在体外PHB/细菌纤维素生物复合支架的降解

摘要

本文报道了以聚3-羟基丁酸酯(PHB)、增塑剂和细菌纤维素(BC)为基料，通过熔融法制备生物复合材料，并通过热性能(DSC)、吸水率和体外降解测试。通过原子力显微镜(AFM)对生物复合材料的表面进行分析。将样品浸泡在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中20天后，通过失重和热性能(DSC)评估生物复合材料的体外降解情况。结果表明，BC能降低PHB的结晶度，促进PHB在PBS介质下的降解。此外，随着BC的增加，吸水率也增加。

1.介绍

聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)是一种在生长条件下作为细胞内储能材料而产生的细菌聚酯，具有良好的生物相容性和生物降解性。其结晶度、玻璃化温度、熔融温度、杨氏模量和拉伸强度与聚丙烯(PP)相似。此外，PHB对细胞没有毒性[1，部分原因是它在退化在活的有机体内到3-羟基丁酸，这是一种常见的生物代谢物[2］．然而，PHB本身并不能满足医学和组织工程应用中作为生物材料使用的所有技术规范，并且具有低熔体弹性和狭窄的热加工窗口[3.，这是由于其结晶度高，结晶域的熔化温度高。因此，将PHB与其他聚合物和添加剂混合是获得所需性能的良好策略。研究发现，纤维素纤维对PHA的增强使聚合物复合材料具有良好的机械性能(刚度、强度和韧性)以及较低的成本[4- - - - - -6］．

细菌纤维素(BC)主要由革兰氏阴性菌属的葡萄糖醋酸杆菌产生[7］．它是一种高度灵活的生物材料，用于治疗慢性伤口和烧伤，如人工皮肤或伤口敷料，获得组织工程用的人工血管和支架[8，9］．BC与植物纤维素的不同之处在于纯度高、结晶度高、聚合度高、抗拉强度大[10，11，吸水能力强[12］．在之前的一篇论文中，我们报道了通过熔融处理负载细菌纤维素和微晶纤维素的聚(3-羟基丁酸酯)和聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)的良好生物相容性[13］．

制备多孔支架的传统方法包括溶剂铸造/盐浸、相分离、凝胶铸造、沉淀、乳液冻干和静电纺丝等。目前已知的支架大多采用浇铸法制备，以PHB与羟基磷灰石(HAP)和聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基己酸酯)(PHBHHx)为基础，采用盐浸法制备[14]、细菌纤维素(BC)/聚乙二醇(PEG) [15]、聚丙烯酰胺(PAm)/羟基磷灰石(HAP)/聚乙烯醇(PVA) [16]、聚乳酸(PLLA) [17]、聚羟基烷烃酸酯(PHA) [18- - - - - -22]、聚己内酯(PCL) [23］．用于生产支架的聚合物应具有适当的表面化学性质，有利于细胞粘附，多孔结构，良好的机械性能，受控的降解速率，在生理条件下最好小于一年，生物降解性或生物吸收性，以及良好的生物相容性[24］．聚合物的降解速率可以通过在聚合物组合物中添加不同的组分，以及选择化学成分、分子量和加工条件来设计。在体外生物可降解聚合物的降解已经通过使用各种技术进行了大量的研究和监测，以评估失重、吸水、热性能和化学成分的变化[25，26］．

本文介绍了细菌纤维素的合成、熔融法制备PHB/BC配方，并通过表面检测、热分析(DSC)、吸水技术对其进行了表征在体外将标本浸泡在磷酸盐缓冲盐水(PBS， ）超过20天。

2.材料和方法

2．1．材料

聚(3-羟基丁酸酯)(PHB, T19级)，尺寸尺寸在0.5-50范围内μ购自德国的BIOMER公司。细菌纤维素(BC)由国家化学制药研究和发展研究所(ICCF布加勒斯特，罗马尼亚)合成。采用Sigma-Aldrich公司提供的柠檬酸三丁酯(TBC)作为生物增塑剂。氯化钠(NaCl)，尺寸在420-500范围内μM作为致孔剂。实验室制备磷酸盐缓冲盐水(PBS)培养基(pH 7.4)。

2．2.PHB/BC复合支架的制备

采用盐浸法制得PHB/BC复合支架[27］．PHB粉和BC粉重量分别为1%和2%，在Brabender Plastograph中，在180°C, 40rpm的转子转速下熔化6分钟。然后在熔融混合物中加入3%的NaCl颗粒，该过程持续至6min。每一配方在混合开始时加入增塑剂，使PHB与TBC的比例达到4:1。样品按组成分别标记PHB/BC1%和PHB/BC2%。PHB/TBC表示仅含PHB和增塑剂的样品。

加工前，PHB和BC分别在60°C和105°C烘箱中干燥过夜和2h。将熔融的生物复合材料用实验室压力机POLYSTAT 200在185°C和200 bar压力下压成薄膜，压模时间为5分钟。研究了采用盐浸工艺去除膜中NaCl的方法。

2．3.调查方法

2.3.1。处理行为

通过不同时间(6分钟和40转/分)的扭矩和从扭矩-时间Brabender图中获得的熔体粘度来评估塑化PHB和PHB/BC生物复合材料的加工行为。

2.3.2。微观特征

使用4000 SPM MultiView/NSOM原子力显微镜系统(AFM) (Nanonics Imaging LTD)评估支架的表面形貌。SPM图像采集在空气中，非接触模式(在0.1-10 nm的样品距离)。分析表面积为80μ米²，测量速度为12 ms/点。用于表面分析的针显示了Cr的峰值。分析使用WSxM 4.0软件进行解释。根据Selli等人的说法，PHB/BC生物复合材料的表面粗糙度表示为检测区域内垂直z维值的均方根(RMS)。[28］．

2.3.3。差示扫描量热法(DSC)测量

在熔融处理和降解过程后，使用量热计(metttler Toledo, Model DSC 823e, Switzerland)直接测定生物复合材料的热性能。熔化温度( ），熔化焓( ），结晶度( ）在Mettler Toledo公司的STARe 9.10软件的帮助下，从第一次加热扫描开始对所有样品进行了调查。结晶度((%))的测定公式如下: 在哪里为测量的熔融共混物的焓(J/g)，全晶PHB (146 J/g)的理论熔解热是多少为样品中PHB的质量分数。以PHB粉为对照样品。

2.3.4。水吸收

根据ISO 62标准，将圆形标本置于23℃蒸馏水中浸泡24 h、168h、336 h和504 h，然后测量支架的吸水率。将试件置于50℃烘箱中放置24 h，冷却后称量至质量恒定( ）准确度为0.1毫克。然后，将标本浸入蒸馏水中，在目标时期将标本从水中取出并重新称重( )．采用合适的公式计算平均吸水量: 在哪里为试样在mg中初始干燥后、浸没前的质量;为试样在mg中浸泡后的质量。

2.3.5。体外降解研究

在体外降解研究采用37℃磷酸盐缓冲盐水培养基(pH 7.4)浸泡，模拟人体生理培养基[29］．对降解后的干燥支架进行失重试验，取20 mm直径的圆形支架，称( ）并置于含2ml PBS的密封试管中保存20天。按照预定的降解间隔(即1天、5天、10天、15天、20天)，取出标本，用蒸馏水清洗，在37℃烘箱中烘干72 h，然后重新称重( )．退化程度通过失重评估来评估，使用如下公式[30.]： 在哪里和分别为水解降解前后支架的重量。

降解的支架也通过差示扫描量热法(DSC)来发现其热剖面的任何可检测的差异。

3.结果和讨论

３．１．处理行为

根据扭矩-时间曲线对所得共混物的加工性能进行评价，其表示为扭矩( ）分别在1分钟、4分钟和6分钟时，熔体粘度( )．

表格1结果表明，用熔融共混法可以方便地处理样品。当BC剂加入到塑化的PHB基体中，扭矩比塑化的PHB增加了4分钟。然而，经过6分钟处理后，生物复合材料与增塑PHB扭矩(即11-12 nm)及其熔化粘度(即0.27-0.3 nm/rpm)之间没有显著差异。这种共混技术的优点是它与传统聚合物加工方法的相容性，以及它不使用溶剂的事实。

３．２．AFM分析

AFM分析揭示了PHB生物复合材料的粗糙表面(图)1(一)- - - - - -1 (c))，可观察到许多孔洞和地形特征，其深度相对较高，峰的范围在100至700 nm之间。用AFM表征的样品的粗糙度列于表中2．

由于聚合物基体与纤维素的相互作用，随着BC的加入，PHB复合材料的表面粗糙度增加。这些结果与表中所报告的熔体粘度一致1．

3．3．差示扫描量热法

齐整PHB、塑化PHB、PHB生物复合材料的DSC曲线如图所示2．

熔化焓( ），熔化温度( ），及结晶度( ）的差示扫描量热(DSC)曲线3.．数据表示为 （ )．

表中数据3.揭示了熔融温度( ）PHB的含量随着增塑剂和细菌纤维素的加入而降低。因此，PHB/BC2%的生物复合材料表现出降低与纯PHB相比，在4.5°C。减少增塑剂的加入和BC在聚合物基体内良好的分散性是主要原因。一些研究表明，在PHB基体中加入增塑剂可以增加热加工窗口[31- - - - - -34］．此外，熔融焓( ）从纯PHB的90.3 J/g降低到PHB/BC2%的57.1 J/g，因此，PHB ( ）由61.8%降至51.4%。这可以解释为PHB与BC相互作用后，破坏了PHB链的规则性，导致结晶度降低。基于聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(PHBV)和各种纤维素纳米晶体的绿色纳米复合材料中也观察到了类似的机制[35， PHB/BC复合膜[36和PHB共混[37］．

3．4．水吸收

支架的吸水能力是衡量支架亲水性的重要指标，它会影响支架降解的速率以及细胞的附着[38］．

数字3.PHB/TBC及其相应的PHB/BC支架在四个时间段的吸水率。

PHB/TBC样品的吸水率非常低( ）在504 h，由于其初始结晶度高。PHB/BC1%和PHB/BC2%支架的吸水率高于PHB/TBC。BC的加入显著提高了聚合物支架的吸水率。因此，PHB/BC2%支架具有最大的水合作用( ）在168 h。这可能是由于在聚合物基体中加入BC导致PHB结晶度降低(降低)从表4)使得PHB链具有流动性，并由于酯键裂解而产生更多亲水羟基和羧基端基[25，37］．值得注意的是，支架在蒸馏水中浸泡168 h后，吸水率达到最高，在504 h的测试中吸水率保持不变。

3.5。在体外退化

3.5.1。减肥

PHB/TBC和PHB/BC支架的失重曲线随降解时间的变化如图所示4．

由于PHB共混物结晶度高，在整个20天的降解过程中，其重量损失可以忽略不计3.)．PBS培养液暴露1天，体重下降0.02%，体重缓慢上升，直到暴露时间结束时，体重下降0.2%。众所周知，PHB在生理条件下降解程度低，例如，PHB膜在PBS中孵育105天后，其重量损失约为初始重量的3.5% [37］．

数据图4说明生物复合材料样品中BC含量的增加导致其降解的增加。因此，PHB/BC2%支架表现出更高的重量损失( ）PHB/BC1%支架( ）在20天。这一行为与吸水试验一致(图3.)和结晶度下降(表3.)．

3.5.2。降解样品的DSC分析

采用DSC技术对PHB/TBC和PHB/BC样品的热参数进行了评价在体外在37°C和目标时间PBS溶液中降解(图5(一个)- - - - - -5 (d))．

熔化焓( ），熔化温度( ），和PHB的结晶度( ）由差示扫描量热(DSC)曲线计算的结果见表4．数据表示为 （ )．

表格4显示出……的总趋势与未暴露的共混物相比，PBS溶液对共混物的影响较小。熔化温度的降低( ）PHB/TBC混合物在降解过程中记录的温度从170.8°C到168.0°C，在PBS中暴露10天(166.9°C)时的值最低。PHB/BC1%和PHB/BC 2%的支架均降低从170.8°C到167.1°C。

结晶度( ）在20天内，PHB的含量呈增加趋势，PHB/TBC共混物的硬度更大，可能是由于增塑剂的损失。当样品的非晶态区域被侵蚀时，材料的晶体区域继续退化，由于其有序结构，晶体区域不太容易受到侵蚀[29］．因此，暴露于PBS培养基的所有混合物结晶度增加，这表明它们的降解性。事实上，长达20天，增加了在PHB/TBC(41.8% ~ 47.6%)、PHB/BC1%(40% ~ 46.9%)和PHB/BC2%(39% ~ 45.6%)样品中检出。这些数据与PHB共混物的重量损失有很好的相关性(图)4)．在暴露90天后，纤维素纤维增强的PHB的埋藏降解也显示结晶度增加(65%)[39］．

4.结论

目前的工作研究了细菌纤维素对热性能、吸水和在体外盐淋溶法制备的聚3-羟基丁酸酯(PHB)支架的降解。

结果表明，制备的支架具有良好的加工效果，表面粗糙度增加。

的在体外对生物复合材料在PBS培养基中20天的降解进行了研究，并通过评估失重和热性能来研究与未暴露样品相比所发生的变化。结果表明，所有样品在PBS溶液中浸泡20天后结晶度均有所提高，且与失重状态一致，表明样品在PBS介质中降解。

需要进一步的跨学科研究在体外PHB/BC复合材料的生物相容性和临床研究以及大规模生产细菌纤维素。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究由罗马尼亚教育和研究部CCCDI-UEFISCDI资助，PNCDI III (NonActivPans)项目编号PN-III-P3-3.5-EUK-2019-0237，合同219/23.12.2020。

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