文摘

动脉粥样硬化是世界上导致死亡的主要原因。众所周知,Lipofundin兔子诱发动脉粥样硬化病变20%,但它对血清脂质影响行为和氧化还原环境尚未解决。在这项研究中,新西兰兔2毫升/公斤Lipofundin治疗,疗程8天。然后,氧化还原指标和血清血脂测定spectrophotometrically。另一方面,动脉粥样硬化病变的发展证实了曙红/苏木精染色法和电子显微镜。在实验的最后,总胆固醇,甘油三酯,cholesterol-LDL, cholesterol-HDL水平显著提高。同时,高指数的生物分子损伤,破坏酶和非酶的防御,减少一氧化氮被观察到。我们的数据表明,Lipofundin 20%引发高脂血症,促进氧化应激状态。由于这些现象的重要性作为动脉粥样化形成的危险因素,我们建议Lipofundin诱发动脉粥样硬化主要是通过这些机制。

1。介绍

动脉粥样硬化是一种慢性血管疾病和死亡的一个主要原因,在西方世界。界普遍认为,高脂血症和氧化应激(OS)是主要的贡献者硬化的发展(1]。保持低密度脂蛋白(LDL)在动脉壁2)和氧化的活性氧(ROS)启动一系列复杂的生化和炎症反应(3,4]。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)内化巨噬细胞通过清道夫受体,导致泡沫细胞的形成(5]。此外,氧化胆固醇在动脉斑块产品存在于血液和增加胆固醇的生物合成,影响等离子体膜结构,细胞增殖,细胞死亡,促进动脉粥样硬化发展(6]。

兔子是一种最广泛使用的动物模型在动脉粥样硬化的研究。一个策略诱导动脉粥样硬化病变在这些动物是通过静脉Lipofundin 20%的政府,一个lipid-rich乳液用于肠外营养,产生主动脉病变,表现为皮下脂质积累,内膜的增厚,变形的维管组织架构(7,8]。Lipofundin 20%政府的影响血脂水平和氧化还原环境在新西兰白(NZW)兔子没有被研究过。在目前的工作中,我们表明,Lipofundin 20%诱发hyperlipemic状态和系统性/主动脉氧化应激,从而导致动脉粥样硬化病变的发展。

2。材料和方法

2.1。动物

标准NZW男兔子,重2.0 - -2.5公斤,12周大,得到从CENPALAB (Bejucal,哈瓦那,古巴)。兔子被安置在常规条件下暴露在光暗周期12 h和免费的水和食物。动物实验进行制药和食品科学学院的批准机构动物伦理委员会。所有程序都按照准则规定的执行机构动物保健委员会和欧盟动物实验指南。

2.2。Lipofundin组成

Lipofundin MCT / LCT 20%(布劳恩Melsungen AG)、Melsungen、德国)是一种含有大豆脂质乳剂油100克,100克碳链甘油三酯,甘油25克,鸡蛋卵磷脂12克,α生育酚170±40毫克,油酸钠/ 1000毫升注射用水在足够的数量。

2.3。实验设计

两组10只兔子被用于这项研究。第一组的静脉注射磷酸盐(PBS), pH值7,4(对照组),和第二个收到缓慢静脉注射2毫升/公斤Lipofundin MCT / LCT 20%,作为一个输液在1 - 2分钟(7,8]。这个过程被重复每日8天的时期。9天,动物与盐酸氯胺酮麻醉(5毫克/公斤i.m.。)和安乐死的过量戊巴比妥钠(90毫克/公斤,注射)。(雅培、墨西哥SA de简历、墨西哥),并与生理盐水灌注血管系统是0.9%解决方案在4°C。然后,主动脉是从主动脉弓腹部切除部分,和外膜的脂肪被移除。主动脉拱门被用于组织病理学和氧化还原评估由于Lipofundin 20%全身动脉粥样硬化病变的优先发展这段(8]。对于每一个评价,每组五个动物的样本。

2.4。血清样本集合

血液样本(3毫升)获得0 (Lipofundin政府之前)和天9天(的研究),对生化分析。血退出兔子的边际耳静脉。这些样本立即离心机在2500克,在4°C 10分钟。血清收集和整除储存在−80°C到分析。

2.5。主动脉匀浆制备

主动脉拱门被安置在冰冷的0.1 mol / L Tris-HCl缓冲区,pH值7日6包含1.0更易与L更易与EDTA和0.2 L丁羟甲苯(缓冲)和浸渍在均匀化组织均质器(埃德蒙•布勒公司LBMA德国)。均质组织随后在4500 g离心20分钟在4°C,和上层的收集和储存在−80°C到氧化还原生物标记物决定。

2.6。组织病理学
2.6.1。Eosin-Hematoxylin染色

主拱在PBS冲洗,pH值7,4,横向切割,固定在10%甲醛溶液。样品被嵌入在石蜡。Five-micrometer组织部分被削减,风干在玻璃幻灯片,deparaffinized和水化。最后,组织部分与伊红染色和苏木精(他)标准程序。奥林巴斯光学显微镜BX51的部分进行了分析。

2.7。超微结构分析
2.7.1。电子透射显微镜

透射电子显微镜(TEM)、兔主动脉弓样本被固定在4°C 1 h 3.2%戊二醛(琼脂科学、英国),0.1米磷酸缓冲(pH值7,4)和后缀OsO在1%41 h。分级乙醇脱水后,样本嵌入在性欲低粘度环氧树脂为24小时37°C。超薄的部分切成400 - 500Å厚片的超微切片机(NOVA, LKB),复染色与醋酸双氧铀及柠檬酸铅,并分析了在TEM (JEOL jeem - 2000 ex JEOL,日本)。

2.7.2。血清脂质分析

血清总胆固醇、甘油三酯、年龄组和为确定使用商业酶试剂盒(草毒死,Crumlin,英国)。

2.7.3。氧化还原生物标记决定

所有生化参数测定光谱光度测量的方法使用淀粉微球1000分光光度计(Pharmacia LKB,乌普萨拉,瑞典)。总蛋白水平测定使用由布拉德福德(描述的方法9)与牛血清白蛋白作为标准。SOD活性测定采用RANSOD工具包(商品目录号。SD 125年草毒死实验室,Crumlin,英国),黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶用于生成超氧化物阴离子自由基( O 2 • − ),与2 - (4-iodophenyl)反应3 - (4-nitrophenol) 5-phenyltetrazolium氯(INT)形成一个红色的甲瓒染料。SOD活性是通过这个反应的抑制程度来衡量的。过氧化氢酶(CAT)活性由过氧化氢分解后(H2O2)在240海里每隔10 1分钟(10]。

经过沉淀的硫醇蛋白质,减少谷胱甘肽(GSH)含量测定的方法Sedlak和林赛(11与Ellman)试剂(5 5′dithiobis-2-nitrobenzoic酸)(σ圣路易斯,密苏里州,美国),和吸光度测量在412海里。纯化谷胱甘肽(σ圣路易斯,密苏里州,美国)是用于生成标准曲线。

高级氧化蛋白质产品(AOPPs)测量如前所述[12]。简单,样品在PBS(1毫升)服用50 L碘化钾1.16紧随其后的100年 L醋酸。吸光度是立即阅读340海里。AOPP浓度表示为 chloramines-T M。

浓度的丙二醛(MDA)确定使用法律外包- 586装备获得Calbiochem (La Jolla、钙、美国)。试验,生产稳定的发色团40分钟的孵化后45°C为586 nm。为标准,刚做好的解决方案的丙二醛双(二甲基缩醛)(σ圣路易斯,密苏里州,美国)在相同的条件下工作,化验(13,14]。

为了确定对脂质过氧化和总活性抗氧化能力(陷阱),样本孵化与硫酸铜溶液(最终浓度2毫米)37°C 24 h。过氧化作用势(PP)被减去之前的MDA水平计算诱导脂质过氧化反应的一个获得24小时(15]。

亚硝酸盐( N O − 2 )水平,作为代理一氧化氮(NO的标志•),确定将硝酸盐转化为亚硝酸盐使用硝酸还原酶(勃林格曼海姆意大利温泉、意大利米兰)。然后,格里斯试剂(1%对氨基苯磺酰胺、N - (1-Naphthyl) 0.1% 0.25%磷酸乙二胺盐酸盐)添加了(16]。样品在室温下10分钟,孵化和吸光度测量在540海里。

2.8。统计分析

使用SPSS统计分析程序为Windows(11.5版本,SPSS Inc .)。巴特利特的盒测试用来测试方差的同质性。组之间的差异取决于学生的t以及(双尾)。数据表示为平均值±标准偏差(SD)。一个P< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。组织病理学

他染色主动脉弓部分控制兔子显示内膜的增厚和维管组织架构(数据失真1(一)和1 (c))。相比之下,从这些动物主动脉部分接受静脉注射2毫升/公斤Lipofundin 20%在8天的内膜增厚明显脂质积累和组织架构(数据的失真1 (b)和1 (d))。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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图1
组织病理学分析兔主动脉的树。曙红/苏木精染色显示正常的主动脉形态学控制动物(a)和(c),虽然Lipofundin组主动脉显示内膜的增厚,维管组织架构特点是变形和大细胞外空间,可能充满脂质(星号)(b)和(d)。箭头:内皮细胞。放大10×40×(a)和(b)和(c)和(d)。规模酒吧,20μm。

Nonrelevant在其他器官疾病或异常检测到宏观和微观检查。

3.2。超微结构分析

另一方面,超微结构的分析证实了光学显微镜观察到的结果。在观察动物接受Lipofundin内皮损伤内皮完整性的丧失和大量存在的泡沫细胞和内膜myofibroblasts和媒体层。同时,我们观察到细胞外高脂质积累和胶原纤维沉积(数字2 (c),2 (d),2 (e),2 (f))。没有改变控制兔子观察主动脉动脉壁(数字2(一个)和2 (b))。

(一)
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(b)
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(c)
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(e)
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(f)
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图2
超微结构的分析。面板(a)和(b)对应于对照组的动物,而面板(b)、(c), (d)和(e)显示Lipofundin政府在动脉粥样硬化病变的形成的影响。EL EC:内皮细胞:细胞外脂质,VSMC:血管平滑肌细胞,护士:核,FC:泡沫细胞,LV:脂质空泡形成,CF:胶原纤维,myofibroblasts。比例尺1μm (a, b, c, d), 500海里(e, f)。
3.3。血清脂质

血清总胆固醇、甘油三酯、年龄组为水平有显著提高( < 0 。 0 5 在那些动物治疗期间与lipid-rich乳液Lipofundin 8天,虽然没有显著改变观察血清脂质控制兔子在整个研究(表1)。

表1
Lipofundin对血清血脂的影响。价值观代表平均值±标准偏差。星号表示统计学差异( < 0 。 0 5 )。
3.4。氧化还原生物标志物

表2显示的行为在两组血清和主动脉氧化还原参数。生物分子损伤标记物明显( < 0 。 0 5 )修改后8天Lipofundin管理相比,参与集团。在实验周期的结束,MDA水平,脂质过氧化的产物之一,是在Lipofundin-treated动物比对照组高。此外,Lipofundin治疗也引起了AOPP水平与对照组相比上升。抗氧化酶SOD和CAT的活性明显高于( < 0 。 0 5 Lipofundin组)的实验相比,控制兔子。的 N O − 2 水平,谷胱甘肽浓度显著降低8天后Lipofundin治疗相比,那些未经处理的动物( < 0 。 0 5 )。最后,对脂质过氧化反应在动物那些收到Lipofundin更高。8天后,观察这些动物显著增加页( < 0 。 0 5 ),而计算的控制。

表2
Lipofundin对氧化还原生物标志物的影响。价值观代表平均值±标准偏差。星号表示统计学差异( < 0 。 0 5 )。主动脉的浓度参数每毫克总蛋白(Pr)的表达。

4所示。讨论

主动脉的组织病理学分析部分从兔子Lipofundin对待20%证明Lipofundin诱发动脉粥样硬化病变的能力。如上所述,内膜的增厚和扭曲的组织架构被呃染色观察。电子显微镜证实存在泡沫细胞,细胞外脂质积累,胶原纤维沉积,血管平滑肌细胞(VSMC)迁移,myofibroblasts的存在,也内皮完整性的丧失。这些事件,由Lipofundin 20%,贡献与动脉粥样硬化的发展。

的实验中,我们观察到的高血清甘油三酯的水平,总胆固醇,年龄组,为动物治疗Lipofundin 20%相比,控制兔子。的确,有升高血浆脂质之间的因果关系和动脉粥样硬化病变的发展17- - - - - -19]。

Lipofundin 20%全身高脂血症可能与高甘油三酯含量乳液。高水平的外生甘油三酯促进ApoB100和胆固醇合成和最终的组装非常低密度脂蛋白(VLDL) [20.]。事实上,Lipofundin 10%引起血清总胆固醇增加60%后注射用在人类研究中(21]。

此外,有一个相互交换脂质和载脂蛋白血清脂蛋白和甘油三酯/磷脂颗粒(22]。为的增加可能是由生理反应年龄组水平升高。众所周知,高密度脂蛋白防止动脉粥样硬化的发展。然而,根据最近的动物和流行病学研究,似乎除了数量(23]HDL的其他属性,如抗氧化剂和抗炎能力,对于atheroprotection[是必要的24,25]。

在这项研究中,我们证明了Lipofundin-induced高脂血症与系统性和主动脉OS。强有力的证据对自由基的参与生产已报告在高脂血症的发病之前(26]。慢性生成和持续的高毒的ROS水平与一些病理条件包括心血管疾病如动脉粥样硬化(27]。在动脉粥样硬化病变的发展过程中,通过机制涉及脂质过氧化和细胞损害发生氧化修饰的蛋白质(28]。另一方面,干扰的抗氧化酶活性和大幅减少动脉粥样化形成过程中观察到的非酶的防御也(29日]。高水平的血清MDA和主动脉组织从兔子轴承动脉粥样硬化病变,与对照组相比,表明法律流程外包的作用在细胞氧化还原状态的损失前动物Lipofundin治疗硬化的刺激下所致。MDA水平不仅被认为是操作系统的一个指标,但也作为动脉粥样化形成的生化标记(30.,31日]。

氧化修饰的蛋白质也参与动脉粥样硬化(32]。通过AOPP的决心,我们测量了氯化蛋白质水平,造成myeloperoxidase-derived次氯酸(HOCl)。它已经表明,HOCl-modified蛋白质存在于动脉粥样硬化病变和预测疾病的进展5]。AOPP的高水平这些动物收到了脂质乳剂表明巨噬细胞浸润和炎症过程的积极作用在动脉粥样硬化病变的发展目前的动物模型。

抗氧化防御系统,作为平衡的表达式生成和氧化代谢物的失活,代表一个有用的工具来检查氧化还原状态(33,34]。在我们的研究中,细胞外的SOD活性越高,在动物Lipofundin处理,发现可能与增加有关 O 2 • − 一代,通常由泡沫细胞和巨噬细胞在动脉粥样硬化病变的网站35]。同时,在硬化过程中,有一个增加血管NADPH氧化酶活动,的主要来源 O 2 • − 在脉管系统(36]。

猫是另一种抗氧化酶存在于血管,起着重要的作用在氧化还原环境的维护(37]。在我们的研究中,我们发现高酶活性在动物Lipofundin对待。在粥样硬化病变的开始和发展,酶基因表达增加,这样有助于延缓疾病进展(38,39]。此外,它已经表明,动脉粥样化形成的早期步骤猫活动增加氧化剂反应刺激由ox-LDL和活性氧,如H2O2时,(40]。

动脉粥样化形成过程中,产生的活性分子有可能耗尽周围细胞谷胱甘肽的水平,影响他们的抗氧化防御系统和解毒途径(41]。我们的结果显示出了极大的消耗动物血清和主动脉谷胱甘肽水平的治疗脂质乳剂相比,控制兔子。这一事实可能与Lipofundin-mediated ROS生成和高浓度的生物分子破坏Lipofundin-treated中发现的动物。

最后,我们评估的行为 N O − 2 水平,作为标志的•生物利用度。没有•是一种血管活性的分子在血管内稳态的维护(一个重要的角色42]。没有减少的•生物利用度被认为是血管内皮功能障碍的一个重要指标导致动脉粥样硬化的发展(43]。我们的实验结果显示减少的生物利用度•在Lipofundin-treated兔子与控制。这对血管功能可能造成有害影响的Lipofundin-induced粥样硬化的发展。

5。结论

总之,目前的研究表明,Lipofundin 20%引发高脂血症,从而促进系统性和主动脉OS也与动脉粥样硬化病变的形成贡献NZW兔子。这项工作表明小说的证据Lipofundin-induced脂质和蛋白质氧化损伤,损伤的抗氧化状态和减少一氧化氮水平。这些结果加强Lipofundin的有吸引力的特征作为一个电感器实验兔动脉粥样硬化。减少实验时间和相关的成本,与其他建立模型相比,在我们看来是主要的动脉粥样硬化动物模型的优势。

利益冲突

没有利益冲突。

确认

作者欣然承认支持中心的分子免疫学的技术援助(古巴哈瓦那)和Dalia r·阿尔瓦雷斯。