文摘
本研究探讨了antiskin癌症制定琼脂(FA)的影响昆布属植物digitata对二甲基苯并蒽(DMBA)诱发小鼠皮肤癌。琼脂是提取并制定(emulgel),生化特性和足总特征。的在体外细胞毒性的测试使用NTT 3 t3小鼠成纤维细胞。老鼠被分成5组:第1组担任控制老鼠,第二组老鼠视为DMBA-induced癌症控制,3组小鼠足总进行预处理(低剂量)+ DMBA-induced老鼠,4组小鼠足总进行预处理(高剂量)+ DMBA-induced老鼠,和组5积极控制+ DMBA-induced老鼠。癌症的行为和生化标记物明显减少组2 (DMBA-induced)老鼠,被带到附近正常的足总进行预处理小鼠(组3和4)。p53和角蛋白的水平明显升高在2组老鼠和老鼠这些水平下降3和4。DMBA-induced老鼠的组织病理学检查显示颈退化补丁在皮肤上,肝硬化的肝、肾组织水肿,肿胀和损伤的心脏组织,减少小鼠应用与足总。这证实了FA预处理提供潜在antiskin癌症财产。
1。介绍
在全球范围内,1810万新病例和960万例死亡是由于皮肤癌(1]。在印度,63%的死亡是由于非传染性疾病和癌症的主要原因,占9%。这些数据将在2040年增加近一倍;皮肤癌几乎是过分的恶性肿瘤等常见的癌症虽然不是十大常见癌症中排名(2]。有连续的皮肤癌的患病率增加,特别是皮肤黑色素瘤过去几年。尽管缺乏完整的流行率数据,不同的癌症阅览室在印度宣布增加皮肤癌的发病率从每100人0.5到2 000个社区(3,4]。手术和放疗是标准治疗癌症。但是,这些疗法的主要缺点包括损害正常细胞增殖指数高的。大多数化疗都有条不紊地分配,是正常细胞的细胞毒性;因此,癌症案例必须经过相当大的发病率。traditional-based局部抗癌天然药物管理局是一个迷人的反面增加药物指导和补救的好处5]。
二甲基奔驰(一)蒽(DMBA)是一种多环芳烃(多环芳烃),品牌作为一个有效的致癌物质和/或内分泌干扰物。多环芳烃在环境中广泛分布的结果不完全燃烧的化石燃料和其他有机分子和陆地和水生生态系统的常见污染物是6]。海藻有吸引力的来源生物分子如蛋白质、多糖、矿物质、维生素、类固醇和膳食纤维,是盈利的营养食品和制药应用程序资源(7]。最大棕色海藻是海洋来源的多糖提取全球(44 - 53%)。揭示出一些有价值的生物活性多糖及其衍生品在活的有机体内和在体外,包括免疫调节能力、抗癌、抗病毒、抗凝剂和/或抗血栓形成的属性。他们也证明了强有力的antidislipidaemic,那些抗氧化剂,抗生素和抗炎作用。以前,我们已经报道了抗氧化剂,抗凝,mosquitocidal间苯三酚的性质和一些水溶性多糖从印度棕色海藻(8,9]。但是直到现在,没有报告的抗癌活性FA从海藻(IP。E-101/17997 /过时01.07.2019)。因此,本研究旨在发现antiskin癌症的属性制定琼脂从褐藻(l . digitata)对DMBA-induced小鼠模型。
2。材料和方法
这项研究是依法进行的基本政策和临床药理学和毒理学实验和临床研究9]。
2.1。海藻收集
棕色海藻(l . digitata)收集Kanyakumari (Lat。8.0866 N和长。77.5544 E),泰米尔纳德邦,印度,在2018年12月- 2019年1月。收集到的棕色海藻物种被确定使用中央海洋渔业研究所(CMFRI)分类手册和公告。收集到的样本辛苦与海水和蒸馏水清洗,最后用蒸馏水洗净。处理过的海藻被影子干粉状,储存在-20°C深造。
2.2。提取琼脂
10 g的海藻粉样品转移到烧杯中,混合了100毫升的高纯Milli-Q水然后在121°C热压处理过的1 h水溶性多糖的提取。进一步,水溶性多糖Whatmann 1号滤纸过滤消除海藻碎片中提取,然后,这是离心机在5000 rpm 15分钟RT,过滤提取一直在RT和胶凝。胶凝样本干燥60°C一夜之间并存储在-20°C为进一步实验(10]。
2.3。制定琼脂(FA)
934年羧乙烯聚合物液化慢慢搅拌在60毫升Milli-Q水1 h逃避集聚。羧乙烯聚合物是三乙醇胺中和后用搅拌(5.6毫升)。其次是增加methylparaben(0.6克)和尼泊金丙酯(0.07克)和连续的搅拌直到培养基成分均匀,然后甘露醇(17.5 g),赖氨酸(0.88 g),甘油(8.75毫升)添加;最后,形成胶体琼脂(100克)制定的核心组成部分是补充道。混合物混合好,搅拌30分钟(电磁搅拌器,PCE分公司。印度),直到清晰一致的凝胶基础。制定琼脂是存储在一个密封的容器在冻结条件下(11]。
2.4。描述的足总
FA的感官特征,如颜色、纹理一致性,不育,和同质性,评估视觉检查。除此之外,一些物理化学特征也进行了分析(12- - - - - -16]。一式三份的数据代表的是决定。
2.5。傅立叶变换红外光谱的
FA的傅立叶变换红外光谱分析棕色海藻进行使用力量α仪器(美国)以4000到400厘米的范围130在沿扫描样本彻底和KBr混合,和光谱(8]。
2.6。微观结构的研究FA通过扫描电子显微镜(SEM)
足协的形态特征进行了研究与地产- 5600 LV扫描电子显微镜(JEOL、东京、日本)。干样品安装在一个金属存根,加速,在室温条件下拍摄的图像(200°C, 400°C, 600°C,和1200°C) 5.00倍的放大KX, 2.50 x 2.52 KX, 1.00 KX [17]。
2.7。MTT测定的
细胞MTT比色FA的可行性分析。刚培养NIT 3 t3细胞使胰蛋白酶化小鼠成纤维细胞系,收集、统计,播种在96孔板。24小时孵化后,细胞与不同浓度的FA治疗。然后,5%的细胞被孵化有限公司2在37°C 24 h。100年之后,μMTT添加l,潜伏期延长更多4 h。最后,介质被100人μl (DMSO用来溶解甲瓒晶体。样本在570 nm (Tecan多模多层板读者,奥地利)。如前所述(细胞毒性百分数10]。
2.8。在活的有机体内抗癌试验
皮肤癌是实验诱导女性瑞士白化小鼠获得的道德间隙(IAEC4 /建议:31 /。Lr: 13 /日期:20.12.18)。动物们被分成5组所表1。控制老鼠收到正常的食物和水随意。研究者用(100毫克/ 100毫升丙酮)治疗小鼠作为积极的控制。英足总被局部使用每周两次30分钟之前曝光了63天。物理参数测量肿瘤大小、体重、食物和水的摄入量实验小鼠组测量在整个实验周期。实验周期结束时,老鼠牺牲和皮肤、肝脏、肾、器官和心脏解剖,然后存储在-20°C下直到进一步使用。
2.9。测量实验小鼠的肿瘤
测量肿瘤的发展和FA在肿瘤发展的影响被评估使用游标卡尺。长度、宽度和高度的肿瘤测量实验期间天。
2.10。p53蛋白水平测量
测定小鼠皮肤组织和孤立的细胞p53蛋白水平估计通过使用鼠标p53酶联免疫试剂盒。
2.11。隔离和确定主要的角质细胞
实验小鼠的表皮被孵化孤立dispase 72 h,然后切成小块用消毒剪刀培养30分钟0.025% DNase在DMEM RT与温和的风潮。后来,混合物是100 mM细胞过滤器,过滤和离心分离的细胞颗粒状。3:1细胞resuspended定义的角化细胞无血清培养基含有适当增长补充剂,播种在盘子里之前涂有胶原蛋白,然后由光谱特征(18]。
2.12。胶原蛋白和弹性蛋白含量测定
真皮中胶原蛋白和弹性蛋白的数量是衡量使用Sircol化验设备基于天狼星红染色结合胶原蛋白的氨基酸的侧链。可溶性和共价交联不溶性胶原分数都通过连续治疗皮肤10卷5类型的缓冲区。胶原蛋白的提取与缓冲A和B是归类为可溶性胶原蛋白,提取与缓冲C, D, E是归类为不溶性胶原蛋白(19,20.]。
2.13。酶和非酶的评估
的水平减少谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT),以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)测定小鼠皮肤组织由利用σ的商业工具,美国。
2.14。组织病理学
皮肤、肝脏、肾脏和心脏的每组小鼠在10%福尔马林固定的苏木精和伊红染色())。串行部分的20μ米厚度切割和安装在幻灯片和染色。固定样本修剪和横截面切割和加工。样品在福尔马林和酒精的福尔马林固定,95%酒精,无水酒精,二甲苯,液体石蜡。横截面选择从每个样品3个盘子。显微镜下的形态变化检测(21]。
2.15。统计分析
所有的统计分析提出了利用软件使用SPSS软件(SPSS, IBM,版本20.0)。从所有的动物执行每个测试,所有的结果都表示为手段加减相应的标准差(SD)。的值 测量指定组之间的显著差异。
3所示。结果与讨论
3.1。提取率和足总
的琼脂收益率l . digitata被发现是40%。这被认为是最高产量相比以前的报告(22),这表明,琼脂产生从棕色海藻可以有所不同。收益率差异主要是由于物种,季节期间,和地理位置。具有成本效益的热水提取方法比较收益率成功开发了琼脂提取及其配方开发antiskin FA的癌症属性从褐藻(l . digitata)[23]。筛查新药从自然资源主要来自海洋环境发现抗癌活动是有价值的,因为他们可能更安全、健壮的和有效的。由于合成起源的代理人可能有各种各样的负面影响。天然产品已经被用作预防皮肤癌和其他传统疗法治疗。硫酸多糖(SP)从海洋来源进行调查,有良好的抗氧化,抗肿瘤,immunomodulating活动。建议,SP的药理作用,他们的理化性质,如良好的水溶性,增厚,和稳定性,pH值范围宽,为其使用提供额外的祝福作为防腐剂在局部应用产品(10]。
3.2。描述的足总
稳定性研究FA是必要的,以确保产品质量,疗效和安全性。因此,这些研究往往给的开发和改进配方,创造产品有效性和观察其物理、化学和微生物的特点。英足总提取l . digitata略溶于蒸馏水及其传播默许一个浅棕色,光滑的解决方案。英足总几乎不溶于极性和非极性溶剂如丙酮、氯仿、乙醇。稳定pH值等可能受到环境因素的影响,光、温度、空气、和运输,可能引起严重损害产品成分。英足总稳定性等参数没有颜色和气味的变化,一致性好,和同质性是光滑的,没有微生物污染。所有这些特性表明FA在表的不育2。FA的pH值仍然大量存储期间的风险被认为是足够的,以避免刺激皮肤。因此,在pH值没有变化;英足总凝胶可以适合局部应用程序。离心测试和振动测试的主要工具是估计和预测制定产品的货架寿命。从我们的数据,我们发现,英足总不显示任何迹象表明在研究期间相分离,这是符合安德拉德的发现等。24]。
3.3。纹理分析的
纹理分析(水分、硬度、粘性、内聚性和弹性)的足总表中描述3。足总被认为是高的纹理分析结果相比,莱西玛·[的结果23),提取琼脂用的热水从褐色海藻。纹理数据的差异可能是因为提取的方法,制定样品的性质。纹理分析是其中一个最重要的药品,因为它独特的检验标准提供重要的知识识别和感叹。特征与组内差异小,大组内的差异不同的纹理是一个重要的产品需求。在这里,我们探讨特征集中在这些技术标准在结构分析或重复申请材料审查。
3.4。植物化学的成分足总
FA的植物化学的成分包括粗蛋白量(3.79%),总碳水化合物(12.33%)、和元素成分组成的Ca (1.5%)、P (0.18%)、N (2.74%)、K(2.99%)、锰(16.50 ppm)、锌(50.40 ppm)、铁(30.0 ppm)、铜(75.41 ppm),分别和Co (3.00 ppm)。足总有点高的元素内容的以前的报告相比,Fleurence et al。25]。观察到的不同矿物的内容是由于物种不同量化和方法选择。FA赠款的矿物成分抗氧化,可能是部分负责其抗癌效果。矿物成分通常是由不寻常的环境和生理条件,提醒各种处理技术和矿化的方法。macrominerals例如钾、钙、钠、和Mg出现在海洋藻类在非常高的水平比土地来源。此外,铁和铜被报道在海藻高于菠菜和肉。多糖是棕色海藻的主要成分,占干重的40%。加载的热水提取琼脂生物量低分子量的水溶性多糖,(WSC)和不溶于水介质(10]。
3.5。结构表征
3.5.1。分析方法
英足总溶解在MilliQ水带来的齐次解之间的一系列波长扫描200和700海里,它显示最大吸光度在280海里。本研究的紫外吸光度是类似的结果阿齐兹et al。26),报道了水提取多糖美国muticum记录相同的紫外吸光度在280海里。紫外可见光谱法广泛用于原子的发色团协会调查被大力吸收电子转换。FA的紫外可见吸收光谱计算目前的研究显示在图中1。我们的数据表明有大量的吸收紫外线的地区,特别是最大吸收范围从280到350纳米。此外,有一个肩膀发现约280海里。
3.5.2。傅立叶变换红外光谱的
傅立叶变换红外光谱是一种很有前途的方法,FA和其他细胞的生化分析材料。它提供客观评估细胞的整体生物化学或制定样品已在生物医学研究的许多领域。FA的傅立叶变换红外光谱范围4000 - 500厘米−1描绘在图2。特定光谱的分析,获得的山峰被确定为碳氢键拉伸(烷烃)出现在3000 - 2850厘米的范围−1,- C = C -拉伸(烯烃)在1680 - 1640厘米的范围−1,碳氮伸展的范围1250 - 1020厘米−1贡献脂族胺,C = H弯(烯烃)在1000 - 650厘米的范围−1与标准相比琼脂。Sankar和Rhim et al。27]报道相似类型的傅立叶变换红外光谱分析进行两种褐藻美国属和红藻类g . corticata在4000年和500年之间的范围厘米−1。
3.5.3。扫描电镜分析
扫描电镜提供表面形态进化信息由于二维成核和汞齐在FA和吸附剂。SEM图像确认各种逐层排列FA山去。一步扩散加速度可以从这些影像检查。垂直的判决是高度足以区分一个原子层,而横向分辨率是2 - 100海里,根据表的外观和调度强度。制定材料的生物和自然来源作为一个主要的决定因素的基础上,颗粒形状、形态大小和形态。FA的SEM图所示3;定期展览,分层、修补和光滑,平坦的连续板的外观。它有一个不规则的几何形状有一定的差距表面上和松散叠加。这些属性可以给意义当考虑基于表面特征的应用程序。这些SEM照片显示英足总网络的结构。这种亲密的连接也可以协助制定产品的物理稳定性。在最近的一项研究比较金等。7)摘要研究存在于褐藻人类结肠癌的凋亡。在这项研究中,英足总从棕色海藻分数和评估与光滑、表面特征和结构形式复合平连续板的外观。
(一)
(b)
3.6。体外细胞生存能力研究(MTT试验)
的在体外细胞生存能力足总对老鼠NIT 3 t3成纤维细胞的影响进行评估。一组管理的细胞浓度高于300μg / ml方面表现出显著的死亡相比,对照组数据3(一个)和3 (b)。从这个结果,LD50FA 300计算μ克/毫升。丰塞卡et al。(28),报道的细胞毒性效应金盏花officinalis提取对UV-B-induced氧化应激在皮肤上。结果表明,500以上μ克/毫升浓度,观察细胞死亡。UVA和UVB影响皮肤表面,具有适度的拒绝了表皮的角质层和表皮黑色素全神贯注。相反,明显的卷径细胞壁可以激活DNA和破坏皮肤细胞,诱发皮肤癌。
3.7。皮肤过敏测试
英足总评估其皮肤刺激性的效果。甚至没有观察皮肤过敏后10天的研究,证明英足总可能是一个安全的材料。丹尼尔et al。29日)报道,对紫外线a防晒霜凝胶从红色algae-formulated产品没有显示任何皮肤刺激,印证了我们当前的数据。
3.8。生理观察肿瘤测量
实验小鼠表现出显著差异( )食物和水的摄入4(一)和4 (b)。水的摄入量明显增加( )老鼠DMBA后管理(集团二世(9)从3周)协会组我,II, III老鼠。后,附近的进水口变得正常与足总治疗后,小鼠组III和IV图4 (b)。第二组老鼠食物摄入量显著降低( )DMBA诱导后(周3 - 9),和附近的食物摄入量变得正常后局部治疗的小鼠组III和IV图4(一)。
(一)
(b)
在动物牺牲之前,没有老鼠死于完整的实验课程。从第三周开始,用DMBA诱发小鼠(组2)呈现明显的癌症的效果,如精神萎靡,反应滞后,缓慢的移动,持续九周。DMBA-induced老鼠的身体重量明显减少( )在第二组与对照组相比我(集团)和FA-treated团体(第三组(60毫克/毫升))和组四世(120毫克/毫升)老鼠图5。此外,身体第二组小鼠的体重明显降低( )相比其他组。
测量肿瘤长度、宽度和高度在第二组老鼠明显最大( )与第三和第四组(图比较6)。目前的结果证实吞咽et al。30.)研究指出,食物摄入量、水摄入量,体重测量,缺乏体育活动,生理变化,肿瘤测量身体成分中可能发挥重要作用。本研究结果表明,上述行为和检测到的变化是由于DMBA-induced小鼠皮肤癌,而这是英足总局部应用规范化的老鼠。
(一)
(b)
(c)
3.9。p53水平分析
p53蛋白水平在第二组老鼠表示高度显著( )与控制,这是相比显著降低( )其他治疗组的人物7。高p53蛋白的表达和p53改变已注意到在一个伟大的鳞状细胞癌的比例和癌变前的擦伤在肾移植接受者的情况。据报道,p53肿瘤抑制基因与细胞周期捕获和就职的程序性细胞死亡31日]。
3.10。皮肤角化细胞内容
在目前的调查,角质细胞被发现的重大损失DMBA-induced老鼠( )比控制老鼠。英足总管理第三和第四组显示显著改善( )在角化细胞诱导组小鼠相比图的内容8。表皮说遵守多态不断翻新的角化细胞大部分时间,和这个结构形式需要捐赠的表皮屏障自我保护的反应对各种环境因素(例如,冷、热、辐射、创伤,和微生物感染等等)。增加角质细胞的水平表明keratinocyte-connected皮肤疾病,CSC、带状疱疹、和牛皮癣32]。
3.11。在活的有机体内抗氧化酶水平
的在活的有机体内抗氧化防御系统就像土块,猫,GPx,谷胱甘肽在DMBA-induced老鼠表现出显著减少( )皮肤组织相比,治疗组的数据9(一个)和9 (d)。细胞生活在一个充满氧气的背景需要有效的细胞的发展策略来识别和消除自由基的代谢产物。据报道,这些影响显著干扰宿主的生理行为和代谢途径局部有界与动物的皮肤癌和皮肤或其相关疾病的变化(33]。结果显示显著升高( )活动的主要抗氧化防御酶SOD, CAT, GPx,谷胱甘肽样本的局部应用小鼠组(组III和IV)表明英足总可以增强抗氧化系统实验小鼠在皮肤上。特别是,谷胱甘肽的评估是一个重要的指标量化的抗氧化活性。谷胱甘肽酶可以遮住几乎身体的每一个细胞,具有强大的抗氧化和解毒的活动。谷胱甘肽不仅超越了自由基在活的有机体内也提高了抗扰度(34]。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.12。组织病理学分析
石蜡部分皮肤、肝脏、心脏和肾脏的实验小鼠在图表示10。从这个结果,退化宫颈局部皮肤组织(DMBA)集团的二世是多组我,III, IV, v,宫颈局部皮肤与皮肤癌退化的形成,然而,这些变化在皮肤再生颈的制定琼脂(第三组和第四组)治疗的老鼠。DMBA-induced小鼠肾脏显示水肿形成和治疗小鼠视为减少水肿。在心脏,肌原纤维倒塌诱导组,治疗组,展示了规范化肌原纤维。DMBA-induced老鼠表现出显著的肝硬化,这些变化是近规范化FA-treated老鼠。
4所示。结论
这两个在体外和在活的有机体内发现我们目前的研究显示,足总从棕色海藻可以作为一种强有力的antiskin癌症剂和抗氧化剂。所有这些结果似乎建议FA的预处理l . digitata有很大的发展的角度缓解DMBA诱导的皮肤癌。然而,需要找到确切的FA的作用机制,而权证广泛的生化和分子研究的必要性。FA的微生物负载和UV-induced皮肤癌活动从棕色海藻不分析在这项研究中,这可能是未来的测试。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从作者要求。
附加分
动物福利。动物使用遵守制度、国家和国际准则包括委员会的目的是控制和监督动物实验(CPCSEA),印度政府的指导方针。指南”指导实验室动物保健和使用的”(研究所实验动物资源,国家学术出版社1996;国家卫生研究院出版号码# 85 - 23,1996年修订)是整个研究的严格遵守。机构动物伦理委员会(IAEC)批准了这项研究。研究伦理间隙得到(IAEC4 /建议:31 /。Lr: 13 /日期:20.12.18)。
伦理批准
本研究不涉及人类参与者,人工材料,或人类的数据。这项研究涉及实验动物机构动物伦理委员会批准,Chettinad研究和教育学院(被认为是大学),kelambakkam 103年- 603年,泰米尔纳德邦,印度,和坚持委员会控制和监督的目的动物实验(CPCSEA),印度政府的指导方针。
的利益冲突
所有作者声明没有/或相互竞争的利益冲突。
确认
作者想要感谢各自机构的继续的支持。所做的技术和语言编辑编辑炼油厂,医学博士,美国是高度赞赏。印度作者欣然承认美国生物技术,科学技术部,政府的印度,新德里(BT / PR15676 / AAQ / 03/794/2016),为他们的财政支持。