纤维母细胞生长因子2和hiv - 1蛋白质加强促进bcl - 2表达和防止内皮细胞凋亡:对AIDS-Associated卡波西肉瘤的发病机制的影响

文摘

卡波济氏肉瘤(KS)是一种血管肿瘤通常发生在人类免疫缺陷病毒(HIV) 1-infected个人。我们以前的工作表明,血管生成纤维母细胞生长因子(FGF) 2和hiv - 1的蛋白质,既表达了KS病灶感染艾滋病毒的病人,加强在诱导angioproliferative KS-like病变老鼠。在这里,我们表明,angioproliferative病变的发展促进小鼠通过结合答和FGF-2伙伴增加凋亡bcl - 2蛋白的表达水平。Upregulation bcl - 2表达的结合FGF-2和乙也发生在体外,这主要保护人类内皮细胞程序性细胞死亡。bcl - 2表达在人类KS病变时尚并存疾病的进展,这些研究结果表明分子机制答和FGF-2 KS维护和发展在感染艾滋病毒的人合作。

1。介绍

KS出现多个补丁,斑块,或结节状病变,通常位于皮肤或粘膜方面,还涉及到内脏器官(了1])。

早期KS病变类似炎症,granulation-type反应,他们的特点是异常血管生成,白细胞浸润,内皮细胞激活,水肿endothelial-like扩散,纺锤状细胞被认为是KS肿瘤细胞(KS细胞)(1]。

KS病变的发展引发的炎症介质和生长因子(1)的生产可以诱导或增强人类疱疹病毒8型(HHV-8),病毒感染几乎所有KS病人(了2])。

在生长因子表达KS病变,FGF-2 KS发展是关键。具体来说,在其生产的KS细胞或浸润白细胞,FGF-2刺激内皮和KS的运动和增长细胞通过旁分泌和自分泌机制,分别是(1]。一致,FGF-2可以直接促进KS-like病变的发展在活的有机体内(3,4],它介导的形成angioproliferative KS引起的病变细胞注入裸鼠[5]。

尽管在一般人群罕见,慢慢进步,KS变得频繁而积极地感染艾滋病毒的人(获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)相关的KS) (1]。

在这方面,以前的结果表明,hiv - 1的蛋白质可以作为AIDS-KS发展因素。答,反式激活因子的hiv - 1病毒复制所必需的基因表达,是hiv - 1释放的强烈感染T细胞(了6])。通过细胞表面受体整合素家族,细胞外答诱发内皮或KS细胞运动和附着力6]。同时,乙竞争FGF-2绑定到硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的细胞表面和细胞外基质(ECM) (7]。在这一过程中,乙可以检索隔离FGF-2可溶性,生物活性形式,进而促进内皮或KS细胞生长7]。

虽然早期KS病变多克隆性质和可能倒退,结节性KS晚期病变可以演变成一个真正的肉瘤1]。值得注意的,在这一阶段的疾病进展,KS病变进行快速增长的低细胞有丝分裂指数(8]。这表明血管细胞生存可能普遍KS维护和发展。

在这种背景下,bcl - 2蛋白的水平,一个强有力的对手的程序性细胞死亡(凋亡),被发现在后期增加,相比早期病变,从各种形式的KS [8- - - - - -12]。Coexpression bcl - 2和内皮细胞标记(9,10)表明,bcl - 2是调节内皮细胞激活新成立的,异常血管KS病变特征。一致,bcl - 2上调与减少或缺乏内皮细胞的凋亡8,9]。

然而,目前几乎没有了解KS的bcl - 2诱导机制。

自答或FGF-2可以调节bcl - 2表达的多种细胞类型(13- - - - - -21),在此我们评估的影响FGF-2答,单独或组合,在动物和bcl - 2表达在体外先前实验模型用来研究AIDS-KS发病机理。

2。材料和方法

2.1。试剂

重组hiv - 1蛋白质(希望具有的隔离),纯化,进行生物活性测试,如前所述处理(22]。人类重组FGF-2购买从罗氏分子生化药剂(印第安纳波利斯,)。牛血清白蛋白(BSA,分数V),肝素钠盐,从猪肠道粘膜,明胶(变性胶原蛋白我,从牛的皮肤),和化学物质用于蛋白质提取来自σ(圣路易斯,密苏里州)。基底膜基质、重组基底膜和内皮细胞生长补充(ecg)获得BD生物科学(贝德福德,MA)。磷酸缓冲盐(PBS)的解决方案,RPMI 1640生长培养基,从表达载体及其补充(佩斯利、苏格兰、英国)。

2.2。动物研究

重组FGF-2和/或蛋白质(1g和10g、职责)悬浮在0.2毫升的pbs - 0.1% BSA,与同等容积的基底膜基质混合,然后的背部皮下注入Balb-cν/ν雌性老鼠(4-6-week老,查尔斯河育种实验室、Calco、意大利),如前所述[3,4]。控制动物接种同样体积的基底膜基质和缓冲(pbs - 0.1% BSA)暂停FGF-2或答。七天后,老鼠牺牲了,在这个时候,注入的网站评估宏观损伤的存在(3,4]。组织样本被浸泡在福尔马林溶液或冻结在10月化合物(英里实验室,内伯威尔市,IL)。幻灯片从formalin-fixed石蜡包埋块hematoxylin-eosin染色后在显微镜下检查。冷冻组织部分被固定在丙酮和沾染了0.4μ克/毫升anti-Bcl-2兔多克隆抗体(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA) peroxidase-anti-peroxidase方法(Dako) [3,4]。阳性细胞的百分比确定的意思5大功率领域(40 x放大),表示的意思(最小和最大范围)值。老鼠的护理和使用符合欧洲共同体的指导方针。

2.3。细胞培养

人类脐静脉内皮细胞从Lonza(通过传代形成细胞(Verviers、比利时),种子表面预镀与明胶在RPMI 1640培养基培养和补充15%胎牛血清的边后卫,丙酮酸钠、谷酰胺,MEM至关重要的和不重要的氨基酸,肝素(1g / mL)和ecg (45g / mL)。实验在缺乏ecg或肝素。

2.4。免疫印迹分析

在每个实验,HUVECs在冰冷的PBS洗净,刮掉瓶,和细胞溶解在50 nM三pH值7.5,1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF), EGTA 2毫米,10毫米德勤,5μ200年g / mL抑肽酶g / mL亮抑酶肽,特里同X 100 0.15%。细胞溶解产物中蛋白质含量与布拉德福德化验试剂(Bio-Rad大力神,CA)。八μ克蛋白质从每个实验条件受到12%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳随后转移到硝酸纤维素(Amersham法玛西亚生物技术,小都,白金汉郡,英国)。过滤器清洗在阻断缓冲区(Tween-20 PBS脱脂奶粉5%,0.1%),探索anti-Bcl-2单克隆抗体(2g / mL, Santa Cruz),孵化与辣根peroxidase-conjugated山羊anti-mouse二级抗体(Amersham),和发达的使用增强化学发光(ECL)方法(Amersham)。强度Bcl-2-specific乐队被测密度术量化,使用一个成像密度计gs - 700和Multi-Analyst软件(Bio-Rad)。验证每车道等于加载的蛋白质,与反reprobed洇肌动蛋白单克隆抗体(σ)。

2.5。检测细胞凋亡

HUVECs被播种在盘子里涂上一层凝胶或10克/毫升poly-2-hydroxymethyl-methacrylate[聚(丙烯酸-)][23]。细胞暴露在FGF-2,答,或暂停缓冲,然后收集。细胞死亡的实体是由使用两个不同的化验。

第一个是程序性细胞死亡的酶联免疫试剂盒(罗氏)措施公布的核小体的数量在细胞质中死亡的细胞。简而言之,HUVECs细胞溶解,离心后细胞质分数被找回,和核小体化验所表示的制造商。每个样本重复测试。

第二种方法是终端原位dUTP尼克结束标记(TUNEL)测定。短暂,HUVECs被cytospin幻灯片上旋转,在4%多聚甲醛固定,和凋亡细胞的DNA链断裂被TUNEL原位鉴定装备(罗氏),根据制造商的指示。Fluoresceinated核苷酸结合在聚合物末端transferase-based酶反应检测到immuno-histochemical染色使用鼠标antifluorescein异硫氰酸酯(FITC)单克隆抗体和碱性phosphatase-anti-alkaline磷酸酶方法(Dako) [3]。积极的百分比,凋亡细胞决定的意思4大功率领域。

2.6。反向Transcriptase-Polymerase连锁反应(rt - pcr)

从HUVECs提取的总RNA的RNA分析迷你包(试剂盒、希尔登,德国)和进一步纯化三组与胰腺消化DNAse我(10 IU /样本)。纯化RNA (0.5g)与逆转录retrotranscribed系统工具包(美国WI Promega,麦迪逊)孵化hexanucleotide随机引物对10分钟的反应在室温下,在42°C, 30分钟和30分钟53°C。RT的热失活反应后,每个样品受到较低(pre-plateau) PCR(28 - 30)的周期数肌动蛋白与底漆BA-1 [5′-CATGTGCAAGGCCGGCTTCG-3′,核苷酸(nt) 1137年到1156年],位于第一外显子的人类肌动蛋白基因,底漆BA-4 (5′-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3′, nt 1475年至1494年)设计的第二个外显子基因(nt枚举基因库M10277)。这些引物产生226个基点cDNA扩增子;污染物的DNA是由357个基点的外观显示基因组扩增子。的cDNA bcl - 2用于PCR被pre-plateau后决定cDNA正常化肌动蛋白聚合酶链反应。归一化的样本然后接受35周期的PCR bcl - 2。bcl - 2引物5′-TCGCCCTGGTGGACAACA-3′(1957 - 1975)和5′-TGACTTCACTTGTGGCTCAGA-3′(2183 - 2163) (nt枚举基因库M13994)。bcl - 2放大条件如下:4分钟在94°C,紧随其后的是35周期的变性在94°C 1.5分钟,退火在58°C 1.5分钟,在72°C和扩展了2分钟。负控制反应缺乏DNA模板总是并行执行控制样本污染。

扩增产品分离菌进行到1.8%琼脂糖凝胶涂抹在尼龙膜、32和杂化[P]标记的寡核苷酸探针内部的扩增子标准技术。广泛的洗涤后,过滤器被暴露在x射线电影和乐队的强度量化通过即时成像仪(美国帕卡德仪器、镇静剂、IL)。

2.7。统计方法

动物研究的结果分析了根据占据比例平等的测试程序。的统计评价在体外数据是由方差分析模型(方差分析)与Tukey-Kramer调整为多个比较,使用SAS软件,版本9.1(美国NC SAS研究所卡里)。一个P值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。感应的Angioproliferative病变FGF-2与bcl - 2表达,并通过乙都增强

最初的实验调查FGF-2或乙对bcl - 2表达的影响在活的有机体内。

我们之前的研究中测试剂量反应影响FGF-2或答(0.1 -100g)的感应描述KS病变组织学特性在活的有机体内(3,4,24]。从这些结果,我们采用乙和/或FGF-2浓度特别有效促进宏观KS-like病变的发展在老鼠。

具体来说,裸体小鼠注射1克FGF-2和/或10克乙。控制动物注射蛋白质暂停缓冲(pbs - 0.1% BSA)。7天后,老鼠牺牲和注射的网站检查angioproliferative病变的存在(3,4]。组织样本是组织学和bcl - 2 immuno-histochemistry切除和加工。

如图1,FGF-2注入了发展的宏观angioproliferative KS-like病变。具体地说,19日的43个老鼠注射FGF-2 (44%,)开发KS-like病变。这是与纺锤状细胞(图的外观1(一)),这是人类KS病变的组织学特征(1的感应,bcl - 2表达(图1 (b))。特别是,32%(范围19-49)的细胞病变中bcl - 2阳性的。

值得注意,同时接种FGF-2答进一步增加损伤发展和bcl - 2表达。特别是,31的小鼠注射结合FGF-2答,22 (= 71%,P<发达宏观损伤(图0.05)1 (c)),47%(范围22 - 67)细胞的bcl - 2阳性(图1 (d))。

相比之下,没有一个17老鼠注射乙,和70年的老鼠注射蛋白质暂停缓冲(pbs - 0.1% BSA),开发的宏观损伤(数字1 (e)和1 (g)、职责)。bcl - 2为实验条件,并不表示网站的注入(数字1 (f)和1 (h)、职责)。

确认这些在活的有机体内结果,FGF-2和乙在bcl - 2表达的影响进行评估主要在培养人类内皮细胞。为此,HUVECs受到24小时FGF-2和/或答(由他们控制悬架缓冲),和bcl - 2蛋白水平进行免疫印迹分析。如图2FGF-2 bcl - 2蛋白表达增加,而乙就没有效果。然而,当乙是结合FGF-2, bcl - 2蛋白水平进一步提高,证实了在活的有机体内数据。

3.2。FGF-2和乙保护不依从内皮细胞凋亡通过Upregulation bcl - 2表达

从女性bcl - 2能保护内皮细胞,贴壁细胞死亡的过程,当他们失去接触ECM (25,26]。

鉴于我们在活的有机体内和在体外结果,为了评估FGF-2执行额外的工作或乙对女性内皮细胞的影响。为此我们播种HUVECs板涂有聚-(-),复合防止细胞粘附[23]。然后,我们培养的细胞与FGF-2 6 h,答,或者暂停缓冲。细胞死亡是由测量的实体,在HUVECs细胞质、核小体的内容,组蛋白的低分子量DNA片段产生的凋亡细胞基因组的乳沟27]。附着HUVECs镀到明胶的负控制细胞死亡(25,26]。

正如预期的那样,HUVECs没有坚持到保利-(-)涂层表面,这是紧随其后的是一个戏剧性的增加不依从的核小体的内容在细胞质中,而附着,HUVECs(图3(一个))。值得注意的,暴露的不依从HUVECs 1或10 ng / mL FGF-2细胞质核小体的数量减少了30%和50%,分别(图3(一个))。虽然乙独自没有影响,结合FGF-2 1 ng / mL,它降低细胞质核小体的数量水平HUVECs中处理10 ng / mL FGF-2(图3(一个))。因此,答FGF-2拯救内皮细胞凋亡的能力增加。

TUNEL分析证实了这些结果。具体来说,在不依从的条件下,1 ng / mL的FGF-2减少凋亡的数量单独使用时HUVECs 55% (P= 0.0490)和80%加上10 ng / mL的答(图3 (b))。

调查是否增加内皮细胞生存提升FGF-2和乙不依从条件伴随着bcl - 2表达的调制,bcl - 2 mRNA水平评估在HUVECs上述不同的实验条件。

结果rt - pcr分析表明,bcl - 2 mRNA水平下降了不依从HUVECs−53%,而附着控制(图4)。当不依从HUVECs受到FGF-2 10 ng / mL, bcl - 2 mRNA表达获救附着HUVECs表达的水平(图4)。虽然乙独自没有影响,结合FGF-2 1 ng / mL, bcl - 2的表达在附着HUVECs恢复检测水平(图4)。

4所示。讨论

在健康组织,不受欢迎的血管生成是关闭通过诱导内皮细胞凋亡(25,28]。这可以触发条件,如血管生成生长因子的缺乏,或抑制内皮细胞粘附到ECM,表达下调血管内皮细胞凋亡的分子的表达(25,28]。

在后者中,bcl - 2是非常有效的,在有利于血管生成的过程。特别是,bcl - 2过表达了新成立的滋养血管的内皮细胞生长肿瘤(29日,30.]。

同意这一事实bcl - 2表达会导致不适当的内皮细胞生存和异常血管生成(25,28),临床证据表明,bcl - 2表达的管制可能发挥作用在KS的维护和发展。事实上,在晚期bcl - 2蛋白水平增加,与早期相比,KS病变,这相似之处减少血管细胞凋亡(8- - - - - -12]。

bcl - 2在KS进展的作用是支持同样的功效bcl - 2抑制剂紫杉醇KS患者(31日),确认以前的工作表现KS的动物模型(32]。

在这里,我们评估是否FGF-2 hiv - 1乙,两个关键AIDS-KS发病的因素,可能影响bcl - 2表达在活的有机体内和在体外。

结果表明,FGF-2注入小鼠结果bcl - 2表达的诱导和这个同事angioproliferative的发展,KS-like病变。

关于乙,它没有单独存在时对bcl - 2表达的影响。答蛋白进入细胞,激活细胞基因的表达(6]。特别是,答了调控的bcl - 2表达单核细胞,尽管在更高浓度比我们这里使用的33]。然而,在我们的实验模型中乙的可能性可以直接激活bcl - 2表达要排除在我们的研究结果表明乙本身并不是能够促进小鼠KS-like病变,拯救内皮细胞凋亡或由这些细胞诱导bcl - 2表达。其他人获得的单核细胞的对比数据可以依赖于不同的细胞类型,他们利用。答的影响这一事实是程控依赖强烈支持先前的研究结果表明乙促进细胞凋亡在其他细胞系统(34- - - - - -39]。

相比之下,结合FGF-2答时,它强烈提高FGF-2影响bcl - 2,这并联一个显著增加小鼠angioproliferative病变的形成。

这些发现符合所有其他答施加在内皮细胞的活动,需要FGF-2存在为了回应答在体外或在活的有机体内(3,4,7]。在这方面,答和FGF-2协同可能取决于FGF-2诱导的表达能力和整合蛋白,反过来,作为乙受体(3,4,7,40]。另一方面,乙可以维护FGF-2高度活跃,现成的形式,从而放大其生物效应(7]。

先前的研究表明,整合蛋白和生长因子受体之间的相互触发一个信号级联相关对内皮细胞的生存和生长25,28]。在这方面,必须提醒内皮细胞生存信号途径被激活时答绑定整合蛋白,是进一步提高当FGF-2存在于环境41]。在这种背景下,我们以前的工作表明,感应KS-like病变的结合FGF-2答是由结合FGF-2复制和integrin-binding答RGD肽(答65 - 80),但不是通过突变答KGE肽(4]。

同意这些发现,这里我们有报道,bcl - 2表达的诱导FGF-2和乙可防止死亡造成的内皮细胞粘附的抑制与ECM的交互。

,这些结果表明bcl - 2诱导的途径和分子机制,同时乙和FGF-2可以促进HIV-1-infected KS维护和发展个人。自答和FGF-2 AIDS-KS病变中表达和bcl - 2 (1,3),这些发现似乎生物相关性。

最后,正如bcl - 2转移血管细胞凋亡,延长他们的生存21,29日,30.,42),其表达先进KS,加上艾滋病毒对细胞增殖,HHV8,和细胞因子(1,2),可能导致KS维护和/或angio-hyperplastic KS早期病变的发展成真正的肉瘤。支持这个假设我们最近观察FGF-2和KS答可以增加细胞端粒酶的活性,使细胞酶逃脱复制衰老和无限增殖43,44]。

5。结论

我们的结果表明,FGF-2和hiv - 1乙在诱导bcl - 2表达和加强,这是伴随着不合时宜的内皮细胞的生存和angioproliferative病变的发展。这些发现表明管制的bcl - 2表达的分子机制中观察到AIDS-KS病变并确认bcl - 2可能代表KS的治疗干预的一个关键目标。

确认

这项工作是由意大利支持癌症研究基金会(FIRC)和意大利卫生部Ensoli。他们感谢太太Guendalina佛罗伦Luswergh(国家艾滋病中心)编辑援助。

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