便样本DNA提取和特征使用PCR七肠道病原体。两个五个研究群体的狗肠球菌都有效,弯曲杆菌spp。,幽门螺杆菌spp。(研究狗1和5)。两人的5个肠球菌种虫害,幽门螺杆菌spp。(研究狗2和4)。第五个研究蚁群狗只携带肠球菌都有效(研究狗3)。诊断PCR检测进行粪便DNA从七获得贾第虫属负面的家庭宠物表明五(宠物1、2、3、4、5)至少有一个样本阳性肠球菌spp。幽门螺杆菌spp。,弯曲杆菌种虫害在采样周期;三个生物都被发现在很多样品同时进行。宠物6呈阳性弯曲杆菌种虫害和肠球菌种虫害,但不幽门螺杆菌spp。宠物7,呈现在密歇根州立大学小动物诊所,腹泻,呈阳性肠球菌种虫害和幽门螺杆菌spp。13狗都是负面的沙门氏菌种虫害和Brachyspiraspp。

3.2。细菌社区研究蚁群狗

T-RFLP粪便样本的分析研究结果殖民地狗如图2。社区组成面板所示(一个);对于这个图,%的峰值对应于细菌组交办长岛et al。31日)相结合的分类级别的顺序如下:Bifidobacteriales(峰值声波测井我124年),Bacillales(峰值声波测井我322年,520年和657年),细菌性的(峰值声波测井我317年,469年和853年),梭菌属的(峰值声波测井我370、494、749、919和955年),Enterobacteriales(峰值声波测井我940年),和未知的(不是所有的山峰在前面的分类组)。而很多声波测井我山峰由长岛et al。31日)包含生物体从多个订单,检查表1在他们的出版物显示,一个属的成员做控制几乎所有的山峰。顺序的分类水平也捕捉肠道细菌的生理的某些方面可能是重要的在确定结肠健康。

粪便细菌群落组成的基因相关研究殖民地四五个狗狗很相似(图2、面板(a)和(b))。狗1、3和5住在同一间屋子里,三个研究动物,pcr阳性肠球菌都有效。社区丰富的价值衡量Rr这些社区如图2面板(c),计算这些值在每个概要文件使用所有的山峰,不合并后的订单水平数据面板(a)所示;值与所报道的Marzorati et al。57)等丰富的微生物环境土壤和沉积物。社区功能组织参数的值(佛反映了“平衡”的模式生物)的相对丰度图所示2面板(d);值从0.42到0.60不等。Marzorati et al。57)的特点Rr值> 30指示环境能够维持大型多元化的社区。佛值研究蚁群狗粪社区下降约0.45,这一价值Marzorati et al。57)描述为指示平衡扰动期间社区能够继续正常运作。

3.3。家庭宠物狗

T-RFLP分析从两个宠物狗粪便的社区(宠物1和2)住在同一个家庭,随着时间的推移,如图3。这些狗是基因不同,美联储干饮食:成人饮食和一只小狗的饮食来自同一制造商。成年狗(宠物1)被允许自由地漫游在农村环境中,当小狗(宠物2)户外运动下业主监督。腹泻的集宠物1天1是由于饮食轻率和解决第二天;这是“开花”的特点声波测井我940 (大肠杆菌)。社区组成两条狗的粪便样本不同,表现出相当大的变化(图3面板(a))。然而,五个六个社区的宠物组成模式2图所示的系统树图结合在一起3(b),面板。丰富的参数值Rr宠物1从25到50不等;的值Rr宠物2范围从11到147(图3面板(c))。这些Rr值通常是低于获得研究蚁群狗。佛值的范围从0.30到0.77的宠物从0.39到0.53 1和宠物2(图3面板(d))。佛值两种狗都比社区组成或常数Rr值。社区动态变化百分比参数计算顺序(图样本3面板(e));因为样本之间的时间间隔不相等,我们没有计算变化率参数。宠物1的值范围从0.40到0.75,宠物2从0.45到0.86。这些变化百分比值远高于那些报道的其他种类的微生物群落Marzorati et al。57]。

T-RFLP概要文件是来自另一个家庭宠物(宠物4);这种动物是美联储商业成人的饮食和休闲桌残渣和可以自由行走在郊区的环境中;这两个Rr和佛值较低,分别为6.0和0.31。

3.4。家庭宠物狗反复腹泻

T-RFLP粪便样本分析的结果从一个家庭宠物狗(宠物3)经历两个单独的腹泻在图所示4。这种动物是美联储商业体重控制干纤维饮食两到四次高于其他狗的饮食在这项研究中,户外,一直监督业主当在一个郊区的环境中。入学的时候在这项研究中,这个宠物是治疗骨关节炎与carprofen 1.0毫克/公斤报价;入学后121天,用量增加到2.0毫克/公斤报价。温和厌食症了151天,补充营养和业主开始以不同的方式来刺激食欲;这个补充贯穿研究的其余部分。第二集腹泻后168天,carprofen是停止治疗和治疗曲马多(2.7毫克/公斤TID)。曲马多是由于呕吐停止219天deracoxib(1.4毫克/公斤SID)开始;这种药物也没有良好的耐受性和天233年停产。没有进一步的止痛剂在研究过程中。

pathogen-specific PCR检测结果对这种动物如表所示3。弯曲杆菌和幽门螺杆菌PCR试验在11种虫害检测的15个样品;的弯曲杆菌spp。PCR试验是积极的在两个样本在第一集的出现腹泻。粪肠球菌和大肠都有效检测呈阳性的第一集开始腹泻。粪大肠没有检测到随后的试验,而大肠都有效水平低于检测极限,直到出现腹泻的第二集当狗成为积极的30天的课程。

社区组成相似的正常样本1天,17日,70年,78年,85年、113年和134年。发作的腹泻发生在61年和168年开始;集都是用灭滴灵治疗(1号治疗开始65天(14.0毫克/公斤,10天)和第二天172年开始治疗(14.0毫克/公斤竞购6天)),和一段时间的低渣饮食。因为第二集的腹泻发生后107天第一个开始和返回的微生物群组成间隔期间,第二集可能不是一个antibiotic-associated腹泻。群落组成回到它的起始组成第一集后腹泻而不是在第二次;两集也不同的特征,第一个被主导Enterobacteriales和梭菌属的和第二个Bacillales。简单的粪便细胞学由密歇根州立大学VTH员工第二集腹泻的发病是宣读细菌过度生长。社区没有开始回到它原来的成分在较长时间内的第二集后腹泻。在抽样的最后一天,代表所有在场的订单之前被检测到,但他们的比例改变与正常样本。社区的聚类图显示相似的在不同的时间(图4,面板(b))也演示了这种模式:168年之前的大多数样本日聚集在一起,远离腹泻的样本和正常样本的第二集后腹泻。

社区丰富的变化参数Rr值如图4面板(c)。社区丰富跌至11.2以下机构的价值灭滴灵治疗腹泻的第一集,但反弹至高水平(460)下个月慢慢下降。丰富严重腹泻的第二集,没有回到甚至适度的水平;重复的变化期间药物和饮食都是第二集后腹泻。的变化佛值(图4面板(d))不太明显,但始终有点低的第二集后腹泻。

社会动力学参数变化百分比的变化也反映了上述事件(图4面板(e))。大值(0.85 - 0.99)与腹泻的两集。第一集前腹泻和恢复后,变化百分比值的范围从0.09到0.38,与报道的其他类型的社区Marzorati et al。57]。Marzorati等人特征变化百分比值约为0.10,表明社区是稳定的;新生物能够成为建立但不干扰社区功能。非常高的变化百分比值与腹泻的相关集宠物3第二集后,变化百分比值继续波动,表明社区没有回归稳定。这段动荡之际,药物和饮食中重复变化的时期。

颞可变性T-RFLP数据也使用回归方法分析了柯林斯et al。58)(图4面板(f));时期的饮食和药物是常数,分别分析了这两个不同时期。时期饮食和药物是常数,其中包括腹泻的第一集,表现出一个阶段的斜率为正,后跟一个阶段负斜率。此模式可以解释为显示方向改变后在社区构成扰动之后回到起始条件(58]。时期饮食和药物的不同并没有产生显著的回归;根据柯林斯et al。58),这个结果表明脉动社区组成随时间的变化。

3.5。Q-PCR分析粪便样本从一个家庭宠物狗经历反复急性腹泻

进一步探索宠物3从T-RFLP获得分析结果,我们进行了定量实时PCR用于T-RFLP相同的DNA样本。Q-PCR结果如图5面板(a) (f)。人口变化(PV)值高(范围:0.768 - -0.915)为所有生物化验。梭状芽胞杆菌组我和XIVa分别进行了分析;组我包含潜在的肠道病原体c . perfringens。(梭状芽孢杆菌是一个成员梭状芽胞杆菌习组和不会被这些化验。)两组都被Q-PCR整个采样周期。梭状芽胞杆菌组我水平相对稳定,除了增加880倍重合的第一集腹泻(61);的梭菌属的峰占总量的55%面积的样本electropherogram T-RFLP分析(图4(一)),声波测井我749年的峰值electropherogram下占总面积的40%(数据没有显示)。的声波测井我749年的峰值是包含在梭菌属的部分的条形图4(一)的预期声波测井我峰值的大小perfringens梭状芽胞杆菌大约是750个基点。一旦得到这个结果,我们执行一个特定的PCR检测perfringens梭状芽胞杆菌(45]。化验是负第一集前腹泻,它成为强烈积极的腹泻的样本(表3),并保持在大约三个星期的一个示例。4周后最后阳性样本,化验是负数,而且一直如此,直到第二集出现腹泻,当它再次成为强阳性。仍积极在第二个灭滴灵治疗,仍积极十二周后。

梭状芽胞杆菌集团XIVa水平更多的变量,不表现出任何模式对事件的腹泻。水平的大肠杆菌表现出天112年达到峰值,但也没有表现出任何模式对事件的腹泻。

水平的大肠都有效和粪大肠启动后均上涨灭滴灵治疗在发作的腹泻。大肠都有效上涨4000倍之间的第一集开始腹泻(61天)和天发病之间的77和77倍的第二集腹泻(168天),180天。粪大肠上涨7000倍之间的第一集开始腹泻(61天)和天发病之间的70和1500倍的第二集腹泻(168天),180天。

Q-PCR试验检测拟杆菌在所有样本。水平的拟杆菌种虫害最高在正常样本期间当饮食和药物是常数。拟杆菌种虫害减少大约倍期间和之后腹泻的第一集,但回到原来的水平。水平下降约倍在第二集腹泻和波动。这个结果在T-RFLP分析形成鲜明对比的是,很少发现拟杆菌水平electropherogram超过总面积的1%。

4所示。讨论

筛查特定病原体通过PCR显示,大多数动物携带一个或多个潜在的肠道病原体的粪便微生物群,即使他们没有临床症状。因此,很多情况下的“自发”腹泻警犬——推而广之,零星的腹泻在人类可能是由于生物已经存在在扰动后的消化道微生物群的一个环境因素而不是由病原体从另一个来源获得的(6,61年]。改变的假设有可能抑制或促进疾病进程的上下文中被调用慢性炎性肠道疾病;我们的结果支持这一观点,可能会有重要作用的微生物群在急性传染性疾病过程。其他临床和实验研究表明,积极的相对平衡和保护细菌物种改变在炎性疾病如克罗恩病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)和pouchitis。在回顾目前的工作在这一领域,这是假定过于激进的免疫反应的一个子集共生体(不致病的),肠道细菌遗传个体导致疾病(62年]。最近,弗兰克等人表明,CD患者,UC患者和noninflamed控制有显著不同的微生物群基于文化无关rRNA序列分析克隆库(63年]。因为它是基于结肠癌手术样本,本研究提供的调查gut-wall相关微生物群与炎症性肠病有关。在所有研究使用方法基于四rRNA,细菌“数字”被公认是相对估计反映基因拷贝数,而不是表明因果关系。然而,微生物群调查可以提供候选假设检验的因果关系。在我们的研究中,粪便样本可以认为最好的代表“诊断”样本,从一个主机呈现急性腹泻。是承认,需要进一步的工作文档的能力现成的粪便样本代表在结肠内的不同位置来记录这类腹泻的病因(64年]。

饮食和药物对肠道菌群的影响直接在动物和人类研究[17,18,21,29日,62年]。虽然它不是我们的目的来研究这种影响,我们的研究结果证实,肠道菌群的组成变化非常敏感等环境因素的改变饮食和/或药物以及接触其他动物的微生物群。相对一致的微生物群的研究蚁群狗在宠物1中观察波动形成鲜明对比的是,在农村环境中自由漫步。宠物2和3的微生物群,更严密的监督在户外时,显示变化比观察宠物1但研究殖民地多只狗。最后,宠物3的微生物群的波动变得更加明显,当改变饮食和药物治疗。

比较的结果从T-RFLP和Q-PCR宠物3的结果表明,两种方法可以检测的变化与事件相关的微生物群,如腹泻事件和改变饮食和药物治疗。广泛的变化在不同组的生物的丰度明显T-RFLP数据也明显Q-PCR结果个人组和生物;所有生物种群变异性(PV)值Q-PCR化验的高。这一结果并不令人惊讶的广泛目标DNA浓度检测到这个试验(检测到最低水平,ng的粪大肠;检测到的最高水平,ng的拟杆菌)。

T-RFLP分析表明,有了很大的提升梭菌属的,包括声波测井我749个基点峰由长岛et al。31日),61天,这一天的第一集开始腹泻。Q-PCR分析表明增加梭状芽胞杆菌组我,c . perfringens是一个成员,恰逢第一集出现的腹泻。诊断PCR检测c . perfringens显示,这种生物是暂时与两种发作的腹泻的发病有关。但由于样本之间的时间间隔运行长,我们不能确定是否增加梭状芽胞杆菌组我的检测c . perfringens反映事件的原因或结果腹泻。数据因此建议但不证明疾病是由成员造成的梭状芽胞杆菌组我,可能c . perfringens。然而,c . perfringens保持在可检测水平在不同时期的饮食和药物。这一结果表明,不稳定的微生物群落在此期间促成这种潜在的病原体的生长。

T-RFLP分析还表明大量增加Bacillales;其中包括乳酸杆菌、链球菌和enterococci;随后灭滴灵治疗。在Q-PCR分析中,两者兼而有之大肠都有效和粪大肠表现出重复启动后大幅增加灭滴灵治疗,第二集腹泻之后,大肠都有效没有回复的水平的研究。这些结果表明,针对两人的潜力大肠都有效和粪大肠在胃肠道产生不良的影响,使用甲硝哒唑作为一线治疗犬腹泻应该重新评估。

扰动的拟杆菌种虫害水平与腹泻的两集也明显相关;这些生物水平下降在发作的腹泻和成为不稳定期间的饮食和药物治疗是不同的。自拟杆菌种虫害是结肠微生物群落的主要组件和基本功能,这种波动可能会影响结肠健康。

这两种方法之间的差异,检测属拟杆菌在这个动物是最简单地解释为相对无能的普遍eubacterial 16 s引物用于绑定到特定的16 s rDNA序列拟杆菌种虫害心态占据主导地位的狗相比更具体的引物用于Q-PCR化验。然而,的成员细菌性的被T-RFLP分析中使用的引物检测四个五个研究群体的狗和宠物1和2。爆炸之间的同源性搜索表明,该地区长岛et al。31日)反向引物的16 s rDNA序列(1)一些但不是全部菌株拟杆菌eggerthii(2)一些但不是全部菌株b . stercoris,(3)一些但不是全部菌株b . caccae只包含七个基地的核苷酸11 19-base核苷酸17的底漆。这个有限的同源性甚至出现在16 s rDNA类型菌株的序列b . stercoris和b . caccae。没有PCR产品将获得这些菌株的DNA。同时,爆炸搜索表明,16 s引物用于Q-PCR研究[51)将放大rDNA菌株的这三个物种。然而,b . eggerthii stercoris,b . caccae存在于人类;在一个克隆库研究中,序列密切相关b . stercoris从狗了20.]。的拟杆菌种虫害序列从狗在后者的研究中,一个非常相似b . stercoris,三是相似的b . vulgatus和四个没有类似的出版拟杆菌种虫害用于分析。研究还表明,相同拟杆菌从人类的粪便微生物群落种虫害序列,狗,猫,和海鸥聚集在一起,分开那些牛和麋鹿。

我们应用提出的社区特征模式Marzorati et al。57]狗粪便细菌社区研究和相关他们我们知道狗的管理和临床表现。研究蚁群狗社区的特点是高丰富性和中间功能组织的“均衡”水平。因为环境的恒常性的这些狗,我们预测,他们的社区将经历低到中等动力学正常样本中所观察到的类似宠物3。宠物社区的1、2和4是通常具有较低的丰富性,平衡功能组织,和高水平的动态变化对于宠物1和2。

正常的宠物社区3之前,第一集后腹泻的特点是高的丰富性,中等水平的动态变化,和平衡功能的组织,而腹泻的样本的特征是低丰富,高水平的动态变化,低水平的功能性组织。社区在正常样本后腹泻的特点是持续的第二集丰富低,波动水平的动态变化,比之前的正常和低水平的功能性组织样本。动态变化的波动水平暂时与改变饮食和药物治疗。时滞分析表明,样本在饮食和药物治疗了常数初始样本,样本在腹泻的第一集,第二集前样本diarrhea-showed扰动的一种可识别模式之后,返回到初始条件。样本在饮食和药物varied-beginning第二集腹泻的发病和继续的研究并没有表现出任何方向的改变,而是显示随机波动。这些互补分析表明,概念之间的通用协议从macroecology从微生物群落在解释数据会有用的。

根据Marzorati et al。57),社区丰富的参数Rr表明环境的承载能力;饮食是一个明显的环境变量,可能会影响胃肠道的承载能力。相似的价值观Rr获得了研究蚁群狗吃、住条件受控条件下支持这个想法。然而,宠物2基因相关研究蚁群狗和美联储类似的饮食,但表现出较低的社区丰富。这散放狗可能有一个可变进气多研究蚁群狗,所以值明显的承载能力可能是高度动态特性的影响这种动物的微生物群落。类似的效果可以看到丰富的宠物3参数值;Rr千差万别的后续扰动和时间的动态变化在社区由于腹泻。

动态变化的水平在相当程度上也多种多样的宠物1,2,4,是与环境因素相关的宠物1和2经历了更多的环境变化和持续较高水平的社区组成的变化比宠物3健康的时期。社区组织功能参数佛由Marzorati et al。57)反映社区结构的抗扰动。如果佛值预测社区弹性,那么这样的弹性可能解释为什么这两个宠物1和宠物2,相对强劲佛值,主要是non-diarrheic尽管拥有高水平的动态变化并大大改变社会的组成部分。在宠物的情况下1,后者的现象可能是由于不同摄入的物质环境;在宠物的情况下2,一只小狗,这些现象可能是由于胃肠道的发育成熟过程。此外,腹泻在宠物3第二集后,佛值下降和社区似乎变得不那么稳定的影响下改变饮食和药物政权;这个观察进一步支持功能组织和弹性之间的关系。

要求有大量的样本研究证实这些明显的相关性在一个严格的方式。同时,显然需要更多的工作描述健康的肠道微生物群的变化之前详细的疾病的研究。然而,根据这些观察,我们将预测,如果正常或背景差异是很大的,它可能极难检测有关异质种群的变化,如个人参加临床试验。

5。结论

我们推测,狗有一个稳定的结肠微生物群落的组成和发作的腹泻导致持久的社区组成和/或功能的变化;此外,治疗特定的病原体可以复合这些影响。远单胃的动物,像狗可以作为很容易可以操作的模型来解决人类消化道的方法问题。因此,研究了微生物群的狗在腹泻的情节和相比健康控制狗做出初步评估微生物群的成员贡献的急性腹泻病的过程。我们发现(1)四个五个狗生活在一个环境将提供至少接触因素可能会改变胃肠道微生物群有类似的微生物群,(2)微生物群的狗关在更多相应变量环境变量,(3)急性发作的腹泻导致大规模的改变胃肠道微生物群,和(4)当狗的饮食和药物之前有一个稳定的微生物群反复改变,胃肠道微生物群也改变了多次,最终减少丰富性。我们遇到的高水平的变异宠物狗表明描述性的以人群为基础的微生物群的研究可能是内充满了变化和个人之间有意义的模式和变化可能难以区分“噪音。“要么纵向研究的个体相对稳定的环境下政权(宠物3)或基于模型的研究团体的个人在严格控制的环境中(与计划研究蚁群狗)实验干预可以预期收益率可判断的结果。微生物群落的一致性研究蚁群狗和宠物3中我们能够观察到的变化表明,可以建立基线起始条件,在这些研究中使用的方法可以用来检测和描绘粪便微生物群落的变化。我们预计这些考虑来自这个有用的动物模型研究人类同等的作用。

确认

我们感谢同伴动物密歇根州立大学兽医学院的基金资助这个项目。我们感谢莎拉Apodaca约翰·Fyfe卡尔·汉诺威,密歇根州立大学的两个客户VTH,特别是莎莉劳埃德,提供样品和狗参加这项研究的信息。我们感谢Drs。瓦莱丽•查德威克朱莉Schildt,为他们的专业知识和约翰Fyfe在这些研究狗的身体检查。我们感谢Drs。马赫迪赛义德、撒迪厄斯斯坦顿和文斯年轻的礼物基因组dna为PCR阳性控制化验使用。

引用

1. n . m . Thielman和r . l . Guerrant“急性感染性腹泻,”《新英格兰医学杂志》上,卷350,不。1,38-47,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. n . j .亚莎·m·h·威尔科克斯,“实验室诊断perfringens梭状芽胞杆菌antibiotic-associated腹泻。”医学微生物学杂志》,51卷,不。10日,891 - 894年,2002页。视图:谷歌学术搜索
3. a . l . Struble y . j .唐·h·卡斯p h . Gumerlock b . r . Madewell和j·席尔瓦Jr .)“粪便脱落艰难梭状芽胞杆菌狗:一段时间流行在兽医教学医院调查,“《兽医诊断调查》第六卷,没有。3、342 - 347年,1994页。视图:谷歌学术搜索
4. a . a . Adesiyun m·坎贝尔和j·s . Kaminjolo”普遍存在的细菌enteropathogens宠物狗在特立尼达,”Zentralblatt毛皮Veterinarmedizin B,44卷,不。1,19-27,1997页。视图:谷歌学术搜索
5. d·林惇,r·j·欧文和j·斯坦利,“快速PCR鉴定属弯曲杆菌和五个弯曲杆菌人与动物物种致肠病的,”微生物学研究,卷147,不。9日,第718 - 707页,1996年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. l . Beutin。”大肠杆菌病原体在狗和猫。”兽医研究,30卷,不。2 - 3、285 - 298年,1999页。视图:谷歌学术搜索
7. t .古河道,k . Furumoto m . Fujieda和e·冈田克也”,通过PCR检测Tyzzer疾病的有机体(梭状芽胞杆菌piliforme)的粪便。”实验动物,51卷,不。5,513 - 516年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. g·e·杜哈梅,“比较病理病机的自然和实验诱导结肠螺旋体病,”动物卫生研究评论,卷2,不。1,3 - 17,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. j·e·柯林斯m . e . Bergeland c·j·林德曼和j·r·Duimstra“肠球菌(链球菌)杜兰依从性小肠的腹泻的小狗,”兽医病理学,25卷,不。5,396 - 398年,1988页。视图:谷歌学术搜索
10. n三泽,k .川岛,f .近藤e . Kushima k . Kushima和p .这里消费”隔离和表征弯曲杆菌,幽门螺杆菌,Anaerobiospirillum与腹泻带血菌株从一只小狗,”兽医微生物学,卷87,不。4、353 - 364年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. g .罗西·m·罗西·c·g·维塔利et al .,“传统的小猎犬狗模型急性和慢性感染幽门螺杆菌”,感染和免疫,卷67,不。6,3112 - 3120年,1999页。视图:谷歌学术搜索
12. j·g·福克斯”,属的扩张幽门螺杆菌:致病性和人畜共患的潜力。”研讨会在胃肠道疾病,8卷,不。3、124 - 141年,1997页。视图:谷歌学术搜索
13. m . Rinkinen k . Jalava e . Westermarck s Salminen和a·c·Ouwehand益生菌乳酸菌和犬肠道病原体相互作用:肠道的一个危险因素肠球菌都有效殖民?”兽医微生物学,卷92,不。1 - 2、111 - 119年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. s . l .标志、e·j·凯丝·h·卡斯和a·c·梅里”基因型和表型鉴定perfringens梭状芽胞杆菌和艰难梭状芽胞杆菌在腹泻的和健康的狗,”兽医内科杂志》上,16卷,不。5,533 - 540年,2002页。视图:谷歌学术搜索
15. w . Vahjen和k的方式,“益生菌的影响肠球菌都有效产品在饮食健康的狗细菌学的项沙门氏菌spp。弯曲杆菌种虫害和梭状芽胞杆菌种虫害的粪便。”档案毛皮Tierernahrung卷,57号3、229 - 233年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. d·卡雷t·库顿r . deply m . Guisset和j·m·Debonne“急性感染性腹泻:目前的治疗和观点”,医学院学习硕士,卷61,不。6,521 - 528年,2001页。视图:谷歌学术搜索
17. h·l . Greetham c . Giffard r . a . Hutson m·d·柯林斯和g·r·吉布森“细菌学的拉布拉多狗的肠道:文化和基因型的方法,”应用微生物学杂志,卷93,不。4、640 - 646年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. j . s . Suchodolski j .卡马乔和j·m·施泰纳”的细菌多样性分析犬十二指肠、空肠、回肠、结肠和比较16 s rRNA基因分析,“《微生物生态学,卷66,不。3、567 - 578年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. x, s . p . Heazlewood d·o·克劳斯和t·h·j .弗罗林“微生物物种的分子表征人类殖民回肠和结肠黏膜用16 s rDNA序列分析,“应用微生物学杂志,卷95,不。3、508 - 520年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. l·k·迪克a·e·伯纳德·t·j·Brodeur et al .,“主机分布无教养的粪便细菌性的粪便来源识别细菌揭示遗传标记,”应用与环境微生物学,卷71,不。6,3184 - 3191年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. k . s . Swanson c . m . Grieshop e·a·弗里金格et al .,“Fructooligosaccharides和嗜酸乳杆菌改变肠道微生物种群,总束养分消化率和粪便蛋白质分解代谢物浓度在健康成年狗,”营养学杂志》,卷132,不。12日,第3731 - 3721页,2002年。视图:谷歌学术搜索
22. r·e·雷·c·a . Lozupone m . Hamady r·奈特和j·戈登,“世界在世界:脊椎动物肠道微生物群的进化,”自然评论微生物学》第六卷,没有。10日,776 - 788年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. r·e·雷·m·Hamady c Lozupone et al .,“哺乳动物的进化及其肠道微生物,”科学,卷320,不。5883年,第1651 - 1647页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. 诉j·麦克拉肯和r·g·洛伦兹”胃肠生态系统:一个不稳定的联盟在上皮细胞中,免疫和微生物群,”细胞微生物学,3卷,不。1、1 - 11,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. w·e·c·摩尔和l . v . Holdeman“人类粪便菌群:20 Japanese-Hawaiians的正常菌群,”应用微生物学杂志,27卷,不。5,961 - 979年,1974页。视图:谷歌学术搜索
26. p·b·Eckburg e . m . Bik c·n·伯恩斯坦et al .,“人类肠道微生物菌群的多样性,”科学,卷308,不。5728年,第1638 - 1635页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. e . Furrie“革命分子在肠道微生物区系的研究,“肠道,55卷,不。2、141 - 143年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. r·d·伯格“土著胃肠道微生物区系,”微生物学的趋势,4卷,不。11日,第435 - 430页,1996年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. j·m·辛普森b·马提瑙w·e·琼斯,j . m . Ballam和r·麦基,“狗的粪便细菌种群的特征:年龄、品种和膳食纤维,”微生物生态学,44卷,不。2、186 - 197年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. d·s·尼尔森,p . l . Møller诉Rosenfeldt, a . Pærregaard k . f . Michaelsen和m .雅各布森”mucosa-associated分配的案例研究双歧杆菌属物种,乳酸菌物种,和其他人类结肠中乳酸细菌,”应用与环境微生物学,卷69,不。12日,第7548 - 7545页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. Nagashima k, t . Hisada m .佐藤,j . Mochizuki”应用程序的新primer-enzyme组合末端限制性片段长度多态性分析人类排泄物的细菌种类”应用与环境微生物学,卷69,不。2、1251 - 1262年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. m . f . Polz和c·m·瓦诺“偏见在multitemplate PCR template-to-product比率,”应用与环境微生物学,卷64,不。10日,3724 - 3730年,1998页。视图:谷歌学术搜索
33. a . Schmalenberger f . Schwieger, c . c . Tebbe”的影响引物组合对不同进化保守的地区small-subunit核糖体rna基因pcr微生物群落分析和遗传分析,“应用与环境微生物学,卷67,不。8,3557 - 3563年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. j。j Engebretson和c·l·梅奥,”富达的决定由terminal-restriction微生物多样性选择限制性内切酶片段长度多态性,”应用与环境微生物学,卷69,不。8,4823 - 4829年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. y Hongoh, h . Yuzawa m . Ohkuma, t .奖赏”评价引物PCR条件16 s rRNA基因的分析从自然环境,”《微生物学字母,卷221,不。2、299 - 304年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. j·s·Weese h·r·Staempfli生存和j·f·普雷斯科特。艰难梭状芽胞杆菌在马粪便及其毒素:对诊断测试选择和解释,“《兽医诊断调查,12卷,不。4、332 - 336年,2000页。视图:谷歌学术搜索
37. 后美国j .奥特m . Musfeldt k . n .蒂米斯,j . Hampe d·f·Wenderoth和s .施赖伯”体外改变肠道细菌的微生物群在粪便样本存储,”诊断微生物学和传染病,50卷,不。4、237 - 245年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. s . j .据库恩,g . Mbazima p . Colque-Navarro和r . Mollby可行性和组成的变化大肠杆菌植物在粪便样本期间长时间存储,”《微生物方法,卷63,不。3、229 - 238年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. n . Klijn a . h . Weerkamp和w·m·德沃斯”的遗传标记Lactococcus lactis显示了其生存在人类胃肠道。”应用与环境微生物学,卷61,不。7,2771 - 2774年,1995页。视图:谷歌学术搜索
40. j·h·a . Apajalahti l . k . Sarkilahti b . r . e . Maki j . p .嘉尼•海基宁p h . Nurminen和w·e·Holben”有效复苏的细菌DNA和percent-guanine-plus-cytosine-based群落结构分析胃肠道的肉鸡,”应用与环境微生物学,卷64,不。10日,4084 - 4088年,1998页。视图:谷歌学术搜索
41. j .龚r·j·福斯特h . Yu et al .,”细菌的多样性和系统发育分析鸡盲肠粘膜和盲肠的腔与细菌相比,“《微生物学字母,卷208,不。1、1 - 7,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. s . Peuranen k . Tiihonen j . Apajalahti a . Kettunen m . Saarinen和n . Rautonen“葡聚糖和乳糖醇的组合影响微生物生态系统和免疫反应在大鼠胃肠道,”英国营养学杂志》上的,卷91,不。6,905 - 914年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. j . Dicksved j . Halfvarson m . Rosenquist et al .,“同卵双胞胎的肠道微生物群的分子分析克罗恩氏病,”ISME杂志,卷2,不。7,716 - 727年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. t . g . Egwang说和j·o·d·Slocombe”评估Cornell-Wisconsin离心浮选技术恢复trichostrongylid鸡蛋从牛的粪便,”加拿大比较医学杂志》上,46卷,不。2、133 - 137年,1982页。视图:谷歌学术搜索
45. 菊池、y宫本茂,s . Narushima k .伊藤,“种特异性引物的设计来确定13种梭状芽胞杆菌存在在人类肠道。”微生物学和免疫学,46卷,不。5,353 - 358年,2002页。视图:谷歌学术搜索
46. c·r·杰克逊,p . j . Fedorka-Cray和j·b·巴雷特”使用属和种专一性复合PCR鉴定enterococci,”临床微生物学杂志,42卷,不。8,3558 - 3565年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. f . k . s . Cheng McCleskey, m . j .行走et al .,”标识的PCR检测肠球菌都有效”,临床微生物学杂志,35卷,不。5,1248 - 1250年,1997页。视图:谷歌学术搜索
48. 冯y, z沈和j·g·福克斯肝肠的识别幽门螺杆菌限制片段长度多态性分析物种的16 s rRNA基因,”幽门螺杆菌,5卷,不。3、121 - 128年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
49. 老r·o·g·e·杜哈梅,m . r . Mathiesen e·d·埃里克森c . j . Gebhart和r·d·Oberst“多重聚合酶链反应的同时检测Lawsonia intracellularis, Serpulina hyodysen teriae,并在猪肠道Salmonellae标本,”《兽医诊断调查,9卷,不。3、281 - 286年,1997页。视图:谷歌学术搜索
50. w . Kraatz,浙、b·佩特森和c . Fellstrom“人类肠道螺旋体病诊断为结肠镜检查和分析部分16 s rDNA螺旋体,序列”动物卫生研究评论,卷2,不。1,第116 - 111页,2001。视图:谷歌学术搜索
51. t . Rinttila a . Kassinen e . Malinen l . Krogius和a . Palva”发展一套更广泛的16 s rDNA-targeted引物对粪便样品中细菌致病性和土著的量化实时PCR,”应用微生物学杂志,卷97,不。6,1166 - 1177年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
52. 美国h·汗诉甘农,r·肯特et al .,“发展的快速定量PCR试验可栽培的和non-culturable的直接检测和量化大肠杆菌从农业水域。”《微生物方法,卷69,不。3、480 - 488年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
53. o . Firmesse s Rabot l . g . Bermudez-Humaran g . Corthier和j。Furet,”卡门培尔奶酪食用奶酪会刺激共生体enterococci在健康人体肠道微生物群,”《微生物学字母,卷276,不。2、189 - 192年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
54. p . j . d . Lambshead c·j·布朗,t·j·费列罗·l·e·霍金斯c·r·史密斯和n·j·米切尔,”生物多样性的线虫组合Clarion-Clipperton断裂带区域,一个区域的商业挖掘兴趣,”BMC生态学,3卷,第1条,1 - 12,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
55. p . m .佩兰j·r·马丁·s·j·巴伦,j . r .罗氏,“爱尔兰原生林地分类的聚类分析方法,”生物学和环境,卷106,不。3、261 - 275年,2006页。视图:谷歌学术搜索
56. 韦特,统计生态学在实践中2000年英国培生教育,哈洛。
57. m . Marzorati l . Wittebolle:恩,d . Daffonchio w•韦斯特拉特,“如何获取更多的分子指纹:微生物生态学的实用工具,”环境微生物学,10卷,不。6,1571 - 1581年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
58. f . Micheli s·l·柯林斯,l·西蒙”方法来确定利率变化和模式在生态社区,”Oikos,卷91,不。2、285 - 293年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
59. f·m·奥苏贝尔r·布伦特和r·e·金斯顿当前的分子生物学技术约翰•威利& Sons,卷1,霍博肯,新泽西,美国,1997年。
60. j·p·希斯,“排错:量化人口颞可变性丰度(Oikos (2006) 115 (573 - 581)),“Oikos,卷116,不。3,p。540年,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
61. m·罗西·m·l·Hanninen j . Revez m . Hannula和r . g . Zanoni发生和物种的诊断水平弯曲杆菌spp,肠幽门螺杆菌种虫害和Anaerobiospirillum种虫害在健康和腹泻的狗和猫”,兽医微生物学,卷129,不。3 - 4、304 - 314年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
62. r . b .裁缝”,治疗肠道微生物区系的操纵和炎症性肠病:抗生素、益生菌、益生元,“胃肠病学,卷126,不。6,1620 - 1633年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
63. d . n .弗兰克·a·l·圣·阿曼达,r·a·费尔德曼·e·c . Boedeker n . Harpaz和n . r .速度,“Molecular-phylogenetic表征微生物群落失衡在人类炎性肠道疾病,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷104,不。34岁,13780 - 13785年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
64. a . Swidsinski j·韦伯、诉Loening-Baucke l·p·黑尔和h .湖泊,“空间组织和粘膜菌群的组成与炎症性肠病病人,”临床微生物学杂志,43卷,不。7,3380 - 3389年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2008朱莉娅·a·贝尔等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。