生物医学应用纤维素纳米晶体增强生物材料水凝胶的合成

摘要

通过甲酸水解和TEMPO-（2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基）介导氧化制备纤维素纳米晶（CNC），将所制备的CNC增强为生物高聚物壳聚糖（CHI）、海藻酸盐（ALG）和明胶（GEL），得到“CNC-ALG-GEL”和“CNC-CHI-GEL”水凝胶。使用傅立叶变换红外光谱（FT-IR）、扫描电子显微镜（SEM）、热重分析（TGA）和X射线衍射（XRD）对合成的水凝胶进行物理化学、热和结构表征分析。值得注意的是，如FT-IR分析所示，CNC的增强并未改变生物高聚物的分子结构。如热重力分析所示，CNC增强的水凝胶具有更好的热稳定性和相容性。物理化学、热和结构表征揭示了CNC和生物聚合物之间的相互作用和静电吸引。通过评估CNC的活性来研究其生物相容性L929成纤维细胞，具有良好的生物相容性和无毒性质。这些水凝胶可用于治疗性生物医学研究和再生医学应用。

1.导言

纤维素是一种天然的可再生生物聚合物。它作为一种丰富的有机原料，能够满足绿色和生物基产品的需求，发挥着关键的作用[1］．由纤维素制备的纳米纤维素材料，如纤维素纳米晶体(CNC)和纤维素纳米纤维(CNF)，由于其优越的生物相容性和良好的流变学和生物活性特性，在组织工程、生物医学应用和再生医学中受到了极大的关注[2］．

CNCs是棒状纳米颗粒，可从稻壳、麦秆、棉花和木浆等不同类型的丰富纤维素生物资源中获得[3.］．它的直径为2-20纳米，长度为100-500纳米。一般来说，通过硫酸、甲酸、盐酸、硝酸和磷酸等酸水解，可以从纤维素生物材料中提取CNC。然而，在所有酸中，甲酸是最可取的，因为它具有某些可取的能力，如腐蚀性小、可重复使用、易于回收和沸点低[4.]由于细胞毒性和免疫原性最小，CNC能够作为组织培养基中的细胞外基质，从而促进细胞生长和细胞增殖[5.］．的immense capacity of CNC for surface charge modification allows researchers to improve their hydrophilicity and stability and thereby enhance the bioavailability of CNC [6.］．高羧基含量的纳米晶体已被发现适合于药物传递应用[7.］．

在过去的几年里，许多研究人员试图开发提取方法制备CNC。许多研究人员已经开发了生物聚合物基材料，如水凝胶和支架，用于伤口敷料、生物医学应用和治疗研究。已经进行了一些广泛的研究，将CNC纳入/制造/注射到生物聚合物中，如海藻酸盐、壳聚糖、明胶、聚乙烯醇和羟基磷灰石[2那5.那8.-11］．Jeddi和Mahkam从CNC合成了纳米羧甲基纤维素，并将其纳入双层海藻酸盐-壳聚糖水凝胶珠中，成功地用作地塞米松受控递送的载体[12］．在另一项研究中，noutoume等人证明姜黄素和环糊精配合物与CNC具有抗结直肠癌和前列腺癌细胞系增殖的作用[13］．此外，根据Bertsch等人的研究，CNC在聚合物复合物中的存在增强了创面敷料的生理和流变特性[14]由于CNC卓越的机械性能，创新研究可以通过CNC的应用发展成人造器官，如血管、核髓和软组织[15］．在此基础上，本研究的目的是通过甲酸水解从纤维素中合成CNC，并将合成的CNC增强为生物聚合物壳聚糖、海藻酸盐和明胶用于制备水凝胶。在生物医学和组织工程应用中发挥重要作用的物理化学、结构流变性和细胞毒性特性被评估。

2.材料和方法

Low molecular weight chitosan (degree of deacetylation with 75–85%, 50–190 kDa), sodium alginate, ferric (III) chloride (FeCl_3.），甲酸，TEMPO（2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基），EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺）和溴化钠（溴化钠）购自Sigma，圣购路易斯，美国。在本研究中使用的所有其它化学品和试剂要么分析纯（AR）或保证级（GR）的。

２.１.纤维素纳米晶体的制备

采用甲酸水解法制备CNC，方法如下:Du等[4.].简而言之，3 在100%范围内添加1克纤维素 0.015毫升 M-FeCl_3.在一个球形烧瓶中装有90毫升甲酸。用磁力搅拌器(Heidolph Instruments, GmbH and Co.， Germany)将烧瓶保持在95°C下搅拌4小时。将烧瓶冷却到室温，然后使用离心机(Sorvall Legend XTR, Thermo Fisher Scientific, New Hampshire, USA)以8000 rpm离心10分钟。将得到的白色残渣用蒸馏水反复洗涤，直到pH值达到6。分离上清液后，使用冷冻干燥机(Lark，泰米尔纳德邦，印度)在−40°C下冷冻干燥72 h，并在4°C下保存，直到进一步分析。

用TEMPO和次氯酸钠(NaOCl)对得到的白色残渣纳米晶进行阳离子改性，方法如下:Akhlaghi et al.[6]。将1.5克纳米晶体加入到100毫升去离子水中，超声15分钟。在CNC悬浮液中加入20 mg TEMPO和400 mg NaBr。用1m NaOH将CNC悬浮液的pH调整到10。将10 ml 13%的NaOCl加入CNC悬浮液中，轻轻搅拌3 h，同时保持恒定的pH 10，即可启动氧化反应。加入等量的10 ml甲醇以熄灭反应，并用1 M的盐酸将pH调整到7。最后，使用14kda透析膜(Sigma, St. Louis, USA)对氧化的纳米晶体进行去离子水透析。由此产生的冻干纤维素纳米晶体被命名为“CNC”。

2.2.CNC增强水凝胶的制备

与CNC增强基于生物材料的水凝胶是按照Wang等人描述的以下方法制备。[16，稍作修改。将1%的CNC (20 ml)分别分散在40 ml的2%海藻酸盐和2%壳聚糖均质溶液中通过超声15分钟，分别命名为“CNC-ALG”和“CNC-CHI”。此外，将2%的明胶溶解在40毫升含有20毫克EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺的去离子水中，并在室温下连续搅拌24小时。本研究使用鱼明胶，其制备方法由Dara等人描述[17］．将含有EDC的明胶溶液加入CNC-ALG和CNC-CHI溶液中，然后加入0.5 ml 50 mM的ZnSO_4..将悬浮液连续搅拌6小时 在室温下进行离子交联。最后，用1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗所得水凝胶，并分别命名为“CNC-ALG-GEL”和“CNC-CHI-GEL”。水凝胶在4°C下储存，直至进一步分析。水凝胶的制备程序如图所示1．

2．3.粒径分布和Zeta电位分析

使用Zetasizer纳米系列(Malvern, Worcestershire, UK)，通过动态光散射分析(DLS)测定了CNC和水凝胶样品的粒径分布(PSD)和zeta电位。为了进行PSD分析，将CNC和水凝胶样品加载到路径长度为1 cm的石英试管中，进行DLS测量，检测角度为90° ．这 -根据散射强度测定并记录水凝胶的平均流体动力学直径和多分散指数（PDI）。为了分析zeta电位，使用0.45 μm注射器过滤膜，以去除大颗粒，并在25°C下以15°角测量。

２.４.FT-IR光谱和SEM形貌

使用FT-IR光谱仪（德国Bruker Optik GmBH）对CNC和水凝胶的FT-IR光谱进行了分析，范围为4000 厘米^－1–500 厘米^－1wave numbers at 4 cm^－1解析度。这surface morphology was examined using scanning electron microscopy (SEM JSM, Japan), and samples were observed at an accelerated 15 kV voltage.

2.5.X射线衍射（XRD）图谱

使用分析X’Pert Pro X射线衍射仪记录CNC和水凝胶的X射线粉末衍射图，X射线源为Cu-Kα辐射(40kv, 80ma)。样品的XRD谱图在2θ范围10°-80°在固定时间模式下，在室温下，扫描速度为4°min^－1．

2.6.热特性

到的分析之前，CNC和水凝胶样品在25℃和53％相对湿度下调理。使用热重分析仪（精工EXSTAR 6300，意大利）DTG（衍生物热重）和水凝胶的DTA（差热分析）进行了分析。样品were heated from 600°C, at 20°C/min heating rate, using nitrogen flow (250 ml/min). The（起始温度），(熔点),通过DTG/DTA曲线测定了水凝胶样品的(焓)。

2.7。流变学研究

使用Brookfield DV-III Ultra可编程流变仪(Brookfield Engineering Laboratories Inc.， Middleboro, USA)测量了CNC和水凝胶的流变特性(剪切应力和粘度vs.剪切速率)。采用锥板主轴(CP-41模型)，测量几何尺寸为5 cm，间隙为0.05 mm，剪切速率为10 ~ 100 s^－1通过使用稳态流动程序绘制剪切应力和粘度与剪切速率值的关系，获得了流动曲线。根据剪切应力剪切速率和剪切应力粘度数据的标准误差，选择Herschel–Bulkley模型作为最佳拟合模型。

Herschel-Bulkley模型方程为: 哪里是剪切应力（Pa），是屈服应力（Pa），是剪切速率（s^－1)，是一致性系数，并且 为流动特性指数(无量纲)。一致性系数(）及流动特性指数(）CNC和水凝胶的是由稳态流动程序软件来确定。

2.8.在体外退化

体外用酶解法研究了CNC和水凝胶的降解。取已知重量的水凝胶样品，在37℃下放入10 ml的PBS和10 U/ml的胰蛋白酶中，持续7天。定期取水凝胶样品的重量。

2.9。细胞毒性

根据Dara等人的方法，采用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)法研究了CNC和水凝胶的细胞毒性/生物相容性[18］．细胞的存活率计算，并按百分比（％）表示。

2.10。统计分析

单因素方差分析来分析数据。实验重复三次独立进行。一式三份的平均值之间的差异显著通过使用统计软件IBM SPSS 20（SPSS公司，伊利诺伊州，美国）Duncan的多重比较检验来确定。

3.结果与讨论

3.1.粒度分布和Zeta电位分析

粒径分布是决定其功能的最重要的特征特性之一，而zeta电位定义了在带电粒子胶态系统中分散的纳米晶体上的分散介质和流体层之间的电位差[10］．这 -表中显示了水凝胶的平均水动力直径、多分散性指数(PDI)和zeta电位数据1．这 -合成的CNC的平均水动力直径为192 nm， ζ电位为-48.40 mV。CNC的颗粒大小取决于几个因素，如用于水解的酸的类型，反应温度和反应时间[1］．在目前的研究中，formic acid was used for the hydrolysis, and the reaction time and temperature were 4 h and 95°C, respectively. The smaller particle size and higher zeta potential of synthesized CNC were most likely due to the improved dispersibility and conversion of hydroxyl groups to carboxyl groups on the biopolymer cellulose surface during the TEMPO-mediated oxidation process [19］．这 -结果表明，cnc - algc - gel和CNC-CHI-GEL水凝胶的平均水动力直径和ζ电位分别为415 nm和572 nm，分别为-61.6 mV和+16.9 mV。可以看出，CNC- algl - gel和CNC- chi - gel的粒径和ζ电位的变化代表了所加入的CNC、壳聚糖和海藻酸盐生物聚合物之间的胶体静电相互作用。cnc - al - gel的负ζ电位(-61.6 mV)表明羧基的存在，而CNC-CHI-GEL的正ζ电位则表明壳聚糖链的阳离子特性[18那20］．Further, the lowest zeta potential (+16.9 mV) of CNC-CHI-GEL might be due to the neutralization of amino groups on biopolymer chitosan that results from the separation from CNC and aggregation at the surface of nanocrystals [21]然而，用于表面修饰的生物聚合物的性质决定了表面电荷。在本研究中，CNC-CHI-GEL和CHI-GEL的正zeta电位代表了壳聚糖的阳离子特性，而CNC-ALG-GEL和ALG-GEL的负zeta电位可能源于壳聚糖的羧基海藻酸钠。CNC-ALG-凝胶的较小粒径可能是由于纤维素纳米晶体对生物高聚物表面的亲和力和吸附力更强。此外，纤维素纳米晶体的膨胀倾向于在聚合物链之间产生排斥作用，从而导致粒径增大[15］．可以看到，合成的CNC和水凝胶是单分散的，PDI较低(<0.5)。此外，通过扫描电镜对CNC和水凝胶进行了详细的形态学研究。从这些数据可以推断，由于CNC的加强，生物聚合物水凝胶具有很高的稳定性。

３.２．傅立叶变换红外光谱

通过FT-IR光谱分析，研究了CNC交联后水凝胶官能团的变化。CNC的FT-IR光谱在3334波长处有吸收带 厘米^－1那289.8. cm^－1, 1654 厘米^－1, 1427厘米^－1, 1315厘米^－1, 1150 厘米^－1,1030 厘米^－1，及897 厘米^－1，这可以归结为O-H, C-H, COO^-分别为O-H弯曲、C-O拉伸、CO-O-CO拉伸和C-H弯曲(图2)CNC的光谱数据与从稻壳中提取的CNC光谱数据一致[3.］．CNC的吸收波段的波数在1710厘米^－1可归因于TEMPO反应产生的羰基（C=O）拉伸[22］．CNC-CHI-GEL和CHI-GEL的特征吸收峰在 可分配给游离胺基（-NH₂）脱乙酰壳多糖分子的，而在另一方面，CNC-ALG-GEL和的吸收峰ALG-GEL 可能与海藻酸的羧基(-COOH)有关[5.].与这些报告一致，我们的发现与之前报告的zeta电位分析结果有很好的相关性。所有水凝胶的吸收带模式与鱼明胶的FT-IR光谱一致[17］．可以注意到，在 是CNC的羧基和生物聚合物的氨基之间复合物成功形成的标志。此外，在~1625 cm范围内，峰值的强度也得到了证实^－1在所有水凝胶样品中，通过重叠明胶分子的酰胺基，成功地将明胶链与生物聚合物水凝胶交联[3.]在Wang等人的另一项研究中，提到该区域的宽吸收峰（3200） 厘米^－1–2900 厘米^－1)的光谱说明了生物聚合物-明胶主链与CNC分子之间强烈的O-H键相互作用[16］．CNC的吸收带在~1425 cm的区域^－1和~1225 厘米^－1，强调了CNC与聚合物基体之间形成复杂的氢键间和氢键内键[23］．本研究的FT-IR结果清楚地表明，CNC的增强并没有改变生物聚合物分子的网络结构。

３．３．扫描电镜形貌

CNC和水凝胶的形态和微观结构如图所示3.．结果表明，CNC的表面形貌具有断裂表面的粗糙度。众所周知，纳米晶体的形态取决于用于反应的水解程度[4.］．在本研究中，使用数控的制备中的甲酸水解方法。ALG-GEL的SEM显微照片，CNC-ALG-GEL，CHI-GEL，和CNC-CHI-GEL显得很光滑，并且还显示出多孔结构相比CNC的显微照片，这表明该共混物的混溶性，高均匀性，以及原位溶解生物聚合物以形成混合混合物[22］．相比ALG-GEL和CHI-GEL在CNC-ALG-GEL和CNC-CHI-GEL凝胶平滑性和孔隙率的影响是很高的。值得注意的是，某些因素如用生物聚合物氢键和复杂CNC限定水凝胶膜的网络结构的形成[24］．CNC- algg - gel和CNC- chi - gel水凝胶中孔的均匀分布反映了CNC的嵌入特性，这是由于CNC与生物聚合物基体之间存在很强的界面粘附性。从技术上讲，水凝胶膜的粗糙度和平滑度取决于水凝胶中加入的CNC的浓度[9.]在本研究中，由于CNC的增强，水凝胶膜中的互穿网络很好地表明了优越的机械性能和良好的抗降解稳定性，这与早期的报告很好地相关[16］．此外，具有这些特性的水凝胶还支持其他特性，如易于注射和成本效益，更适合组织工程和再生医学应用[1］．

3．4．x射线衍射(XRD)图

如图所示4.， CNC显示三个纤维素特征峰在 那16.4°和22.5°，其中 归因于α -纤维素和半纤维素晶格的(200)平面反射[25］．的峰值 表明壳聚糖的半无定形性质，而在 表明海藻酸盐的无定形和结晶性质[5.那18].CNC的特征峰值在 出现在CNC- algg - gel和CNC- chi - gel中，表明CNC存在于水凝胶膜基质中。然而，该特征峰略有位移，结晶度的差异可能是由于分子间的相互作用。我们注意到峰值的强度在 相比CNC- chi - gel, CNC- algl - gel的渗透现象较少，这可能是由于CNC与海藻酸盐接触后的渗透现象存在差异[8.].峰值的强度 与CNC-CHI-GEL相比，CNC-ALG-GEL的结晶度有所增加，这是由于纳米晶体的穿晶效应。此外，CNC与生物聚合物基质之间的相互作用可能是结晶度增加的原因之一[9.］．然而，本研究的XRD数据表明，CNC的增强并没有通过改善聚合物基体的分子有序性、力学性能以及非晶态性质来改变水凝胶基生物聚合物基体的结构均匀性。

3．5．热特性

惰性气氛下20℃/min升温速率下水凝胶样品的DTG/DTA曲线如图所示5(一个)和5 (b)．热特性数据表明，所有的水凝胶样品都表现出三个主要的降解步骤。聚合物的热降解包括脱水、分解以及聚合物结构中内部和相互连接的断裂[26］．CNC的第一步降解是在50°C到300°C之间，这可能是由于聚合物结合的水的流失。第二次降解在300-360°C范围内，此时的最大降解温度为343°C。最后也是第三个降解步骤被发现大约在450°C。水凝胶algl - gel、CHI-GEL、cnc - algl - gel和CNC-CHI-GEL的第一步降解温度分别为82℃、67℃、75℃和68℃。水凝胶的最大降解温度分别为256°C、274°C、319°C和336°C。在生物聚合物基体中加入CNC后，水凝胶的最大降解温度几乎没有变化。说明由于CNC与生物聚合物之间的强相互作用，CNC保持了水凝胶的热稳定性[27].在200-400°C温度范围内，CHI-GEL和CNC-CHI-GEL水凝胶的显著重量损失可归因于壳聚糖通过脱乙酰基和糖苷键断裂而解聚通过脱水和脱氨，而在ALG-GEL和CNC-ALG-GEL的情况下，可能是由于褐藻酸盐的断链和开环反应[9.]。在第二个降解步骤中观察到最大重量损失，这可归因于生物聚合物的主链连接以及官能团的降解和错位[26］．水凝胶algl - gel和CHI-GEL的最后和第三个降解步骤分别是在472℃和619℃，而cnc - algl - gel和CNC-CHI-GEL水凝胶分别是在441℃和512℃。可以看出，CNC对水凝胶的增强降低了降解温度。这可能是由于CNC衍生物的分解，表明聚合物生物材料的碳化[28］．水凝胶之间降解温度和失重的差异可能是由于CNC与生物聚合物分子和交联剂之间形成氢键的差异[29］．

数据5(一个)和5 (b)和桌子2说明了（起始温度），(熔点),(焓)水凝胶。 那 那和聚合物共混物的（焓）通常表示结晶和熔融过程中发生的动力学障碍值为370°C，对应于糖基单元的分解和碳质残基的形成[30］．用CNC增强的CNC- chi - gel水凝胶具有较高的值相比，CHI-GEL的，而CNC-ALG-GEL是略微更小的比ALG-GEL。在通过Rescignano等人先前的研究中，有人指出，发现脱乙酰壳多糖并用CNC掺入藻酸盐生物材料的值分别为289℃，317℃，〔20］．在本研究中用CNC增强的壳聚糖和海藻酸盐水凝胶的温度分别为359℃和417℃。的差距值可能是由于壳聚糖、海藻酸盐和CNC在高温下形成的分子间氢相互作用。随着值超过高温时，生物聚合物会有捐赠氢键的倾向，导致产生更多的-OH基团，这些基团促进了更多的相互作用，影响了生物聚合物材料的熔化温度[8.］．此外，化学改性的CNC纳入生物聚合物影响 那由于化学改性的CNC和聚合物基体之间的强烈相互作用，这可能源于差异(6.］．值得注意的是，化学修饰CNC没有对任何影响生物聚合物(1］．水凝胶膜产生的另一个放热峰可能是由于海藻酸盐的分解以及明胶分子间结构的破坏[31]目前的数据表明，纤维素纳米晶体增强的生物材料水凝胶显示出更好的热稳定性和相容性，如热重分析所示。

3.6。流变学研究

不同类型的物理动力学或计算机流变模型，如Herschel-Bulkley、newton、Bingham、Casson和幂律，通常用于描述共混物和水凝胶的流动剖面，以描述剪切应力和剪切行为。Herschel-Bulkley流变模型由于其准确性而最受青睐。本研究采用Herschel-Bulkley流变模型对水凝胶溶液的实验结果数据(剪切应力和粘剪率)进行分析(见表)3.).屈服应力( )，流动特性指数( )，以及稠度系数(）并用流变仪提供的软件进行计算。屈服应力( ）表示生物聚合物中胶体粒子的相互作用势，对说明生物聚合物的大晶格结构具有重要作用[32］．流变Herschel-Bulkley模型显示了研究的水凝胶样品的屈服应力值(表3.).这个一致性系数( ）发现ALG-GEL和CHI-GEL的值分别高于CNC-ALG-GEL和CNC-CHI-GEL水凝胶的值。已说明分析方法和实验条件影响屈服应力[33］．一些研究将屈服应力的观点合并在一起，屈服应力可能与液体和固体状态以及/或两种具有不同粘度的相同流体之间的过渡相联系[34］．

algg - gel表现出剪切增厚和牛顿行为，而CHI-GEL表现出剪切减薄和假塑性行为，这代表了不可逆的结构破坏(图)6.)。ALG凝胶在低剪切速率下的牛顿行为以剪切速率无关粘度为特征。CHI-GEL的剪切变稀行为表明分子间连接被破坏，重整速率较慢，在较低的剪切速率下粘度会下降[35]。随着剪切速率的增加，CNC-ALG-GEL和CNC-CHI-GEL水凝胶的粘度趋于降低。这可能是由于水凝胶网络的分散性和脆弱性，这导致截留液体的释放，阻碍流动行为，从而导致粘度降低[36]这种非线性关系表示水凝胶的较高粘度，这是交联影响的一个强烈迹象[22]剪切变稀液体的粘度与剪切速率成反比关系，而剪切增稠液体的粘度与剪切速率成正比关系[37].假塑性对于静态条件下具有粘性的局部制剂很重要；然而，在较高剪切速率下，这种粘性倾向于降低，这导致更好的铺展性，并改善局部应用时特定物质的药物渗透性[11］．通过CNC对水凝胶的强化，CNC- algg - gel和CNC- chi - gel水凝胶的黏度与剪切速率曲线由于CNC域被剪切力破坏而转变为平台形状[38］．对于流动特性指数， 对于牛顿流体和 对于剪切稀化流体或rheofluid，而 用于剪切增稠或rheothickening流体。在目前的研究中，CNC-ALG-GEL和CNC-CHI-GEL水凝胶的值表明其具有牛顿和剪切增稠性质。这种转变现象表示CNC在海藻酸钠、壳聚糖和明胶中形成的网络结构，该网络结构由强氢相互作用构成，并最终保持粘度[39那40］．然而，增长的cnc - algg - gel和CNC-CHI-GEL水凝胶的值也是剪切增稠性质的指示[2］．数控钢筋基于生物材料 - 水凝胶表现出依赖行为，从流变学表征结果。

3.7.在体外退化

从第1天到第7天，algg - gel和CHI-GEL水凝胶的重量下降了50%(图)7.)．这说明，在各自的水凝胶样品中，大多数明胶含量易被酶降解。在水凝胶样品(cnc - algg - gel和CNC-CHI-GEL)中，从第1天到第7天，体重显著下降15%。在Wang等人的一项研究中[16]，使用海藻酸钠和明胶生物聚合物制备水凝胶；此外，发现不含CNC的水凝胶具有50%的重量损失，并且含有CNC的水凝胶具有显著的生物降解性。这种提高的酶降解性可能是由于均匀分散和疏水性[16］．据认为，CNC可能有助于在生物材料海藻酸盐、壳聚糖和明胶之间建立交联，并可以预期通过氢键和疏水相互作用均匀分布。文等人[41]开发了互穿网络(IPN)水凝胶，酶解2小时内失重25%。他们表示，与明胶混合的生物材料往往具有优越的力学特性，这是由于相互渗透的基质，这提供了良好的抗降解稳定性[41］．此外，结晶度和亲水性是影响降解速率的重要因素。此外，表面亲水性会导致降解介质和水侵入CNC的非晶态区域[42］．从降解的角度来看，CNC增强的生物材料水凝胶主要推荐用于骨和组织工程应用。

3.8.细胞毒性

这体外研究了CNC和水凝胶膜的细胞毒性L929通过MTT法检测细胞系，并在570处读取吸光度 nm评估细胞活力[43］．在这种方法中，生存能力较好L929培养24 h后观察成纤维细胞。根据GB/T 16886.5-2003 (ISO 10993-5:1999)，细胞活力大于75%的生物材料基水凝胶膜可视为无细胞毒性膜，推荐用于生物医学应用。algg - gel和CHI-GEL水凝胶的细胞活力显著高于CNC ( )．CNC增强CNC- algg - gel和CNC-CHI-GEL水凝胶膜的细胞存活率分别为96%和97%，显著高于CNC、algg - gel和CHI-GEL水凝胶( ）(数据8(一个)和8 (b))．

海藻酸盐和壳聚糖复合膜增强了海藻酸盐和壳聚糖的活性NIH-3T3成纤维细胞[16那24］．在由沙欣等人的另一项研究中，壳聚糖 - 藻酸盐 - 羟基磷灰石支架与CNC制造被发现具有100％的细胞生存力和希望的细胞生长和细胞粘附[5.］．在我们实验室之前的一项研究中，证实了聚乙烯醇/淀粉聚合物具有良好的生物相容性[44］．发现两性离子聚合物的力学性能和网络为细胞的生长和增殖提供了适宜的环境[23].活细胞与CNC强化水凝胶膜基质的相互作用通过物理生物化学和分子相互作用以及表面拓扑参数在生物材料膜的细胞相容性(如细胞粘附、分化、增殖和迁移)中具有重要作用[5.]此外，水凝胶膜的孔径主要由zeta电位控制，zeta电位使必要的生物活性分子得以运输并使细胞在水凝胶膜基质内迁移。在本研究中，CNC-ALG-GEL和CNC-CHI-GEL的zeta电位值与ALG-GEL a的zeta电位值大不相同nd-CHI-GEL，这可能是由于CNC的增强。TEMPO的表面电荷修饰也很可能是zeta电位值变化的原因。从先前的研究中注意到，CNC和明胶通过形成天然骨组织的模拟物促进细胞生长[45］．

4.结论

在本研究中，合成了CNC增强的生物高聚物水凝胶。CNC与用于水凝胶制备的海藻酸盐、壳聚糖和明胶之间涉及静电化学吸引、锌离子交联和分子间相互作用。这些生物高聚物水凝胶膜的特征为：能够物理化学和形态特性。表面电荷改性和CNC的增强增强了结晶度和抗降解稳定性。使用L929细胞系已经证实用于组织工程，药物递送，和生物医学领域中的应用及其性质的生物相容性。此外，拥有数控钢筋水凝胶能有效的细胞粘附，生长和增殖在我们的研究证明。然而，进一步的实验研究需要在烧伤创面，皮肤植入治疗数控钢筋作为支持生物材料的膜，这些水凝胶膜的适用性进行，在活的有机体内药物输送和组织移植。

数据可用性

手稿中包含了足够的资料。请作者提供更多的数据。

的利益冲突

不存在利益冲突。

致谢

作者对ICAR提供资金开展ICAR国家研究员计划下的研究工作表示衷心感谢。作者感谢印度喀拉拉邦科钦的icar -中央渔业技术研究所(ICAR-CIFT)所长为开展这项工作提供了设施，并批准发表从研究中获得的数据。提交人感谢喀拉拉邦科钦市icar -中央渔业技术研究所(CIFT) PA Jaya女士(技术官员)、P. Suresh先生(高级技术员)和N. Lekha女士(技术官员)为进行分析提供了技术支持。

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