使微粒印记，以实现腹膜转移的治疗渗入，通过高强度超声（HIUS）腹膜本地耐力

摘要

介绍。微纳米粒子具有亚微米大小、物理和化学特性的多功能性以及易于改变的表面，其独特的位置可以绕过人体的清除系统。尽管如此，纳米微粒子和纳米粒子出现了两个主要问题，限制了腹腔内应用。进行这项研究是为了评估HIUS是否能使微粒印迹，从而增强腹膜的穿透和局部耐力。方法。采用20千赫兹、70 W输出功率的高强度超声(HIUS)对新鲜死后猪腹膜组织标本进行不同时间间隔的超声检测。在应用HIUS之前，样品表面被铝酸锶微粒覆盖，然后通过电子显微镜进行分析。在冷冻切片上使用荧光显微镜测量组织内铝酸锶渗透和粒子分布大小。结果. 随着HIUS持续时间的增加（1对5分钟），在腹膜中检测到越来越多的铝酸锶颗粒。HIUS导致颗粒选择过程，主要增强较小颗粒的穿透，而较大颗粒穿透腹膜的时间较短。检测到的较小颗粒多达277个 μ.m±86μ.米到腹膜。结论。我们的数据表明，HIUS可以作为一种制备微纳米颗粒的腹膜组织的方法。在不增加应用物质的情况下，可以达到较高的组织穿透率和较长的局部耐力。需要进行更多的研究来分析HIUS在促进腹腔内药物应用方面的作用。

1.介绍

腹膜转移(PM)是一种常见的表现晚期胃肠道和妇科癌症。用于治疗PM的细胞抑制剂不会长时间留在腹腔内，而是迅速吸收到循环中，因为化疗药物的分子量特别小[1,2］.对于腹膜内给药，理想的药物应该在腹膜腔中保持活性的时间延长的时间。另外，全身性吸收和毒性应该避免。目前，大部分HIPEC，PIPAC，以及其他形式的腹腔内化疗的使用化疗药物的静脉制剂来完成。经典腹膜内化疗药物易受快速清除，表现出局部毒性，并且具有有限的穿透深度[3.］.纳米颗粒，与他们的亚微米尺寸的物理和化学性质的通用性，以及容易修改的表面，被唯一地定位于旁路人体的结算系统。尽管如此，纳米微粒子和纳米粒子出现了两个主要问题，限制了腹腔内应用。

第一个问题是，微米和纳米颗粒不容易穿透腹膜表面[4］.根据菲克扩散定律，液体化疗确实通过分子运动穿透腹膜。尽管已知腹腔内化疗(IPC)的抗肿瘤作用仍然受到化疗药物渗入腹膜组织小于1mm的强烈限制[5,6，至少有一些渗透到目标组织。

然而，微米和纳米粒子不会受到扩散的力。这些颗粒不容易穿透腹膜表面，因此都受到了腹腔内漂流。在这里，他们积累的某些热点和不腹腔内均匀分布[7- - - - - -10]. 微型和纳米颗粒的问题在于，尽管它们不像传统化疗药物那样需要快速清除，但它们对腹膜的渗透有限。此外，它们在腹膜内分布不均匀，目前无法靶向腹膜表面。由于与分子化疗药物相比，它们的尺寸相对较大，因此不受扩散力的控制，因此，不能保证与传统化疗药物相比，微米和纳米颗粒将与腹膜发生实质性的相互作用。

这些颗粒的化学成分已被尝试，目的是显著增加腹膜停留时间和延长暴露于化疗药物。这也将增加局部药物浓度，这是腹腔化疗的主要目标[11］.理想情况下，药物将被驱动更深的腹膜表面，增加它仍然是腹膜内也增加局部药物浓度的时间。我们称之为这个过程“印迹”。我们的研究将分析是否HIUS可以用来实现固体微米和纳米粒子的“印迹”到更深的腹膜组织层。

2。材料和方法

2．1.腹膜组织模型

实验在市售的组织样本进行。新鲜猪死后腹膜购（当地的猪肉供应商，Zerniki Wielkie，波兰）和切成比例的部分。Samples were then placed into Petri dishes, and NaCl 0.9% was added until the peritoneal surface was covered with 5 mm of liquid. Luminescent particles were purchased in the form of powder (strontium aluminate powder, Sigma-Aldrich/Merck KGaA, Darmstadt, Germany). The strontium aluminate powder was further ground with mortar to ensure that no residual large SA particles remained. Part of these grounded particles was subject to electron microscopy for quality control and size measurements. As the strontium aluminate is not soluble in water, a suspension was generated. For that, 500 mg luminescent particles were suspended in 3 ml of physiological saline solution (0.9%).

200年μ用巴斯德吸管滴下L的荧光微粒悬浮液在已被5mm液体覆盖的腹膜表面。接下来，使用超声器(Sonoplus UW 2070, Bandelin, Berlin, Germany)用金属笔将高强度超声(HIUS)应用到腹膜组织中心。笔尖距组织表面3mm以内(图)1(一)）.样本被分为3组，分别处理0、60和300秒。每次处理包含0.3秒的有源间隔和0.7秒的无源间隔，频率为20 kHz，输出功率为70 W，振幅为50%。

２.２.显微分析

治疗后，所有组织立即在液氮中冷冻。Cryosections (10μ.m） 从每个样本的不同区域制备。各部分均安装有延长装置™ 含1.5%的金防褪色贴片（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科学公司） μ.克/ ml的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染细胞核。发光颗粒的穿透深度是使用尼康Eclipse的80I荧光显微镜（Nikon仪器欧洲B.V.阿姆斯特丹，荷兰）测定。测量腔表面和发光颗粒的最内阳性染色之间的距离和在微米的报道。

2.3。粒子探测扫描电镜

将捣碎的发光表面颗粒样品置于玻璃探针上，并通过扫描电子显微镜（SEM）进行分析。样品被放在铝台上，然后干燥，撒上碳（15 纳米），并放置在扫描室电子显微镜中（Auriga 60，蔡司，奥伯科钦，德国）。所有样品均在等于2的束流电压下进行 千伏。发光粒子的三个立方面积为0.04 嗯²所有扫描均进行了粒度测量。

２.４.伦理批准与规范

部分实验是在商业可用的动物组织样本上进行的。所有方法都是按照波兰法律所适用的有关准则和条例执行的。根据波兰法律，获得了当地动物保护委员会的批准(Zapytanie 8/8/2019)。

2．5．统计分析

实验独立进行了三次。每个组织样本共8个组织切片接受了发光粒子穿透测量。

为了评估颗粒大小的分布，长度为200μ.每个组织切片（每个样品3个部分）中的m有待分析。Prism 7.0软件（GraphPad，La Jolla，CA，USA）分析数据。学生们t独立组分析采用-检验。一个重要的价值被认为是 。

结果

3.1。发光粒子的电子显微镜

对发光粒子的电子显微镜分析揭示了广泛的固体粒子尺寸。共有358个微米范围内的颗粒进行了尺寸测量。大部分粒子约为20-40 μ.(数据1 (b)和2（a））.明显更小的粒子(<10μ.m） 受到粒子静电力的影响，这些粒子聚集成砾岩和团簇（2B）。小于10的较小颗粒 μ.因此，M不是自由粒子。

３．２．体外实验

应用HIUS无并发症。应用HIUS后，对样品进行目视控制。然而，300秒后，发现腹膜变白和肿胀。荧光显微镜在三组中均检测到发光颗粒。对不同组织样本的显微镜分析表明，发光粒子的穿透深度存在显著差异。未处理样品中的发光颗粒留在腹膜表面，并沿着表面地形移动。HIUS后的组织穿透水平为42 μ.m±21μ.M(0秒)，92μ.m±42μ.M(60秒)，277μ.m±86μ.m(300秒)(图3.和4(一)）.随着HIUS持续时间的延长，穿透率显著增加(0秒vs 60秒) ）300秒 ）(图4(一)）.161luminescent particles (lp) were detected after 1 min of HIUS (111 lp with <5 μ.男，26 lp 5-10μ.M, 15压10-15μ.M, 8压15-20μ.M，无lp大于20μ.米），而在5分钟后，测定198个颗粒（113 LP与<5 μ.米，42 LP 5-10 μ.m、 23 lp与10–15 μ.男，16压15-20μ.6 lp > 20μ.米)(图4 (b)）.穿透腹膜的颗粒数量随颗粒直径的减小而增加(图)4 (b)）.特别是小于5的粒子μ.M可以更容易地通过势垒。超过50%的颗粒穿过腹膜小于5μ.m（图4 (b))后60秒和300秒的HIUS。然而，随着HIUS持续时间的增加(300秒)，较大的粒子大于20μ.M型开始穿透腹膜。

4.讨论

尽管抗肿瘤颗粒的开发取得了很大进展，但其治疗适用性一直很低。这些颗粒由于其高的抗肿瘤效力和高的细胞毒性，在PM的治疗中似乎很有前景。然而，由于它们分布在腹膜腔内，目前它们的使用受到限制。这些颗粒并不遵循标准液体化疗药物的相同机制。颗粒集中在不同的身体部位、器官和组织中[12,13］.这一直是这些粒子应用中的一个重大问题。例如，腹腔内应用更复杂的颗粒，如脂质体阿霉素，与表面的相互作用有限，部分吸收[4,14］.因此，应用HIUS可能是一种改善颗粒在腹腔内分布和吸收的方法。正如所演示的，直接压印可能是放置和确保这些粒子的局部耐力的一个机会。

我们的数据表明，组织样品的HIUS预处理增强了固体颗粒在腹膜组织中的印记。这种操作增加了颗粒的局部耐久力，否则这些颗粒就会被冲走或在身体的其他部位积聚。此外，该方法增加的穿透深度可以提高抗腹膜转移发展的肿瘤效率。HIUS预处理有潜力成为许多形式的IPC的新方法。然而，将这种体外方法应用于临床还需要进一步的研究。

一种解决组织穿透减少和粒子分布不均匀的方法可能是通过高强度超声(HIUS)将这些粒子准“印迹”到腹膜表面。这可以解决相对于分子大小的化疗而言，相对较大的粒子对组织渗透有限的问题。它还将禁止粒子的漂移，因此，减少粒子在热点上的积累。此外，纳米和微粒的团聚状态可能会显著干扰生物吸收[15,16］.尽管目前的研究主要集中在其对细胞摄取的干扰[17,18]，也可能对生物表面产生重大干扰。尽管纳米颗粒凝聚中的力与其表面能有关，也被称为范德华力[19]，固体微粒的粒子团聚与它们之间的静电能有关[20.］.HIUS可能是一种容易克服这些力的选择，因此，增加粒子与生物表面的相互作用，甚至可能更大的细胞对粒子的吸收。

目前还不清楚是粒子被积极地推入空腔，还是沉积物被HIUS和撕裂的形成带入运动。这两种机制也可能在粒子穿透中起作用。虽然最近关于HIUS对腹膜影响的数据已经获得，但许多技术方面仍不清楚。HIUS预处理的另一个可能的优点是减少了通过淋巴途径对颗粒的吸收。我们知道纳米和微粒在淋巴系统中积累[21］.HIUS还可以激活粒子本身，与周围表面相互作用，并释放其化合物，如最近所示[13]. 利用HIUS提高液体化疗药物渗透性的可能性已经被证实[22］.这种效应被推测归因于腹膜表面上的形态变化以及由HIUS [下层组织23］.然而，我们的研究没有评估颗粒清除或组织内耐力。与分子和更小的纳米颗粒相比，固体颗粒>1μ.m几乎不受扩散力和布朗运动的影响[24- - - - - -26］.

5.结论

HIUS通过改善微和纳米粒子与腹膜的相互作用，可能是微和纳米粒子IPC的游戏规则改变者。通过提高效率、局部药物可用性和增加腹腔内更复杂颗粒的耐受性，HIUS有可能显著影响微和纳米颗粒在PM治疗中的利用。结合新的药物配方和概念，HIUS可以提高局部给药的效率，改善众所周知的局部药物应用的局限性，如渗透力有限、耐力有限和局部浓度有限。

缩写

高度：	超热状况腹腔内化疗
HIUS：	高强度超声
IPC:	腹腔内化疗。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可根据要求从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者没有需要披露的利益冲突或财务关系。

作者的贡献

Agata Mikolajczyk和Tanja Khosrawipour对这项工作做出了同样的贡献。AM参与了研究设计、实验室分析和数据采集。TK有助于监督对手稿重要知识内容的研究、起草和批判性修订；马为起草和批判性修改手稿的重要知识内容作出了贡献；JK参与了研究设计、实验室分析、数据采集和手稿起草；MP对手稿重要知识内容的数据解释和批判性修订做出了贡献；MZ为研究设计和对手稿重要知识内容的批判性修订做出了贡献；JN为手稿重要知识内容的起草和批判性修订做出了贡献；VK为研究设计、数据分析和手稿起草做出了贡献。

致谢

这项研究是由机构资助的。

参考文献

1. M. F. Flessner，“腹膜内治疗中的运输屏障”美国生理学和肾脏生理学杂志号，第288卷。3，页F433-F442, 2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. R. L. Dedrick和M. F. Flessner，“腹膜给药的药代动力学问题:组织穿透和表面暴露”国家癌症研究所杂志，第89卷，第89期。7，页480-487,1997。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. G. Los, E. M. E. Verdegaal, P. H. A. Mutsaers和J. G. McVie，“腹腔化疗后卡铂和顺铂在大鼠腹腔肿瘤结节中的作用”，癌症化疗和药理学，卷。28，不。3，第159-165，1991。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. A. Mikolajczyk, V. Khosrawipour, J. Schubert等，“阿霉素脂质体在腹膜内加压气雾剂化疗(PIPAC)中的作用”，癌症杂志，第9卷，第5期。23，第4301-4305，2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. RL戴德里克，C。E迈尔斯，P。M邦盖和V。TDeVita，“腹膜给药治疗卵巢癌的合理药代动力学，”癌症治疗的报道第62期1，页1 - 11,1978。视图:谷歌学者
6. G洛杉矶，P。H穆萨尔斯，W。J范德维杰，G。s巴尔德，P。W德格拉夫和J。GMcVie，“腹腔化疗后顺铂（II）在大鼠腹腔肿瘤中的直接扩散：与全身化疗的比较，”癌症研究，第49卷，第3380-3384页，1989年。视图:谷歌学者
7. R. Liu, A. H. Colby, D. Gilmore等人，“纳米颗粒肿瘤定位、自噬体转运中断和延长药物递送改善腹膜间皮瘤的生存”，生物材料， 2016年，第102卷，第175-186页。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. S. Hallaj-Nezhadi, C. R. Dass和F. Lotfipour，“用于癌症基因治疗的纳米颗粒腹腔输送”，未来的肿瘤，第9卷，第5期。1，页59-68,2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. E. salvatrelli, M. De Tursi, P. Menna等，“术中高热腹腔化疗对晚期卵巢癌和腹膜癌病患者peg化脂质体阿霉素的药代动力学，”药物代谢与处置，第40卷，第5期。12, pp. 2365 - 2373,2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. a . Bellendorf, V. Khosrawipour, T. Khosrawipour等，“在猪模型中腹腔加压气雾剂化疗(PIPAC)中，扫描腹膜摄影显示不均匀的99mTc-Pertechnetat气雾剂分布模式。”外科内镜，卷。32，不。1，第166-174，2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. P. H. Sugarbaker和O. A.斯图尔特，“药代动力学腹腔纳米粒子PEG化脂质体阿霉素的患者腹膜转移，”欧洲外科肿瘤学杂志，第S0748-7983卷，第19期，第30380-42019页。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. J. W. Nichols, Y. Sakurai, H. Harashima, and Y. H. Bae，“纳米药物载体:外渗、瘤内分布及其建模”，控制释放杂志，第267卷，第31-46页，2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. J. P. M. Almeida, A. L. Chen, A. Foster, R. Drezek，“纳米粒子的体内生物分布”，纳米，第6卷，第2期5，第815-835，2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. A. Mikolajczyk, V. Khosrawipour, J Kulas等，“通过高强度超声从脂质体涂层中释放阿霉素”，分子肿瘤学与临床肿瘤学，卷。11，不。5，第483-487，2019。视图:谷歌学者
15. B. Halamoda-Kenzaoui，M. Ceridono，P. Urban等人，“纳米粒子的凝聚状态可以影响它们的细胞内化的机制，”《纳米生物，第15卷，第5期。1，第48页，2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. J. E. Skebo, C. M. Grabinski, A. M. Schrand, J. J. Schlager, and S. M. Hussain，“利用高照明系统评估金属纳米颗粒团聚、吸收和相互作用”，国际毒理学杂志第26卷第2期2，页135-141,2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. A. Bruinink，J. Wang和P.威克，“纳米毒理学颗粒团聚的影响，”档案的毒理学，第89卷，第89期。5, pp. 659-675, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. G. Pyrgiotakis, C. O. Blattmann, S. Pratsinis，和P. Demokritou，“通过原子力显微镜观察生物介质中的纳米颗粒-纳米颗粒相互作用”，朗缪尔，第29卷，第2期36, pp. 1385 - 1395, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. h·c·哈梅克，《球形粒子之间的伦敦-范德华引力》，自然史，第4卷，第10期，第1058-1072页，1937年。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. 1 .凯亚利，“影响吸入用药物和粘合剂混合物静电充电因素的综述”，国际药学杂志，第503卷，第5期1-2, pp. 262-276, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. Y. Xie, T. R. Bagby, M. Cohen, M. L. Forrest，“药物输送到淋巴系统:在未来癌症诊断和治疗中的重要性，”给药专家意见，第6卷，第2期8, pp. 785-792, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. V. Khosrawipour, S. Reinhard, A. Martino, T. Khosrawipour, M. Arafkas, and A. Mikolajczyk，“高强度超声(HIUS)后腹膜加压气溶胶化疗(PIPAC)中增加阿霉素的组织渗透”，国际外科肿瘤学杂志，卷。2019年，文章编号6185313，2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. a . Mikolajczyk, T. Khosrawipour, J Kulas等，“高强度超声对腹膜组织的结构效应:靶向腹膜转移的潜在载体，”BMC癌症，卷。20，没有。1，p。481年，2020年。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. G.梅特卡夫、M. F. M. Speetjens、D. R. Lester和H. J. H. Clercx，《超越被动》，应用力学进展，卷。45，第109-188，2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. 范德吉森和阿尔夫，应用力学进展，美国马萨诸塞州剑桥学术出版社，2012年第1版。
26. p . Dolez纳米工程，爱思唯尔，荷兰阿姆斯特丹，第1版，2015年。

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