库蚊(双翅目蚊科)蚊子Jazan地区,沙特阿拉伯和其分子识别

文摘

形态特征的金标准方法来识别蚊子。然而,形态学鉴定有许多局限性包括缺乏专业知识和破坏性的外部角色标本处理不当所致。因此,我们用聚合酶链反应技术(PCR)作为一个集成的工具来识别库蚊蚊子建立更精确和可靠的识别系统在Jazan地区与其空间分布相关。我们确定了库蚊蚊子种和亚种使用分类键,然后我们用聚合酶链反应技术(PCR)作为一个集成的工具确认和细化的列表库蚊在该地区的蚊子。确定物种系统发育树构建,及其独特的聚类与参考的物种基因库。我们确定了7026只成年库蚊蚊子属于4种。库蚊tritaeniorhynchus是主要的物种(45%),其次是吗残雪。quinquefasciatus(32%)库蚊sitiens(20%)和残雪。侵害(3%)。最出没的区域库蚊在该地区Gizan Sabya。在识别四个PCR达到100%成功库蚊蚊子的物种。我们也报告的分子识别残雪。quinquefasciatus和残雪。侵害物种首次Jazan地区的分子识别残雪。tritaeniorhynchus和残雪。sitiens首次被报道在Jazan地区和整个沙特阿拉伯。本研究首次利用PCR鉴定库蚊在Jazan地区的蚊子。PCR是一种互补和集成taxonomy-based蚊子的识别工具。这种集成的能力,促进和加强向量监测和控制程序,以及定义在该地区物种的遗传多样性。

1。介绍

蚊子传播的疾病,即。、疟疾(1,2],丝虫病[3],裂谷热[4,5),西尼罗河病毒(6),登革热等(7,8在沙特阿拉伯),造成潜在的公共卫生威胁。

一些作者研究蚊子的分布在沙特阿拉伯1- - - - - -16]。

大多数这些研究报告的优势库蚊蚊子在其他物种。在库蚊这些研究报告的物种,这种致倦库蚊,库蚊tritaeniorhynchus,残雪。侵害是最主要的库蚊在沙特阿拉伯和Jazan地区的蚊子。

蚊子动物的丰度和分布受到许多因素的影响,包括但不限于主机可用性、气候条件,特别是降雨和温度、人类活动和活动,和土地覆盖17]。这些因素对蚊子的矢量能力潜在影响疾病传播。

蚊子物种的准确识别和知识的生物学、生态学、和地理分布是重要因素的监测和控制向量和蚊媒疾病18]。

形态学鉴定是黄金标准和常规方法确定蚊子根据其外部特征(19]。

然而,形态非常耗时,需要经验丰富的分类识别。此外,处理不当标本损伤经常发生一些重要特征如刷毛和鳞片导致不完整的识别。此外,共享形态学特征的相似物种复合物的成员使基于分类识别键仅一项艰巨的任务(20.]。

聚合酶链反应(PCR)正在成为一种流行的蚊子识别基于他们的DNA测序技术,每个物种都有自己的遗传同一性(19]。

分子技术来区分残雪。侵害复杂或/和其他库蚊物种,或来区分残雪。侵害复杂的生物型,是基于凝胶电泳分析特定DNA片段扩增的PCR (21]。PCR分析识别残雪。侵害,残雪。quinquefasciatus,他们的混合动力车基于乙酰胆碱酯酶基因的核苷酸序列的差异Ace.2 [22]。

本研究的目的是确定动物的成年人库蚊蚊子(双翅目蚊科)和生产精确和完善记录他们的物种及其分布Jazan地区基于形态学和基因(分子)的识别。我们所知,这是第一个研究Jazan地区使用分子特征识别库蚊物种和遗传多样性。

2。材料和方法

2.1。研究区域

Jazan面积是约22000公里²160万人口,位于16 -12°和-25°之间,纬度北部,位于亚热带,沙特阿拉伯的西南部,沿着红海海岸边界250公里和120公里的边界也门共和国(图1)。这个地区包括超过3000个村庄分散的区域,约100个岛屿位于红海,包括Farasan岛屿。它周围是红海来自西方的阿拉伯也门共和国从南部和东部和阿西尔地区从北方([23];GASTAT 2017:https://www.stats.gov.sa/en/5655)。

2.2。蚊子集合

CDC微型光阱被用于成年蚊子的Jazan收集来自不同地区的地区从2018年2月到2019年12月(表1)。十光阱每月一次安装在每个房子,动物的避难所,野生植被,绿洲附近的污水处理厂,水坝,和池塘从1800年到0600年人力资源。

户外集合,2公斤块干冰(二氧化碳)被包裹在一个麻袋在陷阱。的死亡率降到最低收集到的蚊子由于干燥,潮湿的棉花垫在收集杯子。收集蚊子的饲养的昆虫被带到沙特Gizan疾病预防控制中心城市形态和基因识别。

2.3。蚊子形态学鉴定

女库蚊pipens和这种致倦库蚊蚊子被使用翼形态识别和区分测量十字路口的科斯塔subcosta,分岔R2 + 3脉,因为所描述的一些分类图示键(24- - - - - -26]。

的女性库蚊tritaeniorhynchus和库蚊sitiens、相关图示键使用(24,27,28]。

2.4。分子识别库蚊物种

之前确认库蚊蚊子的个别物种的形态学方法选择根据他们的位置。

从存储使用GeneJET匀浆提取的DNA基因组DNA净化设备(热科学)遵循制造商的建议:对于每一个单独的蚊子,腿在研钵和研杵均质(迷你硼硅玻璃长度60 mm /杵直径9.0毫米,3.0毫升,Fisherbrand)在150年μL消化解决方案然后匀浆管被转移到1.5。20毫升的蛋白酶K的解决方案是添加和混合彻底由涡流获得统一的悬架和孵化的热瓶30分钟56°C, 1300 rpm。20毫升的核糖核酸酶解决方案添加和混合的涡流和孵化在室温下10分钟,然后200年μL彻底消散的解决方案是添加和混合的涡流15年代,直到混合均匀。后增加400μL 50%的乙醇和混合的涡流准备的溶解产物被转移到一家GeneJET基因组DNA纯化柱插入集合管和离心1分钟8000 rpm。GeneJET基因组DNA纯化列放置到一个新的2毫升收集管和500μL缓冲洗1添加和离心机在8000 RPM 1分钟,然后列被置于一个新的集合管和500年μL缓冲洗2添加和离心机在13000转3分钟。DNA纯化柱被转移到无菌1.5毫升微型离心机管,和200年μL(洗脱缓冲被添加到列膜洗提基因组DNA的中心。孵化为2分钟在室温和离心机1分钟8000 rpm。

的分子识别库蚊物种是由聚合酶链反应技术(PCR)下面描述过程和使用提供的引物(表2)(22,29日]。

PCR进行总量的50μL使用梦想标记绿色的主人混合包含25(热科学)μL掌握混合准备使用,1μL (10 pmol)的反向和物种特异性引物,5μL的DNA模板,18岁μL nuclease-free水。受到初始混合变性在94°C 3分钟,30周期的变性(94°C, 60年代),引物退火(51°C),底漆扩展(72°C, 60年代),和最终扩展5分钟。在每次运行,包括正面和负面的控制。PCR产物扩增分析凝胶电泳(琼脂糖1.5 Tris-Acetate EDTA缓冲区)和溴化乙锭染色。Doc XR可视化进行了使用凝胶成像系统(Bio-Rad)。

通用引物(30.),LCO1490和HCO2198(表2),用于710 - bp的PCR扩增片段的线粒体细胞色素氧化酶亚基(COI)基因样本不确定的种特异性引物前PCR过程遵循相同的。

2.5。测序

净化和标准对PCR测序产品由Macrogen公司(首尔,韩国)。测序反应进行的ABI棱镜®3730 xl分析仪(96毛细管型)使用ABI棱镜®BigDyeTM终结者循环测序工具与AmpliTaq®DNA聚合酶酶(FS)(应用生物系统公司),协议后,由制造商提供的。单次的排序进行每个模板使用LCO1490底漆。凝胶使用MG凝胶萃取洗脱了SV (MD007)工具包(mgm),协议后,由制造商提供的。

序列是通过基本的局部比对搜索序列相似性搜索工具(爆炸)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)[31日),而参考序列库蚊物种中发现爆炸,从基因库(下载http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。

进化类群关系树构建的库蚊使用分子进化物种遗传分析(大型5软件)。

3所示。结果与讨论

识别和计数的结果库蚊物种蚊子如表所示1。七千零二十六年成人库蚊蚊子收集来自25个不同地区Jazan地区在2018年和2019年(图1)。

显然,蚊子标本的数量相对较低的时期相比,研究(大约两年)。这是可能归因于这样一个事实:有效和广泛的媒介控制活动都发生在过去5年在该地区抗击疟疾、登革热、裂谷,该地区最普遍的媒介传播疾病。

在这项研究中,四个库蚊在该地区的物种存在,即;库蚊tritaeniorhynchus,残雪。quinquefasciatus,残雪。sitiens,残雪。侵害。各自的比例出现了45%,32%,20%,3%。

库蚊tritaeniorhynchus是最丰富的物种在23个地区遇到的25日,紧随其后的是吗残雪。quinquefasciatus和残雪。sitiens发生在14区,残雪。侵害在4个地区。

这些结果符合艾尔·艾哈迈德的发现等。15)表明,库蚊tritaeniorhynchus是一种常见的广泛的物种在沙特阿拉伯已经从Jazan记录和其他14个省15。类似的结果也报道了Alsheikh et al。32),发现残雪。tritaeniorhynchus是最主要的物种在红海海岸平原Jazan地区,紧随其后残雪。quinquefasciatus。研究结果也符合的Ahmad et Al al.and•克尔et Al。14,334)报告相同库蚊物种从Jazan地区。库蚊tritaeniorhynchus,残雪。quinquefasciatus,残雪。sitiens从Jazan的不同部分地区也已报道的优势库蚊tritaeniorhynchus相对于其他库蚊物种(34]。

在目前的研究中,最出没的区域库蚊蚊子在Jazan地区Gizan(2160标本),Sabya (1267), Baish(753),和Aboareesh(429)(表1)。这可能是由于这些地区的性质,这是高度密集的和相对平坦,允许小死水集合形成的降雨和/或水管泄漏后他们的城市35]。的患病率库蚊物种在这些地区也可能是由于其广泛的适用性不同繁殖地点和极端气候因素的变量(11]。

的三个库蚊物种在本研究报告被认为是重要的疾病向量,即库蚊tritaeniorhynchus,残雪。quinquefasciatus,残雪。侵害。

占主导地位的蚊子向量的特征包括适应各种气候条件和栖息地,高anthropophilic倾向,成人休息行为变量(36]。

蚊子动物及其分布在沙特阿拉伯已经被许多作者广泛调查。例如,49蚊子七属从1956年到2017年(18按蚊和31库蚊的)已经上市(37]。

31岁的库蚊的,属于属19种库蚊林奈(1758):一个物种在亚属Barraudius爱德华兹,1921年,残雪。(Barraudius)pusillus;一个物种在亚属Culiciomyia西奥博尔德1907残雪。(Culiciomyia) nebulosus;一个物种在亚属Oculeomyia西奥博尔德1907残雪。(Oculeomyia) bitaeniorhynchus;两个物种在亚属Maillotia西奥博尔德1907残雪。(Maillotia) arbieeni和残雪。(Maillotia) salisburiensis;和14个物种在亚属库蚊林奈,1758:残雪。(库蚊)decens,残雪。(库蚊)duttoni,残雪。(库蚊)laticinctus,残雪。(库蚊)mattinglyi,残雪。(库蚊)mimeticus,残雪。(库蚊)perexiguus,残雪。(库蚊)侵害,残雪。这种致倦库蚊),残雪。(库蚊)simpsoni,残雪。 (Culex) sinaiticus, Cx. (Culex) sitiens, Cx. (Culex) theileri, Cx. (Culex) tritaeniorhynchus,和残雪。(库蚊)univittatus。

同样,7种库蚊Jazan地区也被发现:(1)尖音库蚊阿哈德来自Alariddah Gizan市、Baish Almasarha, Samtah, Eldarab, Haroob,巴尼Malik Farasan群岛;(2)这种致倦库蚊阿哈德来自Alariddah Gizan市、Baish Almasarha Farasan群岛;(3)库蚊tritaeniorhynchus阿哈德来自Alariddah Gizan市、Baish almasarha, Samtah, Eldarab, Haroob,巴尼Malik;(4)库蚊sitiens阿哈德来自Alariddah Gizan市、Baish almasarha, Samtah, Wadi Jazan, Farasan群岛;(5)残雪。西奈抄本道义;(6)残雪。decens;(7)残雪。bitaeniorhynchus(33]。

另一方面,另一个已确定10种Jazan地区包括不同区域残雪。tritaeniorhynchus,残雪。laticinctus,残雪。侵害,残雪。quinquefasciatus,残雪。西奈抄本道义,残雪。simpsoni,残雪。torrentium,残雪。sitiens,残雪。univittatus,残雪。tigripes(14]。

同样,七个物种记录Jazan地区包括从不同的地方库蚊tritaeniorhynchus,残雪。quinquefasciatus,残雪。西奈抄本道义,残雪。sitiens,库蚊duttoni,残雪。Arbieeni,残雪。mimeticus(34]。

残雪。(库蚊)perexiguus西奥博尔德,1903年残雪。pusillus(Macquart)从该地区已报告24,38]。

因此,18库蚊物种从Jazan地区迄今为止已报告,即:库蚊tritaeniorhynchus,残雪。laticinctus,残雪。侵害,残雪。quinquefasciatus,残雪。西奈抄本道义,残雪。univittatus,残雪。(库蚊)perexiguus,残雪。pusillus,残雪。simpsoni,残雪。torrentium,残雪。sitiens,残雪。decens,残雪。bitaeniorhynchus,残雪。theileri,残雪。tigripes,残雪。duttoni,残雪。arbieeni,和残雪。mimeticus(37]。

库蚊西尼罗河病毒的蚊子被证明或怀疑向量,和裂谷热病毒,微丝蚴,各种脑炎(39,40]。

它一直说残雪。quinquefasciatus发生更多的阿拉伯半岛南部的孤立发生的残雪。侵害在西南山区(41]。

由于密切的相似之处残雪。侵害和残雪。quinquefasciatus,他们的许多事件和沙特阿拉伯的形态识别问题,特别是女性(37]。

相当大的差异的幼虫和成虫阶段中表现出两个物种之间的形态,很难区分他们。此外,研究人员使用库蚊在沙特阿拉伯有很少,如果没有,使用男性生殖器诊断功能确认身份的两个物种37]。

这是为什么我们采用分子技术,这是非常具体的和敏感的识别库蚊种类复杂,他们的混合动力车42,43]。此外,基因组的新方法(分子)的识别物种亚种,种族、生物型,形式更加可靠和精确的物种比年长的形态学鉴定方法复合物(44]。

3.1。这种致倦库蚊(图2)

幼虫的残雪。quinquefasciatus品种与高度的水体有机污染和接近人类的栖息地。女性是夜行动物,进入房屋和咬人优先于其他哺乳动物(45]。

残雪。quinquefasciatus被发现全年繁殖高峰在冬季的塔伊夫,沙特阿拉伯的吉达,武装力量(46]。Jazan地区,这个物种收集从岩石坑和流。它被发现在一起按蚊arabiensis和残雪。tritaeniorhynchus的比例在1:4:1:3 (34]。

的物种是一个主向量班氏丝虫向量禽疟,西方马脑脊髓炎,圣路易斯脑炎。它也受到牵连,一个向量的狗犬恶丝虫(45,47]。

残雪。quinquefasciatus和残雪。侵害,bancroftian丝虫病的主要载体,班氏丝虫全球包括中东国家,已报告从沙特阿拉伯的西南地区(6]。

3.2。尖音库蚊(图3)

幼虫的尖音库蚊各地方品种从高度污染的污水和污糟地方清理池和容器。品种在死水在阴影或无遮蔽的栖息地。雌性咬人的户外和室内41]。

残雪。侵害幼虫被报道一年到头都在塔伊夫,吉达,武装力量。高峰是在秋天当高密度在夏天时温度高(46]。

残雪。侵害是一个主向量的周期性Bancroftian丝虫病。它自然感染西尼罗河病毒和辛德毕斯在以色列,而感染裂谷热的病毒和西尼罗河病毒在埃及(41]。

w .丝虫已被确定在外国工人在Abha五个东南亚国家,西南的沙特阿拉伯。残雪。侵害可以作为一个潜在的向量的Bancroftian丝虫病在沙特阿拉伯48]。

尖音库蚊复杂的发生在不同的气候和生境区,尤其是世界温带和temperate-humid地区(44]。

总是困难和问题区分成年人之间的形态残雪。quinquefasciatus和尖音库蚊尤其是女性。尽管如此,分类学家用来区分两个物种翼脉络的十字路口前静脉subcosta科斯塔是分叉的R_{1 + 2}在的情况下残雪。quinquefasciatus(图2这个十字路口),而达到或超越的分叉R_{1 + 2}在的情况下残雪。侵害(图3)[24]。然而,这是很容易通过分子特征。

分子识别的残雪。侵害(数据4和5),残雪。quinquefasciatus(数据6和7)证实了他们的初始形态识别。系统发育树构建残雪。侵害和残雪。quinquefasciatus,和他们的独特的聚类与参考的物种基因库如图5和7。值得提及的是分子的特点残雪。侵害相比与基因库的记录显示其相似性的埃及、肯尼亚(100%)和非常接近的伊朗(99.85%)(表3)。而分子识别显示一个物种残雪。quinquefasciatus类似于土耳其物种(100%),和一个亚种残雪。这种致倦侵害(问引物500个基点)类似于斯里兰卡亚种(100%)(表3)。

沙特阿拉伯的Baljurashi省,分子识别的结果残雪。侵害利用PCR技术显示残雪。侵害cf-3应变后的准确定义初始形态识别的物种49]。同样,分子的特点残雪。quinquefasciatus沙特延布省样本显示出他们非常接近那些在巴基斯坦,巴西,和印度(基因库的引用;KF406862.1、MK575480.1 MH538709.1, MH538707.1。) [50]。

3.3。库蚊tritaeniorhynchus(图8 (b))

主要的形态特性残雪。tritaeniorhynchus苍白的环中值的存在是长鼻扩展检查长鼻的腹侧表面(图9 (b)),前台和midfemora完全是黑色的(图10 (b)),而分叉R_{2 + 3}近端分叉的吗米_{1 + 2}(图11 (b))。

幼虫的残雪tritaeinorhynchus是阳光,包含许多栖息地植被的暂时的,半永久的,和永久地下水栖息地,低盐度潮汐沼泽,小溪,地面池和沼泽。女性主要在猪和牛饲料,但在他们的缺席将男人27]。据报道,幼虫残雪。tritaeniorhynchus首选水生栖息地与潮湿泥泞的衬底和较低的总溶解盐(TDS)。这些地区在东部Sarwat山脉附近的城市和almasarha, Eleidabi, Sabya, Al-Ariddah, Abuareesh [51]。

残雪。tritaeniorhynchus被发现在所有类型的繁殖地Jazan红海海岸平原的地区(人工池,尤其是浑浊的,雨池、水坝、岩石池,和国内水箱)。也注意到分享繁殖地按蚊arabiensis在该地区,主要的疟疾病媒(23]。

残雪。tritaeinorhynchus日本乙型脑炎的主要矢量在东洋区(27)和裂谷病毒Jazan地区的沙特阿拉伯咬偏爱人类和羊(4]。在目前的研究中,分子的识别残雪。tritaeniorhynchus使用通用引物COI(图12),以及构建系统发育树和独特的集群,与参考的物种基因库(图13),表明它非常相似的物种美国、日本和中国(100%相似,表3)。

3.4。库蚊sitiens(图8(一个))

长鼻的主要形态学特征表明,中位数苍白环存在,但不是扩展检查腹侧表面残雪。tritaeinorhynchus(图9(一个));前台和midfemora斑点(图10 ())。另一方面,分叉的R_{2 + 3}远端分叉的吗米_{1 + 2}(图(11日))。

生态学的残雪。sitiens显示各种繁殖栖息地包括新鲜的地下水、盐、微咸,和人工容器在沿海城市和郊区41]。

也可以发现几乎在每一个停滞不前的微咸水充满阳光(52]。女性主要在猪饲料和鸟类,但也会咬人。这是一个涉及向量日本乙型脑炎(41]。

在吉达,沙特阿拉伯的密度残雪。sitiens直接与温度有关。密度的峰值是在夏天,它是非常丰富的春天,虽然品种全年(46]。

残雪。sitiens分子识别在本研究使用通用引物COI(图12),以及构建系统发育树和独特的集群,与他们相比的物种基因库的引用(图14)透露,它类似于非洲的几内亚和肯尼亚(100%)和中国(100%)(表3)。

所有蚊子物种识别形态在这项研究中也被分子识别,保证绝对的分类之间的兼容性和分子识别、确认PCR是一个互补的工具识别的蚊子。

4所示。结论

在这项研究中,库蚊tritaeniorhynchus是主要物种Jazan地区,其次是吗残雪。quinquefasciatus,然后残雪。sitiens,残雪。侵害。最出没的区域库蚊蚊子在该地区Gizan Sabya。

结果显示的潜力结合形态学和分子识别改进的列表库蚊蚊子、准确地记录他们的地理分布在Jazan地区。这种集成的能力,促进和加强向量监测和控制规划,以及定义在该地区物种的遗传多样性。

数据可用性

在这项研究中使用的数据都包含在这篇文章。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

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