评估乳腺癌利润使用水Quantum-Dot-Molecular探针体外

文摘

积极的利润一直是一个关键问题,阻碍了乳房,节约手术的成功。积极利润率的发病率估计范围从20%到60%。目前,没有有效的利润评估术中方法。这将是理想的如果有一个快速和可靠的乳腺癌利润率评估工具在手术室,必要时进一步手术可以持续减少re-excision率。在这项研究中,我们试图开发一个敏感的和特定的分子探针,帮助外科医生评估是否清洁手术边缘。独特的水的分子探针由量子点在我们实验室开发与抗体结合特定于乳腺癌Tn-antigen等标记。从肿瘤切除肿瘤裸体小鼠用于演示方法。AQD-Tn马伯调查证明是敏感的和具体的定量识别癌症领域不受组织的异质性。手术标本的完整性不受AQD治疗。此外,AQD-Tn马伯方法可以确定边缘地位在30分钟的肿瘤切除,指示其潜力作为一个精确的术中评价方法。

1。介绍

乳腺癌是女性最常见的癌症之一,美国和西方国家。估计有226870例浸润性乳腺癌和63300导管癌原位(DCIS)将诊断女性在2012年美国1]。乳腺癌是越来越多的在早期诊断(2)允许保留乳房手术治疗(BCS),只有肿瘤和少量的周围的正常组织中。多个临床试验得出的结论是,患者接受BCS用干净的边缘加上辐射存活率等同于那些乳房切除术(3- - - - - -6]。此外,发现每四局部复发在BCS患者,避免一个乳腺癌相关的死亡是避免(7]。此外,当地发病率和复发率较高患者积极或关闭保证金(16%)比那些消极的保证金(6%)(8,9]。积极和密切的利润率通常指利润在2毫米内癌细胞存在的表面切除组织。因此,最好是有肿瘤切除干净负利润率在第一次手术(10]。

当前BCS过程依赖于病理部门的利润率评估以确保完整性的肿瘤切除。只有病理报告完成后,最终确定手术边缘充分性。如果发现是积极的,保证金reexcision是必需的,这常常导致额外成本,更别说病人额外的痛苦。目前还没有实时术中快速方法,准确评估乳房肿瘤切除术的利润率的状态作为标准治疗。几个技术研究了包括总检查,联系准备细胞学(TPC) [11,12(FSA)[],冰冻切片分析13,14),射频光谱学(RFS) [15],断层扫描(TM) [2),拉曼光谱(RS) [16,17),每一个都有不同的限制在20 - 50%的假阴性诊断患者或延长手术时间18]。虽然RFS、TM和RS比TPC更加敏感,他们受限于组织均匀性的依赖。因此,他们不像乳房等敏感在异构的组织。是希望有一个方法,不受组织异质性的影响。

另一方面,分子成像越来越成为更受欢迎的作为fluorescence-guided手术工具由于其敏感性和特异性的肿瘤细胞(19,20.]。癌症的分子成像保证金需要特定癌症生物标记而不是正常乳腺组织。它还需要一个与组织自体荧光的荧光标签几乎没有重叠。它是普遍接受的,没有已知的独特生物标志物对乳腺癌疾病的动态特性。然而,对于利润的评估目的,乳腺癌生物标记不需要区分从所有其他类型的癌症,而是区分从周围正常乳腺组织。为此,肿瘤相关糖抗原(TACA)可能是理想的,因为他们只是与癌症有关但不是正常组织。最常见的一种TACAs Tn抗原(GalNAc -Oser / Thr),一个核心多糖与黏蛋白在癌细胞表面90%以上的人类上皮癌(21- - - - - -24]。Tn抗原形成由于缺少活动1 - 3 D-galactosytransferase和α2,6-sialyltransferase酶导致不完整的伸长O-glycan糖链(25,26]。它是一种截断的一个主要类型的糖基化(27,28]。Tn抗原存在于恶性乳腺病变,浸润性癌(29日,30.),和一些类型的公爵的增生等良性病变或非典型小叶增生(30.,31日]。Tn抗原在抗肿瘤疫苗的应用获得了关注众所周知在癌症患者产生免疫反应。(32,33]。从Konska等的研究。34),Tn抗原表达在导管癌的60% -80%的癌症细胞原位(DCIS)和20% -50%的癌细胞小叶癌原位。在浸润性导管癌(IDC) Tn表示在70%的癌细胞的阶段我癌症,在II期癌症,90% - -100%的癌细胞和40% -60%的癌细胞III期癌症。此外,Tn表示在20% - -70%的癌细胞浸润性小叶癌。Tn是统一整个肿瘤的表达34]。

纳米材料的最新发展提供了相当大的进步在特异性和敏感性肿瘤成像通过靶向对比剂(35,36]。量子点(量子点)半导体纳米粒子具有独特的发光性能。他们表现出荧光效率高,耐光漂白(37),与绿色荧光蛋白(GFP)的大小(38]。通过改变粒子的大小,同时可调,允许发射光谱成像不同的标记在同一病理网站(39]。Bioimaging量子点的应用包括细胞标记和追踪40- - - - - -42),细胞增殖43[],前哨淋巴结映射44),脑成像(45),分子信标进行DNA检测(46- - - - - -48),而在活的有机体内肿瘤检测(49,50]。量子点为特定目标成像,可以加上抗体来检测细胞表面的生物标志物。量子点可以作为标签的代理immunofluroescence-based化验。

最近的研究表明,量子点可以直接在水环境中在室温下(AQDs)限制配体直接到位(51,52]。这种AQDs的优点是,他们是能更稳定,更容易共轭。结合最近的一项研究的CdSe AQDs表明CdSe AQDs超过20倍更有效的蛋白质结合量子点比商业在一个有机溶剂(OQDs)和所需的配体、溶剂交流。此外,CdSe AQDs非常明亮的高量子产率(79%)。它也曾与700 nm长传球发射滤波器(51),因此没有什么如果任何组织自发荧光干扰(53]。这些属性使得CdSe AQDs好候选人作为分子探针的荧光标记。

本研究的目的是演示使用分子探针组成的Tn抗原的单克隆抗体加上CdSe AQDs图像边缘地位的人类癌症生长在裸小鼠。这种方法是分子特定、快速,不受组织的异质性,这使它有别于其他技术可用或正在开发。

2。材料和方法

2.1。细胞系,细胞培养

HT29人类结肠癌细胞系得到来自美国类型文化收藏,因为它是最好的特点Tn抗原表达在实体瘤容易获得和可再生的。HT29细胞行结直肠adenocarnioma,分泌癌胚抗原(CEA)、转化生长因子β结合蛋白和粘蛋白高水平的Tn anigen。标准的增长条件下,细胞形成一个多层的无极显示一个未分化的细胞表型(54]。因此,HT-29细胞是咄咄逼人。它们形成固体肿瘤在很短的时间(2 - 3周)比其他癌细胞系。5 HT 29细胞保持本人的媒介补充10%胎牛血清(Bioexpress Kaysville, UT)和1%青霉素和链霉素(Mediatech Inc .)、马纳萨斯,弗吉尼亚州)和培养37°C的5%的股份有限公司₂孵化器。

2.2。AQDs合成和接合

CdSe AQDs合成水性合成过程后由李et al。51,55与最优的MPA): Cd: Se率= 4:3:1。AQDs是共轭单克隆Tn抗原抗体(mAb) (Tn218 IgM Abcam,新泽西)直接肿瘤成像。的细节CdSe AQDs接合将发表在一个单独的出版物。

2.3。老鼠皮下异种移植

人类癌症HT29细胞收获通过使胰蛋白酶化汇合的t - 150细胞培养瓶。可行性验证是使用超过95%台盼蓝(Amresco,梭伦,哦)。这些细胞被resuspended 10⁶细胞每10μL (PBS、混合1:1与基底膜基质(BD生物科学,圣何塞,CA)。10μL准备混合物注入皮下注射在八周大的女性裸体小鼠平均体重20克。肿瘤被允许种植三个星期到达合适大小的研究。

2.4。Immunofluorescent染色

测试的染色能力AQD-Tn马伯共轭,HT29细胞种植在盖玻片在一夜之间,然后用4% paraformaldehyl固定15分钟。细胞与PBS清洗三次。细胞被封锁10%正常山羊血清非特异性结合的1小时在室温下。幻灯片然后用渐变/三羟甲基氨基甲烷缓冲液0.1%生理盐水洗净(TBS) 3次。AQD-Tn马伯复杂的添加和幻灯片是在室温下培养1小时。幻灯片和TBS洗3次与DAPI安装(安装介质与荧光、向量实验室、钙、美国)细胞核染色。在黑暗中样本存储在4°C。消极的控制样本没有主要的抗体。幻灯片是一个奥林巴斯BX51荧光显微镜下观察。

2.5。肿瘤切除和成像

总共12个裸体小鼠被用于实验。一个鼠标被用作负控制没有任何癌细胞注入。三周后注射小鼠安乐死。锋利的解剖与少量用于切除肿瘤周围的肌肉仍然附着在肿瘤。肿瘤是圆和定期在宏观的外表形状单焦特色。新鲜肿瘤立即处理与染色过程如下所述,体外成像和分析与新成像系统(流明XR,卡尺,CA)。首先,整个肿瘤的表面清洗和TBS出现在1%的牛血清白蛋白(BSA)解决非特异性阻断10分钟。接下来,肿瘤被撤BSA溶液和洗TBS去除BSA残渣。肿瘤当时沉浸在AQD-Tn马伯解Tn-antigen癌症细胞的染色。最后,TBS的肿瘤又洗了。 The tumor was placed inside of IVIS for acquiring images. Each image acquisition would take about 30 seconds to complete.

2.6。最优截止时间进行分析

找到最优截止时间,新鲜肝脏与TBS洗了两次2分钟,然后沉浸在1%牛血清白蛋白(BSA)为各种大量的时间。在TBS三次洗涤后,肝脏是沾AQD-Tn马伯复杂1小时在室温下。肝脏是悬浮在1% BSA溶液通过细线表面接触最大化。屏蔽解决方案不断搅拌帮助BSA的扩散到组织的表面。肝脏是又洗TBS和成像。最优截止时间确定后,染色时间评估开发最优利润评估过程对整个肿瘤。

2.7。整个鼠标成像

剩下一个肿瘤在一个鼠标。鼠标是安乐死和整个腹膜打开暴露在腹侧肿瘤和内部器官。在背侧方面,肿瘤被下面的皮肤。然而,由于肩胛周围的皮肤被暴露腹部,AQD-Tn马伯探针可以到肿瘤,即使它被皮肤覆盖着。尽管癌细胞注入皮下注射的鼠标,通过腹侧肿瘤入侵。几乎没有肌肉肿瘤表面。整个动物都沉浸在屏蔽解决方案然后AQD-Tn马伯探针悬浮液。所有的内部器官(如肺、肝、肾等)和肿瘤受到调查。这个实验是为了演示探针的特异性和敏感性肿瘤包围时许多正常组织。整个染色过程25分钟。 The mouse was then washed with TBS and imaged with the IVIS system.

2.8。干扰在手术标本的显微镜检查

检查方法与标准的潜在干扰病理过程,我们研究了10裸体小鼠肿瘤的关系。平均每个鼠标有一个控制肿瘤和两个AQD-treated肿瘤。总共17 AQD-treated肿瘤和10控制肿瘤进行了评估。AQDs-treated肿瘤是沾AQDs-probe节中描述2。6。控制肿瘤被AQDs-probe未经处理的。AQDs-treated和控制肿瘤的病理部门提交相同的常规病理检查。AQDs-treated肿瘤和控制肿瘤固定在10% formaline 12小时,然后嵌入石蜡。切成5块μ米部分表面的标本AQDs-treated肿瘤被AQDs-probe染色。两组部分(控制和治疗))和免疫组织化学染色(包含IHC)对8种不同的染色标记:Tn抗原,VEGF, MSH6,一种PMS2, p27、p53和ki67。解释了使用Aperio ScanScope XT包含IHC图像分析算法(fda体外诊断)和光学显微镜(奥林巴斯BX50)癌组件。

3所示。结果

3.1。Tn HT29细胞抗原表达

Immuofluorescent染色进行HT29细胞行验证QD-mAb复杂的功能。Tn抗原的表达很明显可以看到从图1(一)。AQDs没有抗体显示绑定HT29-cells(图1 (b))。这些结果表明,QD-mAb复合物选择性地绑定到Tn抗原蛋白。此外,AQD-Tn马伯复杂与Cy3-labeled Tn马伯,AQD-Tn马伯和Cy3-Tn马伯绑定到HT29细胞类似的模式,表明AQD-Tn马伯复合物功能(数据未显示)。

3.2。减少背景信号

自体荧光对荧光成像一直是一个挑战尤其是在组织与乳腺癌和肝癌等脂肪含量高。正常组织已知发射autofluorescent信号范围从380纳米到550纳米紫外线激发下(350 - 400 nm) (16,53]。在这里,我们试图建立一个明确的截止阀值单独的自发荧光背景信号和积极的信号。肝脏、肌肉和肾脏被用作正常组织(负控制)来评估背景阈值(图2)。在发射波长509 nm, autofluorescent信号可以观察到肝脏(图2(b))。尽管其他组织并没有显示出积极信号的图像,还有背景信号分析时进行。排放在610 nm,背景信号减少在所有的组织特别是肝脏(减少30%)相比,排放在509纳米(图2(d))。荧光强度阈值为400×10⁶可以作为单独的正常组织,因为所有的截止组织自发荧光背景低于这个水平。

3.3。协议开发

AQD-Tn马伯的总染色过程调查评估切除肿瘤边缘总结在图3。首先,肿瘤切除标本从病人和导向的缝合线。肿瘤与TBS洗然后堵塞1% BSA的解决方案。接下来,肿瘤从BSA溶液,洗涤和TBS沉浸在AQD-Tn马伯探针悬浮体染色。最后,肿瘤又洗TBS和成像两边用正确的取向。有两个主要步骤,影响AQD-Tn马伯的敏感性和特异性探针:阻断时间和染色时间。首先,截止时间是调查。不同的时间段进行,缩小至足够的截止时间15分钟。更小的时间间隔进行了研究,进一步缩短截止时间。如图4(一个),没有BSA阻塞导致强烈QD-mAb非特异性结合的探针肝表面的背侧和腹侧。随着阻断时间的增加,非特异性结合,达成降低饱和点10分钟。综合强度相似10分钟和15分钟的阻塞(数据之间的关系4(c)和4(d))。这也是在同一水平作为控制肝脏没有QD-Tn马伯探针接触(数据未显示)。因此,10分钟阻塞应足以防止非特异性结合

3.4。模拟术中评估

正如前面提到的,虽然肝脏和肾脏没有显示出积极的信号,他们仍有一些背景强度约为400×10⁶。因此,这是截止级别区分癌症和正常组织。最佳的染色时间15分钟(数据未显示)。切除肿瘤被分成三个不同的区域:肿瘤区域,肌肉,和肿瘤之间的重叠和肌肉或边缘地区。比较明亮的荧光图像场图像,我们可以看到明亮的黑暗绿松石蓝色区域(区域1的数据5(一个)和5 (b))与肿瘤和灰色区域与肌肉(区域3)。肿瘤明显确定的AQD-Tn马伯探针。AQD探针也是特定的肿瘤,而不是肌肉就是明证清白的肌肉。区域2更模棱两可的基于图像数据5(一个)和5 (b)。在背视图(图5(一个)),地图显示,地区2红色对应综合荧光强度小于400×10⁶(图5 (c))。这表明该地区的癌症细胞。同时,腹侧亮视场图像看起来像肌肉面积而荧光图像显示癌细胞的存在与定量荧光强度值为503×10⁶,表明该方法是敏感的和具体的检测小non-palpable病变。图片中的红色可解释为负区域(集成荧光强度小于400×10⁶)。

进一步证实癌细胞的存在与否在区域2的背侧和腹侧,肿瘤是嵌入在石蜡和使用这些区域的H&E-stained部分检查。图6显示肿瘤的方盒子的区域,每个区域由红线。背侧,正方形盒子包含所有三个regions-tumor,接口,和肌肉。与此同时,在腹侧方箱只由区域2和区域3由于区域面积较大,2是包含在图像。显然,背区域2(图6(一))只包含炎症细胞和成纤维细胞,这与红颜色在整个肿瘤检查表明消极的信号。癌细胞的存在观察腹圆)的部分地区2(图6 (b)),这证实了上述积极评价。结果表明,该方法是敏感的和特定的识别癌细胞的地区可能是错过了肿瘤切除过程中总检查。通过应用AQD-Tn马伯探测器信号的定量分析,正常的,和癌症区域可以在实时。

3.5。整个鼠标成像

为了进一步证明方法的能力,一个肿瘤的老鼠体内了。图7显示了背侧和腹侧鼠标的图片。肿瘤暴露在腹侧和背侧皮下。我们发现AQD-Tn马伯调查导致可视化领域的能力没有明显的肿瘤白光,因为肿瘤的外观是不容易区别于其他组织具有良好的荧光对比,表明高度特定的肿瘤靶向AQD-Tn马伯探针。积极的信号是强大到足以识别肿瘤表面的轮廓(荧光远远大于400×10⁶)。所有其他的器官没有显示出积极信号确认AQD-Tn马伯探针的特异性和敏感性。

3.6。干扰在手术标本的显微镜检查

我们检查了AQD-Tn马伯的潜在影响探针的显微镜检查手术标本通过提交标准治疗肿瘤病理部门处理。使用多个常规评价指标,我们发现没有区别)染色的AQDs-stained肿瘤和控制肿瘤。也没有区别IHC染色的各种标记:Tn抗原,VEGF, MSH6,一种PMS2, p27、p53和ki67 AQDs-treated肿瘤和控制肿瘤的各种标记。作为示例,图8显示)染色和ki67的包含IHC染色,p53和Tn的抗原控制肿瘤(图8(一个)(图)和一个AQD-treated肿瘤8 (b))。可以看到,没有区别的)染色AQDs-treated的控制肿瘤和肿瘤也没有区别ki67 IHC染色,p53, Tn抗原AQDs-strained的控制肿瘤和肿瘤。此外,量化成绩ki67的表达%的肿瘤和控制% AQD-treated肿瘤。p53表达,量化的成绩%,%的分别控制肿瘤和AQD-treated肿瘤。这个结果清楚地表明,AQDs-based评估方法不会干扰的标准手术标本的组织学检查。

4所示。讨论

众所周知,完整切除肿瘤是一个主要因素,妥协癌症患者的长期存活率。本研究提出了第一个示范的分子成像术中体外肿瘤边缘的评估。通过提供一个量化阈值水平,AQD-Tn马伯探针提供了外科医生能够在实时评估边缘地位,可能减少术后积极的边缘发现的数量,从而减少了需要第二个操作和局部复发的风险。AQD-Tn马伯有效识别癌症领域可以错过总值由当前视觉检查。此外,AQD-Tn马伯绑定具体癌细胞,而不是脂肪细胞和基质细胞通过组织病理学证实。

组织自体荧光是一种严重的背景噪音问题在任何荧光成像和可能导致假阳性。许多内生荧光生物分子的展品包括氨基酸、结构蛋白和脂质。他们排放最大值范围280纳米至550纳米(53]。上皮组织,如乳腺癌、内生荧光团的浓度可以表面上皮和底层之间的实质性基质导致强烈的自体荧光在脂肪组织和基质。在这项研究中,CdSe AQDs 610海里发射滤波器成像由于成像系统的约束。然而,CdSe AQDs探头可以与700 nm长传球排放过滤器,这将使信号AQDs进一步分离组织自体荧光,更高的信噪比,使QD-Tn马伯探针在未来更加敏感和具体。与此同时,与荧光团,AQDs可以用最小photobleach经历不断曝光,这常常会失去信号。AQDs允许方便处理探测器不需要一个黑暗的房间。

当前技术,如有线制导定位(WGL)可以进行术中肿瘤定位用积极利润率从23%至46%不等(56,57),不提供一个清晰的三维图像边缘的肿瘤(58]。超声引导切除仅限于超声可见肿瘤标本射线照相检测剪辑或钙化在肿瘤标本,但都是制定明确的利润有限能力可靠(59]。新开发optical-based成像技术似乎适用于术中成像由于其便携尺寸和低成本。例如,光学光谱方法由Wilke等人将光学图像转换为组织构成地图参数总血红蛋白浓度,β胡萝卜素浓度,和散射60]。MarginProbe方法(15)是一种近距离无线射频(RF)光谱装置,检测恶性肿瘤和正常乳腺组织的介电性能之间的差别。然而,这些方法依赖于内在的测量,如组织散射和组织的自体荧光,导致不可接受的假阴性率由于异质性较高的恶性和良性组织(15,17,61年]。目前AQD-Tn马伯调查并不依赖于组织的物理特性,但评估正常和肿瘤在分子水平上的差异。TACA Tn抗原被报道表示只在癌细胞和不正常的组织。使用这种癌细胞的分子签名,组织异质性不是问题上面给出的结果清楚地表明,AQD-Tn马伯探针能够显示非常小点组成的100年到200年癌症细胞。相比,这是一个关键优势最当前的开发optical-based成像技术,依赖于信号平均面积大,因此无法癌症在异构的背景图像。

总利润评估时间是最关键的要求术中优势地位的决心。FSA已报道有很好的敏感性和特异性肿瘤细胞,但对脂肪组织进行冷冻切片的困难导致增加手术时间和成本由于额外的病理评价(13]。FSA的最显著的缺点是无法评估整个表面积与采样率10 - 15%的表面积。使用antibody-antigen绑定机制,AQD-Tn马伯探针能够污点和识别癌症领域定量在不到30分钟,防止长时间的麻醉期患者。各方给外科医生的肿瘤评估癌症的确切位置。此外,不需要额外的术中病理评估来决定是否一个区域包含癌细胞。手术标本的操作没有影响手术标本的显微镜检查所示的干扰研究该方法的另一个优势。样品可以接受正常的组织学检查,利润率进一步确认及其他必要的标记评估。

在这项研究中,我们使用HT29结肠癌细胞作为肿瘤模型,而不是乳腺癌细胞系。HT29细胞Tn抗原表达强烈,没有任何需要的转染表达的蛋白质,作为验证了免疫印迹。因为这是一个概念验证研究,我们希望确保我们的肿瘤表达强烈的标志,这样我们可以控制方法的发展。此外,我们表明,AQD-Tn马伯探针能染色整个老鼠体内肿瘤局部一旦肿瘤表面暴露出来。虽然有积极信号在背侧皮下肿瘤,皮肤比较薄(小于1毫米)。2毫米的深度(考虑负利润率),没有观察到由于信号波长610纳米的穿透深度。我们将在我们未来的研究这方面的研究。鼠标内的肿瘤成像进一步表明AQD-Tn马伯探针非常敏感和特定的癌细胞。这可以作为一种工具来开发检查腔肿瘤切除后关于保证金的附加信息。

5。结论

总之,我们已经证明了使用分子探针AQD-Tn马伯评估表面切除人类癌症生长在裸体小鼠。AQD-Tn马伯分子探针由目标癌症特异性的抗体Tn-antigen癌细胞表面共价链接到CdSe AQDs。的优点CdSe AQDs作为癌症的分子探针的荧光标记,包括亮度、没有photo-bleaching,可以访问700 nm长传球组织自体荧光发射滤波器,减少背景。结果表明,AQD-Tn马伯是有效的肿瘤图像边缘在不到30分钟。组织异质性的问题是光学和electrical-current-based成像技术不产生影响AQD-Tn马伯成像由于其特定的绑定功能,允许更精确的评估。手术标本的完整性不受AQD治疗和没有差别的质量和强度标准)以及包含IHC染色。AQD-Tn马伯分子探针提供了潜力定量和准确评估保证金在手术过程中以减少reexcision率。

确认

这项工作由拨款支持国防部(DoD w81xwh - 09 - 1 - 0701)和Drexel-Wallace Coulter转化研究伙伴关系。

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