影响根霉胞细胞增殖、凋亡、迁移MCF-7乳腺癌细胞和一种蛋白激酶信号通路

文摘

客观的。胞外多糖研究的影响根霉nigricans EPS1-1增殖,凋亡,MCF-7乳腺癌细胞的迁移。方法。MCF-7人类乳腺癌细胞体外培养和EPS1-1不同浓度处理。EPS1-1对细胞增殖的影响被CCK-8测试实验中,EPS1-1对细胞凋亡的影响是由流式细胞术。划痕试验是用来检测EPS1-1对细胞迁移的影响。免疫印迹是用来测量相关蛋白的表达变化的一种蛋白激酶信号通路。结果。与对照组相比,治疗EPS1-1显著降低扩散,迁移和入侵的能力MCF-7细胞和促进了MCF-7的凋亡细胞剂量依赖性的方式。底层机制而言,EPS1-1可以显著抑制一种蛋白激酶的磷酸化丝氨酸苏氨酸308 473,导致下游扩散基因的表达变化CCND1 p21, apoptosis-related基因bcl - 2、Bax和移民相关基因波形蛋白和钙粘蛋白的蛋白质含量。结论。EPS1-1可以抑制增殖、迁移和入侵乳腺癌MCF-7细胞和促进MCF-7凋亡细胞通过抑制一种蛋白激酶信号通路的激活。因此,EPS1-1可以作为潜在的新药物或辅助药物治疗乳腺癌。

1。介绍

乳腺癌(BC)是最常见的一种,世界各地的女性癌症死亡的主要原因。(1]。每年,大量的癌症相关的死亡是由公元前(2]。复杂的病因包括遗传因素和环境因素,如晚出生年龄,外源性激素摄入,吸烟,酗酒和肥胖,导致公元前的异质性3]。尽管先进的策略包括手术、化疗、放疗、激素疗法,和分子靶向治疗已广泛应用于公元前治疗近年来,公元前患者的预后仍然很差(4]。因此,开发新的有效的治疗药物是一个迫切需要解决的问题。

生物活性多糖已被广泛研究和应用于食品和医药行业由于其治疗属性和小的副作用。抗肿瘤活性(5),免疫调节活动(6),和抗菌活性7多糖的研究和生物化学和医学领域的应用。Yu et al。8提取一个胞外多糖,即EPS1-1根霉发酵肉汤的nigricans。研究表明,EPS1-1可以显著抑制肿瘤的生长和增加免疫器官指数CT26肿瘤的老鼠。同时,EPS治疗增加了作品的白介素2(2)和肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)在血清水平,以及增加的百分比CD8(+)细胞毒性T细胞在脾脏T淋巴细胞(总9]。EPS1-1也可以存在抗肿瘤活性和延长生存期小鼠S180肿瘤轴承(10]。此外,EPS1-1可以显著提高身体免疫力通过细胞免疫和体液免疫,增加吞噬作用的活动和酸性磷酸酶的生产不,2,TNF -α(11]。这些结果表明,EPS1-1可能成为新的肿瘤化疗药物或辅助药物。

在这项研究中,我们提取EPS1-1根霉发酵肉汤的nigricans据于(8),研究了其对扩散的影响,细胞凋亡,乳腺癌细胞迁移MCF-7和相应的机制。因此,这项研究提供了一个理论依据的临床应用EPS1-1作为一种新的药物或辅助药物治疗乳腺癌。

2。材料和方法

2.1。EPS1-1的提取和识别

EPS1-1跟着的提取方法报道Yu et al。8]。根据高效液相色谱的结果,EPS1-1由相关,男人,女孩,和FRU极性比率为5.89:3.64:3.20:1.00。

2.2。细胞培养和处理

人类乳腺癌细胞MCF-7细胞系和正常的人类乳腺上皮细胞(MCF-10A)从写明ATCC购买(美国)和培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基37°C和5%的公司₂。不同浓度的细胞被对待EPS1-1控制(0μg / mL)和治疗组(包括200μg / mL, 400μg / mL, 600μg / mL, 800μ克/毫升和1000μ在每个治疗组g / mL)。

2.3。CCK-8细胞增殖实验

从Dojindo购买CCK8工具包,日本。MCF-7细胞被播种在96孔板与约8000个细胞。在孵化器培养后24 h,上层清液被免职,含有不同浓度的培养基EPS1-1随后补充道。孵化后24、48和72 h, 10 ul CCK8试剂被添加到每个好,然后细胞连续37°C孵化器孵化一个适当的时期。之后,标仪是用来测量吸光度在450海里。

2.4。集落形成实验

细胞被收集、统计和播种6厘米培养板。经过2周的传统文化,这些细胞被固定与甲醇在室温下15分钟,然后沾1%结晶紫溶液10分钟来计算菌落的数量。

2.5。细胞划痕试验

MCF-7细胞被播种在孵化器6-well板和培养,直到细胞融合率达到95%。吸管的小费是用来画直线宽度为1毫米的熔融单层细胞在每一个。PBS的细胞被洗3次,和一个含有不同浓度的培养基EPS1-1随后补充道。后0、48和72 h文化、挠区域被拍到和细胞迁移率计算。

2.6。细胞凋亡以流式细胞术

MCF-7细胞被播种在6-well板和培养24 h,然后培养基含有不同浓度的EPS1-1补充道,和细胞连续培养48和72 h。一个单细胞悬液与胰蛋白酶消化后准备,根据指令,膜联蛋白V-FITC /π凋亡工具包(美国σ)和流式细胞术被用于检测细胞凋亡率。

2.7。Transwell化验

Transwell测试8.0执行μ与矩阵m Transwell板凝胶(美国康宁公司)。这些细胞被resuspended在200年μL血清DMEM培养基,添加到参议院Transwell。600μL DMEM培养基含有10%的边后卫是添加到众议院。经过24小时的文化,submembranous细胞被固定在室温下与甲醇10分钟和结晶紫溶液沾0.1% 15分钟来计算细胞数量。

2.8。免疫印迹

MCF-7细胞被播种在6-well板和培养24 h,然后,一个包含不同浓度培养基EPS1-1补充道,和细胞连续培养72 h。•瑞帕裂解缓冲提取蛋白质,蛋白质浓度由BCA法决定。20μg蛋白样本添加到每个电泳,其次是将蛋白质转移到膜、膜的堵塞和孵化项目主要和次要抗体开发前的形象。在这个实验中使用的所有抗体从Abcam购买,美国。

2.9。统计分析

SPSS 19.0统计软件是用于数据分析。结果表示为 ( )。与学生群体之间的差异进行了分析 - - - - - -测试或单向方差分析。每个实验至少重复三次, 表明该数据具有统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。的影响EPS1-1 MCF-7细胞的增殖

如图1(一)与对照组相比,EPS1-1显著降低MCF-7细胞的增殖活动方式存在剂量依赖的相关性。的抑制作用48 h和72 h是统计上的不同( 分别为357.2),当浓度大于600μg / mL, MCF-7细胞的增殖活性没有显著减少。因此,48 h和72 h被用作治疗时间在后续测试中,和EPS1-1的浓度范围从0到600μ克/毫升。我们还发现,当浓度小于600μg / mL, EPS1-1 MCF-10A细胞(图显示没有明显的毒性1 (b))。如图1 (c)与对照组相比,EPS1-1也显著降低的细胞集落形成活动MCF-7细胞剂量依赖性的方式。

3.2。的影响EPS1-1 MCF-7细胞的凋亡

如图2EPS1-1后,与对照组相比,治疗48 h和72 h, MCF-7细胞的凋亡率显著增加剂量依赖性的方式( )。上述结果表明,EPS1-1能促进MCF-7细胞的凋亡。

3.3。EPS1-1对MCF-7细胞的迁移的影响

如图3,与对照组相比,EPS1-1治疗48 h和72 h后,关闭MCF-7细胞划痕的比例显著下降,显示剂量依赖性的方式( ),因此表明EPS1-1可以抑制MCF-7细胞的迁移。

3.4。影响EPS1-1 MCF-7细胞的入侵

如图448小时后,与对照组相比,EPS1-1治疗,MCF-7细胞的入侵能力显著下降,显示剂量依赖性的方式( ),因此表明EPS1-1可以抑制MCF-7细胞的入侵。

3.5。EPS1-1在一种蛋白激酶信号通路的影响

72 h后与EPS1-1 MCF-7细胞的治疗,我们发现,与对照组相比,EPS1-1可以显著抑制一种蛋白激酶的磷酸化在苏氨酸(刺)308和丝氨酸(Ser) 473(见图4)。我们还发现所涉及的蛋白表达一种蛋白激酶信号通路的下游,包括扩散p21基因CCND1和,apoptosis-related基因bcl - 2、Bax和移民相关基因波形蛋白和钙粘蛋白,发现这些基因的表达水平受到影响的治疗EPS1-1(见图5)。

4所示。讨论

天然多糖由于其药用价值吸引了广泛的关注,尤其在癌症的治疗。许多多糖植物、真菌、藻类和细菌可以抑制癌症的发生和发展,如肝癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌。在这项研究中,我们提取EPS1-1根霉的发酵肉汤和研究其作用和抑制乳腺癌细胞的机制。

功能化验表明,EPS1-1可以抑制MCF-7细胞的不同的角度,具体来说,我们发现EPS1-1可以通过CCK8 MCF-7细胞的增殖抑制实验和集落形成试验。此外,我们表明,EPS1-1可以促进MCF-7通过流式细胞术和细胞的凋亡抑制MCF-7通过划痕试验和细胞迁移和入侵Transwell化验。因此,我们的结果表明,在乳腺癌细胞中,EPS1-1具有明显的肿瘤抑制活性,并且有可能作为一种新的药物或辅助药物治疗乳腺癌。因此,EPS1-1在乳腺癌的抗癌作用是一样的,在其他肿瘤之前报道(8- - - - - -13]。

先前的研究已经调查了EPS1-1在抗癌机制的应用程序。一方面,EPS1-1可能增加的产品白介素2(2)和肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)在血清水平,以及增加的百分比CD8(+)细胞毒性T细胞在脾脏T淋巴细胞(总9]。此外,EPS1-1可以显著提高身体免疫力通过细胞免疫和体液免疫,增加吞噬作用的活动和酸性磷酸酶的生产不,2,TNF -α(11]。在此,我们发现EPS1-1可以抑制一种蛋白激酶信号通路的激活。丝氨酸/苏氨酸激酶Akt(也称为蛋白激酶B或PKB)是一个protooncogene,起着重要的作用在调节各种细胞功能包括代谢、增殖、凋亡、迁移、和蛋白质合成。308年苏氨酸磷酸化Akt可能导致部分Akt激活,和473年丝氨酸磷酸化可以刺激完整的酶活性的一种蛋白激酶(14]。我们发现EPS1-1可以抑制一种蛋白激酶的磷酸化在这两个网站。CCND1 [15]和p21 [16]是一种蛋白激酶的因素与细胞增殖相关的下游。我们发现EPS1-1治疗后,CCND1的表达显著降低,而p21的表达显著增加。p21 CCND1能促进细胞增殖,抑制细胞增殖,这两个基因的对比反应在EPS1-1治疗解释在MCF-7 EPS1-1细胞增殖的抑制作用。bcl - 2和伯灵顿因素与细胞凋亡相关的下游一种蛋白激酶(17]。我们EPS1-1治疗后结果表明,bcl - 2的表达显著降低,而伯灵顿的表达显著增加。bcl - 2可以抑制细胞凋亡,而伯灵顿促进细胞凋亡,这解释了apoptosis-promoting EPS1-1对MCF-7细胞的影响。波形蛋白和钙粘蛋白是细胞迁移相关因素下游的一种蛋白激酶(18]。我们发现EPS1-1治疗后,波形蛋白的表达显著降低,而钙粘蛋白的表达明显增加。波形蛋白能促进细胞迁移,而钙粘蛋白抑制细胞迁移,这也解释了在MCF-7 EPS1-1细胞迁移的抑制作用。总之,EPS1-1抑制MCF-7细胞的增殖和迁移通过抑制一种蛋白激酶信号通路的激活和促进MCF-7细胞的凋亡,这解释了EPS1-1的抗癌机制在分子水平上。

本研究缺乏动物实验和临床实验和唯一的潜在价值和理论基础进行了探讨EPS1-1作为一个肿瘤抑制基因,因此有一定的局限性。

5。结论

在这项研究中,提取EPS1-1根霉发酵肉汤的nigricans,和体外实验证实,EPS1-1可以抑制增殖,迁移和入侵MCF-7乳腺癌细胞通过抑制一种蛋白激酶信号通路的激活,可以促进MCF-7细胞的凋亡。因此,这项研究提供了一个理论依据的临床应用EPS1-1作为一种新的药物或辅助药物治疗乳腺癌。

数据可用性

本研究中所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的中国浙江省自然科学基金(没有。LQ20H160017)和2019年嘉兴Medicine-Clinical实验室诊断的关键学科(2019年创新主题- cx - 03)。

引用

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