文摘
此前有报道称白色念珠菌水溶性部分(CAWS),包括mannoprotein和β葡聚糖复杂,具有强大的力量在DBA / 2小鼠诱发致命的坏死性动脉炎。在这项研究中,组织病理学变化和心脏功能在这个系统了。一毫克/天CAWS给DBA / 2小鼠经腹腔注射5天。CAWS-treated DBA / 2小鼠诱发主动脉炎和几周内死亡的发生率为100%。包括组织学检查发现左心室流出道狭窄(LVOT)和严重的炎性改变纤维素样坏死的主动脉瓣。观察心脏肥大,心脏重量增加1.62折()。超声心动图显示严重减少收缩和膨胀腔的左心室(LV): LV部分缩短(LVFS)从71%下降到38% (),LV舒张末期直径(LVDd)增加从2.21毫米到3.26毫米()。法国巴黎mRNA的效价提高CAWS-treated组。严重的炎症变化造成CAWS带来致命的LV功能障碍通过主动脉瓣变形LVOT狭窄。这系统,提出了一个简单的和有用的实验模型的心脏衰竭,因为CAWS可以诱导动脉炎CAWS单独注射。
1。介绍
心血管疾病死亡的主要原因,全球最大的负担医疗资源之一。临床指南治疗心血管疾病是由高质量的循证医学(EBM)的分析方法。然而,认为高等动物模型的存在是必不可少的发展的新的治疗药物和方法。
此前有报道称其为分子模式(pamp) [1)在白色念珠菌水溶性部分(CAWS)有强烈induction-potency小鼠血管炎和显示在某些品系小鼠急性致命的毒性,通过各种生物活性(2- - - - - -5]。CAWS包括水溶性mannoprotein和β葡聚糖复杂的培养液白念珠菌应变NBRC 13856]。另一方面,无赖,包括白念珠菌细胞提取和源于川崎病病人的粪便样本,据报道诱导小鼠血管炎类似于川崎病冠状动脉炎(7,8]。此外,在一个额外的研究假丝酵母派生的特工,CAWS诱发严重的血管炎发病率高于无赖在许多老鼠菌株,并有报道称在这宝贵的动物模型系统研究系统性免疫反应和炎症性血管疾病3,5,9]。特别是CAWS造成严重的坏死性冠状动脉炎和DBA / 2小鼠主动脉炎的发生率100%,腹腔内管理,和所有的老鼠死在几周内(10,11]。
CAWS动脉炎的长期死亡率与DBA / 2小鼠只发现,但CAWS动脉炎不是致命的其他老鼠CAWS敏感菌株。在小鼠容易CAWS动脉炎,只有DBA / 2小鼠死亡的原因是不清楚。
在这个报告中,建立的有效性为目的的DBA / 2小鼠心脏衰竭模型,CAWS动脉炎的影响在心脏肥大是利用超声心动图研究其对心脏功能的影响。此外,心脏功能通过测量分析了B型利钠肽(BNP)水平,用体液心力衰竭标记。从目前研究结果,本研究提出了一个简单和容易的CAWS引起的左心室功能障碍动物模型。
2。材料和方法
2.1。CAWS的提取和制备
CAWS准备按照以前的报告(6]。白念珠菌应变NRBC 1385年培养最初完全合成培养基(C-limiting介质)在酸性条件下pH值5.2 C-limiting中含有蔗糖10 g (NH)4)2所以42 g, KH2阿宝42 g, CaCl2h·22O 0.05 g, MgSO4h·72O 0.05 g, ZnSO4h·72O 1毫克,CuSO4h·52O 1毫克,FeSO4h·72O 0.01 g,生物素25毫克(每升)。培养基是维护没有pH值调整而曝气和五个垃圾/分钟室内空气在27°C生产孵化器在400 rpm的文化。两天后孵化,培养基与同等体积的乙醇混合,留下过夜。乙醇不溶性部分是收集和水溶性化合物添加蒸馏水孤立的沉淀。水溶性化合物又被添加乙醇沉淀,留下过夜。CAWS得到的沉淀与丙酮干。每批CAWS用于本研究检查下面的物理化学和生物化学参数:与抗内毒素含量、反应性假丝酵母单价抗血清,β葡聚糖含量、元素分析碳、氢、含氮量、急性致命活动由以前的报告有相同的属性作为本研究中使用的很多。
2.2。维护的老鼠,生存和组织病理学观察
实验动物的处理和治疗符合制药和生命科学实验室的东京大学动物处理代码。DBA / 2 4和5周的雄性老鼠的年龄(从日本提供SLC有限公司)是治疗腹腔内管理CAWS一毫克/鼠标的速度连续5天。超声心动图进行一个测试床保持在一个适宜的温度。CAWS政府后,老鼠牺牲每周静脉注射氯化钾。收集他们的器官和病理切片为串行部分使用光学或立体显微镜观察。心脏和血管的病变组织切片进行评估与苏木精和伊红染色法染色(他)。组织样本的收集电子显微镜两周后CAWS注入和透射电子显微镜的图像(JEOL jem - 2000 ex)是技术供应商提供的(Hanaichi有限公司)。
2.3。超声心动图
ProSound ssd - 6500 sv (ALOKA有限公司)线性转换器和新生儿探针用于小鼠心脏功能的决心。老鼠用戊巴比妥钠麻醉40毫克/公斤,腹腔内管理,和超声波透水材料夹在鼠标和抑制动物的调查。超声心动图进行一个测试床保持在一个适宜的温度。
2.4。提取总RNA和逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),
获得的总RNA分离固定协议的氯仿萃取后心肌组织均质化低温(少于4°C)等基因(日本基因有限公司)。总RNA浓度和纯度测定使用NanoDrop nd - 1000紫外分光光度计(NanoDrop Technologies, Inc .)。从一个rt - pcr反应混合物准备工具包(豆类生物有限公司)为模板如下RNA变性和反转录反应。PCR引物用于小鼠β肌动蛋白是感觉5′-GCCATGGATGACGATATCGCT-3′和反义5′-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3′(产品尺寸574个基点),和B型利钠肽(BNP)感觉5′-ATGGATCTCCTGAAGGTGCTG-3′和反义5′-GTGCTGCCTTGAGACCGAA-3′(产品尺寸241个基点)12,13]。PCR反应产物被孤立在1%琼脂糖凝胶电泳。574年英国石油公司的β肌动蛋白和法国的241个基点的乐队被溴化乙锭染色和紫外线照射。乐队模式记录数字使用荧光剂量计(IR las - 1000,富士胶片有限公司有限公司)。
2.5。统计分析
数据意味着±SEM。kaplan meier的生存数据计算方法相比,使用治疗之间的确切概率法和CAWS治疗组生存比例在每个时间点。参数由超声心动图和心脏重量检查使用学生的以及未经处理和CAWS治疗组之间。的值被认为是具有统计学意义。文献表明无统计差异。
3所示。结果
3.1。CAWS治疗DBA / 2小鼠的生存
DBA / 2小鼠在四到五周的年龄与CAWS管理在一个毫克/鼠标通过腹膜连续五天在特定病原体和维护自由(SPF)条件。所有CAWS治疗DBA / 2小鼠死亡5到8周后CAWS政府(图1)。一个鼠标突然抽搐发作被发现身亡CAWS治疗组在观察期间。
3.2。CAWS动脉炎的发展和进步
CAWS动脉炎的发展和进步了三到四个星期。最初,炎症细胞入侵到左冠状动脉(LC)和右冠状动脉并发主动脉窦(RC),然后细胞被推迟和入侵noncoronary (NC)窦(图21 w和2 w)。这些严重的局部炎性病变近端并发冠状动脉与主动脉窦包括主动脉瓣(图22 w)。炎症细胞主要包括中性粒细胞入侵从动脉外膜逐渐向媒体,和内膜细胞积累发展同步(图22 w, 3 w)。CAWS政府的第三周后,炎症病变扩散到所有层的并发主动脉组织和主动脉窦与媒体的纤维素样坏死(图23 w和4 w)。电子显微镜图像的组织展示了炎症细胞冲破了弹性纤维和渗透到媒体的内膜(图3(一个)),和各种炎症细胞积累,但这些并没有详细分类(图3 (b))。
(一)
(b)
(一)
(b)
3.3。CAWS治疗心脏的解剖和组织病理学特征
心里明显增加体重和心脏肥大CAWS中观察到治疗组在6周后CAWS管理局(图4 ()和4 (),图5(一个))。另一方面,CAWS治疗组的体重往往低于对照组(图约10%5 (b))。严重的炎症细胞像一个积累脓肿并发主动脉窦中被发现。左心室流出道(LVOT)狭窄和主动脉瓣变形(图中被发现4())。疤痕的右心室壁心肌梗死被观察到,但是没有发现异常变化其他阀门和没有证据表明左心室心肌梗死的组织。CAWS-treated心肌细胞横截面积的增加虽然没有显著差异(图4())。
(一)
(b)
3.4。CAWS动脉炎被超声心动图心功能和法国巴黎归纳
十个DBA / 2小鼠每个CAWS治疗和治疗组超声心动图的准备。DBA / 2小鼠测试后的第六周CAWS管理,但两只老鼠死了CAWS之前治疗组超声心动图检查。与戊巴比妥钠小鼠腹腔内注射麻醉的考试前40毫克/公斤。所有未经处理的小鼠通常醒来后检查,但两只老鼠在CAWS治疗组与严重的心脏功能障碍因为死于心脏骤停在超声心动图检查(表1)。检查发现严重减少收缩和膨胀腔的左心室(图6(一))。扩张(LVDd)和左心室舒张末期维度降低左心室部分缩短(LVFS) CAWS治疗组(图中观察到6 (b))。在这项研究中,准确的测定主动脉直径和transmitral流型由超声心动图检测左心室的困难。血液和压力增加被发现在LVOT和主动脉瓣,但未能表现出显著差异,因为只有几个结果(数据未显示)。此外,法国巴黎,这是心脏衰竭的一个标志,是衡量乐队通过rt - pcr的发光强度。BNP乐队在DBA / 2小鼠表现出非凡的增强CAWS六周后管理(图7)。
(一)
(b)
4所示。讨论
慢性致命毒性的原因CAWS DBA / 2小鼠还未确定足够在以前的报告,检查这个模型只有从动脉炎的角度4,10,11]。从之前的组织病理学报告与高剂量的CAWS, CAWS动脉炎的特点被描述为坏死性血管炎,因为积累的各种炎症细胞伴随着纤维素样坏死并发主动脉瓣和主动脉窦,但其他重大异常CAWS-treated心也不见了(11]。此外,严重的变化,可能会由于CAWS死因没有发现任何其他主要内脏器官(消化系统、呼吸系统、神经系统或脑)。认为减肥CAWS-treated组相关的炎性细胞因子,因为大量的炎性细胞因子的生产被CAWS治疗体外诱导。
在这个组织病理学研究中,炎症细胞积累位于主动脉根,但没有证据表明左心室心肌炎或梗死CAWS治疗。因此,concentric-like左心室肥大强烈建议LVOT狭窄和主动脉瓣畸形带来的左心室压力过载CAWS动脉炎的发展后几个星期。直接测量的压力梯度利用microcatheter是极其困难的,因为非常需要练习技术操作的小鼠主动脉不到一毫米。超声心动图,血液和压力增加被发现的LVOT和主动脉瓣CAWS-treated老鼠虽然只有几个数据。然而这些数据强烈建议LVOT狭窄的存在。另一方面,超声心动图显示的结果减少左心室收缩和eccentric-like左心室肥大CAWS-treated老鼠临死之前。这一过程的原因认为左心室同心肥大进行扩张阶段。此外,因为两只老鼠引起的心脏骤停在超声心动图试验,建议CAWS-treated老鼠患上严重的心脏功能障碍的晚期阶段。
CAWS-treated心肌细胞横截面积的增加,但没有任何证据表明纤维化,因为只有他进行染色实验。此外,在以前的报告11),间质纤维化中没有发现有限周围炎性病变弹力van Gieson (EVG)染色。因此它被认为是进一步数据需要证明心肌的纤维化。BNP测定心脏衰竭的最敏感的标志在临床设置和分泌主要延长心室心肌细胞(14]。因此,效价高BNP与心肌细胞肥大建议左心室过载LVOT狭窄和主动脉瓣疾病。
在实验冠状动脉结扎模型和动脉粥样硬化进展模型由载脂蛋白e缺陷,左心室心肌梗死,纤维化常被发现(15,16]。然而,左心室坏死和纤维化,表明心肌梗死并非CAWS动脉炎。此外,超声心动图显示弥漫性左心室壁运动功能减退,但在特定的墙段运动不能没有发现。建议缺血的影响并没有引起左心室梗死尽管CAWS开口病变的冠状动脉病变动脉炎。另一方面,右心室的心肌梗死CAWS-treated组中被发现。DBA / 2小鼠是一个有严重的心包炎的菌株与野生型钙化。尤其是在右心室显著变化是观察心包。很难解释为什么只在右心室心肌梗死的开发,但这是怀疑当地严重的直接侵犯心包钙化和炎症细胞坏死的原因。
在前面的研究中,发现了CBA / J小鼠被免疫抑制il - 10对CAWS感应(17),但明显的炎性细胞因子的生产和嗜中性粒细胞激活被观察到在敏感的小鼠品系,如DBA / 2,只有C57BL / 6, BALBc,摘要:母鸡,影响HeJ [3- - - - - -5,18]。CAWS-sensitive老鼠,除了应变DBA / 2,没有死亡,尽管发展动脉炎。致命的心脏毒性的原因之一是,DBA / 2小鼠显示最严重的动脉炎CAWS-sensitive小鼠品系。此外,野生型DBA / 2小鼠发现自发广泛钙化的右心室心外膜和心肌炎(19]。心外膜钙化的起源已经被解释为subepicardial细胞的坏死和矿化,这可能表明心外膜的炎症和无营养钙质沉着DBA / 2小鼠(20.]。在目前的研究是不可能确定心室功能障碍在野生型DBA / 2小鼠相比其他很少受压力。
在报告中CADS-vasculitis [21),脓肿、坏死的肾动脉,淋巴结和肝脏,但CAWS动脉炎的病变局部主动脉根包括开口病变的冠状动脉和主动脉瓣。
antiaortic抗体(与胶原蛋白自身抗体反应性)和antineutrophil胞质抗体(ANCA)建议参与人类血管炎(22]。报道一个anticardiac肌凝蛋白自身抗体在川崎病的病人23),但似乎没有心肌炎CAWS动脉炎。在这项研究中,它是不可能证明自身抗体的存在或澄清的原因严重病变仅限于近端心血管组织,但进一步的研究进展检查自身抗体的参与。
最近,已经有许多报道暗示与微生物感染或抗原和血管疾病的关系。有报告表明ANCA-associated血管炎和感染的参与(24]。此外,研究先天免疫机制,以应对传染病迅速拥有先进。特别是免疫刺激性药物的微生物来源,如脂多糖(LPS),已经被确认为其分子模式(pamp) [1]。已经认识到模式识别受体(PRRs),包括toll样受体(通常)中扮演重要角色的生物活动pamp [25]。TLR 2和MyD 88小鼠川崎病相关模型引起的干酪乳杆菌细胞壁中提取(LCCWE),但没有证据的配合TLR - 4 LCCWE动脉炎(26]。此外,有报告增加CD180的表达式,这被认为是一种b细胞表面通常同系物,在病毒感染和川崎病的病人27]。尽管TLR - 2和/或TLR - 4与心血管重塑相关,动脉粥样硬化,假丝酵母派生的甘露聚糖活动(28,29日),至少TLR - 4似乎不需要CAWS动脉炎,因为它是诱导甚至在影响HeJ老鼠,这是一个TLR 4-mutant应变和显示一个弱反应有限合伙人(2,5]。凝集素受体与pamp的信号,和Dectin-1 2被称为凝集素受体β葡聚糖和α甘露聚糖,这些是代表pamp真菌来源的30.,31日]。在最近的一项研究中,假丝酵母甘露聚糖和葡聚糖需要合作的凝集素和通常诱导免疫反应(32]。这是推测CAWS强烈激活人类补体系统通过凝集素途径凝集素受体参与血管炎发起活动时CAWS [10]。因此,似乎与各种受体、免疫分子的合作参与无赖和CAWS的生物活性。感染白念珠菌不会导致的直接诱导血管炎,和CAWS取决于它的活性更高的结构。特别是,它是认识到,甘露聚糖的结构受到的文化条件的影响白念珠菌(3,6,10]。
总之,这些炎症变化CAWS动脉炎带来的主动脉瓣膜病和LVOT狭窄。建议CAWS动脉炎的发展分为以下三个阶段,第一阶段是血管炎的发展,第二阶段包括复杂与肥大心肌重塑,过载,最后阶段是致命的严重的左心室功能障碍和猝死(图8)。提出简单的和独特的CAWS动脉炎引起的心力衰竭模型,不需要特定的技术,如分钟手术或病毒感染,构成了一个有价值的模型系统。此外,大量的研究可以诱导动物患脉管炎同时通过简单的CAWS腹腔内注射。CAWS动脉炎和致命的心脏衰竭的并发症形成一个简单的和有用的实验模型的心血管疾病临床调查。
确认
在这项研究中,Kouya铃木和绪Kitamura请帮助与实验技术。