水凝胶满载亚甲基蓝：吸附 - 解吸和抗菌光敏化研究

抽象的

制备了不同交联密度的葡聚糖接枝聚丙烯酰胺水凝胶作为光活化抗菌材料。通过估算MB溶液吸收最大值的变化，研究了水凝胶的吸附/解吸特性。MB在水凝胶中的吸附/解吸速率取决于水凝胶的结构。对光辐照材料的抗菌性能进行了测试金黄色葡萄球菌．结果表明，在亚甲基蓝色存在下水凝胶的照射能够消除细菌菌株。

1.介绍

细菌感染通常发生在烧伤，伤口和许多外科手术中[1]。微生物发挥在发展和病理学的维护至关重要的作用，以及伤口愈合或生物力学制备过程中它们的去除是治疗成功的重要因素。为了消除或减少细菌定殖，使用的是包括使用高剂量的抗生素的方法。抗生素是基本上是成功的，但可能会导致细菌的抗生素耐药菌株的发展。细菌的不同表面上消除一个新颖的方法是使用一个光活化抗微生物剂（LAAA）2那3.]。

光活化的抗微生物剂在兴奋时用适当波长的光，即用红光，产生单向氧和/或基团，对细菌具有高度细胞毒性[4.那5.]。来治疗或预防感染性疾病中的用途LAAAs被称为光动力疗法（PDT）[6.]。

LaAAS通常是无机或有机染料，如亚甲蓝（MB）。封装在聚合物中的LaAAs已经显示出对广泛的致病细菌表现出抗微生物活性[7.-9.]。用于将LaAA封装成用于医疗应用的弹性体的方法包括将聚合物浸入含有能够溶胀基质的溶剂的LaAA溶液中;在此阶段期间，溶液穿入承载LaAA的弹性体中。

水凝胶是具有三维聚合物网络既具有固体和液体扩散运输的机械性能的水可溶胀的材料。他们有微孔和弹性，提供他们的持水性和溶胀能力。这些特性制备的水凝胶有前途的生物医学应用[原料10.]。最近，基于多糖的水凝胶已经得到了在药物递送系统的吸引力和敷料材料由于其非凡溶胀性能，生物可降解性，生物相容性，无毒性和[11.]。

在我们最近的研究中，我们报告了一类聚丙烯酰胺水凝胶[12.]是由PAA的星形支链共聚物与多糖交联而得到的。结果表明，葡聚糖接枝聚丙烯酰胺(D20-PAA)水凝胶与线性聚丙烯酰胺水凝胶相比具有一定的优越性。D20-PAA水凝胶可以被设计成在水介质中具有最佳的水或生物流体含量，良好的力学性能，形状稳定，柔软程度与周围软组织相似。考虑到水凝胶用于创面敷料的实际情况，本工作尝试制备水凝胶/MB复合材料并研究其抗菌光动力效应。单色可见光在 由于被用于对人体组织，刺激再生过程的能力[其最小的负面影响13.]。

2.材料和方法

2.1。水凝胶合成

葡聚糖 - 移植物 - 聚丙烯酰胺（D20-PAA-X）水凝胶（图1)与不同浓度的交联剂( ;0.4和0.6重量。%)。水凝胶的合成在我们以前的工作中有描述[12.]。作为前体，我们使用由Sigma-Aldrich丙烯酰胺（AA）。葡聚糖（D20）与 g/mol，铈(IV)硝酸铵，N,N -从Fluka购买亚甲基双丙烯酰胺（MBA）和亚甲基蓝（MB）。所有供应的试剂都是分析级的，它们被使用而无需进一步纯化。所有带水凝胶的程序都在去离子水中进行。

D20-G-PAA-х水凝胶通过自由基聚合使用可如交联剂MBA [的存在下引发剂制备14.] （数字1)．The calculated amount of dextran (0.02 mM) was dissolved in 25 mL of distilled water at 25°C. This solution was purged by argon bubbling for 20 min, and then, initiator CAN (0.03 mmol) was added. In 2 min, AA (0.05 mol) and MBA (0.28, 0.4, or 0.6 g per 100 g of monomer AA) were poured into the reaction mixture. The formed hydrogel samples were taken out from the flask in 24 h, washed with distilled water to remove unreacted monomer. Finally, the gels were dried at ambient temperature.

2.2。残留丙烯酰胺的测定

为了控制水凝胶残留的AA的量，使用高效液相色谱法（HPLC）。水提取液用的Waters Alliance HPLC系统带有二极管阵列检测器进行分析。列NUCLEOSIL C18（ ）设置在20°C的温度。检测在波长为210nm的波长下进行。甲醇/再蒸馏水的比例90/10的混合物  用作流动阶段，流速为1毫升^-1．用于确定AA的内容校准曲线通过制备一系列已知浓度的溶液构成。

２.３.亚甲基蓝负载水凝胶的制备

亚甲蓝成水凝胶的加载量由亚甲蓝水溶液溶胀的水凝胶的饱和度进行。The dye concentrations were 0.0001 and 0.001 wt. %. Samples of 将固化的水凝胶立方体(约1g)浸入MB溶液中12小时。交联共聚物网络内部结构及染料化学结构如图所示2．

2.4。紫外 - 可见光谱

在吸光度模式（范围为200-1000nm）的λ55uV-Vis分光光度计（PerkinElmer，Ca）中测量吸光度，在亚甲基蓝色的吸收最大值（ [15.])。在这种情况下，吸光度越大，染料浓度就越高。染料在溶液中的浓度不超过 wt。％，以防止该染料的二聚化和吸收的附加最大的外观。All optical spectra were acquired using quartz cuvettes with a 1 cm path length.

2．5．染料吸附与解吸的动态研究

染料扩散到水凝胶（吸附）的动态研究是通过估计在最大吸收MB溶液的变化进行的。

为此，将直径为7 mm的水凝胶样品放入亚甲基蓝水溶液( wt。％）。The mass ratio of hydrogels and solution in all experiments was 1 : 4. In 10 min, the absorbance of the solution of nonabsorbed dye was measured. Further measurements were carried out at time intervals of 10 min for 150 min until the equilibrium concentration of the dye in solution was reached. The concentration of the nonabsorbed dye was determined by the calibration curve, and the amount of dye absorbed by the hydrogel was concluded (Table1)．

类似地研究了亚甲基蓝色的扩散。在这种情况下，将用MB的水凝胶样品置于蒸馏水中。所有实验中的Mb水凝胶和水的大量比例为1：4。所有水凝胶中的染料初始浓度是 wt。％。在10分钟内，测量解吸染料溶液的光密度。进一步测量在10分钟的时间间隔中进行150分钟，直到达到溶液中染料的平衡浓度。通过校准曲线测定解吸染料的浓度。

为了分析染料的吸附和解吸速率（V），该染料浓度的溶液VERS时间一阶导数来计算。为了这个目的，实验依赖性线性化在对数坐标：时间（LN ）更小的吸光度(ln ）按线性规律拟合;所得到的依赖斜率与染料扩散速率相对应。对线性范围的轻微偏差不超过实验允许的误差。

2.6。抗菌研究

LED（Photonics Plus，Cherkasy，乌克兰）带有波长的激光发射器（ ）为660 nm。100mw激光照射20、30和40分钟，能量密度为21 J/cm²那3.1。5. J/cm²，42.1 j / cm²， 分别。

在悬浮液中研究了红光激活的亚甲基蓝的抗微生物活性S.金黄色葡萄球菌（10.^5. CFU/mL). A suspension ofS.金黄色葡萄球菌（10.^-5 CFU/mL) was prepared in a nonagar Müller-Hinton medium. 3.8 mL aliquots of the suspension were placed in tubes; then, 0.2 mL methylene blue solution of 0.02% wt. % was added into suspension and incubated at 37°C throughout the experiment. Both suspension ofS.金黄色葡萄球菌和悬挂S.金黄色葡萄球菌用100 mW激光(660 nm)照射亚甲基蓝3分钟，产生0-18 J/cm的能量密度^3.．每次试验都与对照进行比较，因为每1-3小时，细菌就会增加一倍，其数量也会增加一倍。以相对于对照样品的CFU死亡百分比来评价其杀菌效果。

负载亚甲基蓝(0.0005 wt.)水凝胶的抗菌活性。%)在悬浮中S.金黄色葡萄球菌（10.^5.CFU /毫升)进行了研究。将水凝胶样品按水凝胶质量比放入细菌悬浮液中: ．120 min后，溶液中MB的平衡浓度为 重量。％。Further irradiation with light (660 nm, 100 mW) with interval of 20 min and an energy density of 6 J/cm^3.进行了。以相对于对照样品的CFU死亡百分比来评价其杀菌效果。

采用圆盘扩散法研究了水凝胶的抗菌活性。野生菌株的金黄色葡萄球菌作为革兰氏阳性菌模型。在电培养基“蛋黄盐琼脂”上获得野生菌株[16.]。所选择的菌株对的光和亚甲蓝的作用的敏感性固体培养基上进行。的悬浮液中的细菌的（大约10^5.CFU/mL)，然后在培养皿中均匀涂于Müller-Hinton琼脂上。

培养皿被分成以下简称为1，2，3和4的四个扇区：用于控制（1）中，照射光（2），用于水凝胶用亚甲蓝（3）饱和的，和用于水凝胶用饱和亚甲蓝和光（4）照射。The hydrogel samples and their composites with MB were cut to 5 mm side squares and placed on Petri dishes with agar. Then, sector (2) and sector (4) were irradiated with light ( )．将琼脂平板置于37℃的孵育烘箱中，并留下24小时。

通过分析生长延迟的直径来评估MB负载水凝胶的抗微生物活性[17.]。Determination of colony-forming units (CFU) in bacterial suspensions was performed in the Goryaev chamber after staining an aliquot of the suspension with Acridine orange with a final dye concentration of 0.001 wt. % [18.]。CFU was determined using luminescence Acridine orange at a wavelength of 530 nm.

所有实验均以三份进行，并报告平均值。

3。结果与讨论

3．1.吸附/解吸动力学研究

亚甲蓝成水凝胶样品的扩散速率是通过在最大吸收的MB溶液到其中的水凝胶放在改变的研究。在该溶液的吸光度的降低表明在染料的浓度降低，因此，在水凝胶中增加其浓度（图3(一个))．

数字3 (b)表示亚甲基蓝从饱和水凝胶中扩散到水中。在这种情况下，染料在溶液中最大吸光度处的吸光度的增加对应于其在溶液中的浓度的增加。所有样品在130 ~ 150 min内均达到染料从水凝胶中解吸的平衡状态。

平衡状态下，MB在水凝胶中的浓度如表所示1．显然，水凝胶的交联度降低和亚甲基蓝色进入水凝胶的扩散速率增加。它是由更高的网格尺寸引起的，因为它在[12.]。水凝胶中染料的平衡浓度高于溶液中，这表明染料分子和聚合物基质的分子间相互作用由于极性官能团和水凝胶的局部体积的离子相互作用。在扩散后，水凝胶的较低交联密度导致较高浓度的染料进入聚合物基质。

数字3 (b)显示扩散过程对水凝胶中交联浓度的强依赖性。水凝胶外释放的MB释放速率是样品D20-PAA-0.2的最低交联密度，其对应于网络中的最大网格尺寸。

因此，水凝胶的吸附/解吸性是调节细菌培养基中活性物质的治疗浓度的重要因素。它允许为生物医学应用创建新颖的材料，例如伤口敷料。因此，我们使用水凝胶D20-PAA-0.2具有最佳扩散性能的抗菌研究。

３．２．抗菌研究

3.2.1之上。光激活MB在菌悬液中的抑菌活性

红外光(660 nm)的抑菌效果研究S.金黄色葡萄球菌细菌悬浮液中指示没有杀菌作用（图4.)．这是由于光量的低能量以及细菌细胞中的光敏剂靶标。还发现亚甲蓝以浓度为0.0001重量％。细菌悬浮液中的％不显示相对于细菌菌株的杀菌性质。然后，红光照射和MB为0.0001重量％。合并％并引起CFU的20％，辐射剂量为约2J / cm^3.．能量密度的增加至6 j / cm^3.导致失活CFU的60％。在辐射剂量进一步增加不利于杀菌活性的增长。这可能是由于适应S.金黄色葡萄球菌培养到所创造的条件或缺乏氧气或染料溶液中。

3.2.2。用MB载荷的水凝胶中的水凝胶抗菌活性

将亚甲基蓝色从水凝胶中扩散的研究表明，在短时间内显示染料进入环境中的逐渐释放。这使得长时间允许在致病细菌的悬浮液中提供所需的活性物质的浓度。考虑到得到的结果，研究了用亚甲基蓝色的水凝胶材料与可见光照射组合的杀菌作用。最低交联密度和最高扩散速率的D20-PA-0.2分离为MB容器。首先，显示纯水凝胶等各个组分，6J / cm处的光照射^3.和亚甲蓝不具有在细菌悬浮液的抗菌能力（图5.)．同时，水凝胶复合D20-PAA-0.2 / MB和光照射的复杂作用导致损失初始量的CFU的60％，随着水凝胶的溶液在40分钟的溶液中孵育。

3.2.3。水凝胶的抗菌活性与MB的固体介质中读

上述细菌悬浮液的抗菌研究的结果所描述的指示基于加载有亚甲基蓝和红光照射活化交联的水凝胶复合物的抗菌功效。由于这种复合材料是有希望的水凝胶敷料的材料，这是有趣的研究，表面上它们的抗菌性能。抗菌功效已知由多种因素造成，如光活化抗微生物剂的性质，它们的扩散速率和浓度，水凝胶的性质，和细菌菌株。

水凝胶D20-PAA-0.2的杀菌活性以低浓度为MB负载 和 wt。%对野生金黄色葡萄球菌菌株是通过圆盘扩散法（调查图6.)．由图可见6.，载MB的水凝胶辐照 wt。%，不同光能密度(660 nm)对其杀菌活性无明显影响。当MB的浓度增加到 wt。%时，杀菌活性增加，对辐射剂量的依赖性出现。

因此，用亚甲基蓝作为光活性抗微生物剂负载的水凝胶复合材料并用红光（660nm）照射，抑制和固体培养基上均具有杀菌作用。它使它们成为伤口敷料的有希望的材料和光动力治疗的应用。

4。结论

混合交联的水凝胶的葡聚糖接枝聚丙烯酰胺具有不同交联密度进行合成有前途的新一代材料用于生物医学应用。亚甲蓝用作光活化抗微生物剂的通用模型。吸附/染料的解吸过程进入/离开水凝胶进行了研究。吸收MB成水凝胶的释放率具有最低的交联密度样品更高。装载有亚甲基蓝作为光活化的抗微生物剂，并用红光照射水凝胶复合物的抗菌活性和悬浮固体培养基对野生株进行了测试S.金黄色葡萄球菌．对两个实验注册了高抗微生物功效。因此，制备的水凝胶复合材料可用作伤口敷料和光动力疗法的有希望的材料。

数据可用性

用于支持本研究结果的[吸附/解吸动力学研究]数据包括在文章中。用于支持本研究结果的[抗菌研究]数据可根据要求从通讯作者处获得。

利益冲突

作者宣布没有关于本文的出版物的利益冲突。

参考

1. W. Kim，W.Zhu，G.L.Hengricks等人，“一类新的合成类黄蛋白抗生素，有效针对细菌持久性，”自然，卷。556，没有。7699，pp。103-107,2018。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
2. P. S. Zolfaghari，S.Placker，M. Singer等，“使用光活化的抗微生物剂的体内杀死金黄色葡萄球菌”，“BMC微生物学，卷。9，不。1，p。2009年27日。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
3. M.Wilson，T.伯恩斯和J. pratten，“使用光活化的抗微生物剂杀死生物膜中的链球菌血管，”抗菌化疗杂志，卷。37，没有。2，第377-381，1996。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
4. K.页面，M. Wilson和I. P. Parkin，“抗微生物表面及其在减少无生命环境中在医院收购感染的发病时的作用”，“材料化学杂志，卷。19，没有。23，pp。3819-3831,2009。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
5. V. DEDRAENE，J.PRATTEN和M. Wilson，“含甲苯胺蓝和玫瑰瓣的醋酸纤维素是当暴露于白光时有效的抗微生物涂层”应用和环境微生物学第72卷第2期6、2006年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
6. R. A.淅，D. I.塔尔和E. Glatstein，“在治疗癌症的光动力疗法”药物(第57卷)5，第725-734页，1999。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
7. S. Perni，P.波维奇，C. Piccirillo，J. Pratten，I. P.帕金，和M.威尔逊，“当用红色激光照射甲苯胺蓝含有的聚合物显示出有效的杀菌活性，”材料化学杂志，卷。19，没有。18，pp。2715-2723,2009。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
8. J. Gil-Tomás，S. Tubby，I. P. Parkin等，“致命的光敏性金黄色葡萄球菌使用甲苯氨基蓝o-Tiopronin-gold纳米粒子缀合物，“材料化学杂志，卷。17，不。35，第3739-3746，2007年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
9. K.爱德华兹，“一个老最喜欢的新的转折：龙胆紫和亚甲蓝抗菌泡沫”伤口护理进展，卷。5，不。1，第11-18，2016。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
10. Q. Chai，Y. jiao和X. Yu，“水凝版生物医学应用：它们的特点和它们背后的机制，”凝胶，卷。3，不。1，p。2017年6日。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
11. R. Parhi，“药品应用的交联水凝胶：审查，”先进的制药公报，第7卷，第5期4, pp. 515-530, 2017。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
12. O. Nadtoka，N.Kutsevol，A. Naumenko和P.Virch，“水凝胶 - 银纳米粒子复合材料的光化学合成和表征”，化学中间体研究第45卷第5期8, pp. 4069-4080, 2019。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
13. Y. Wang, Y. Y. Huang, Y. Wang, P. Lyu, and M. R. Hamblin, “Red (660 nm) or near-infrared (810 nm) photobiomodulation stimulates, while blue (415 nm), green (540 nm) light inhibits proliferation in human adipose- derived stem cells,”科学报告，第7卷，第5期1，第7781,2017条。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
14. O. Nadtoka, N. Kutsevol, V. Krysa，和B. Krysa，“混合聚丙烯酰胺水凝胶的合成、性能和应用前景”，分子晶体和液晶，第672卷，第2期。2018年，第1 - 10页。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
15. S. Perni，C. Piccirillo，A. Kafizas等人，“抗菌活性光活化硅氧烷包含不同尺寸的亚甲基蓝和金纳米颗粒，”中国集群科学杂志，卷。21，不。3，pp.207-438，2010。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
16. L. M. Carantonis和M. S.斯宾克，“A选择性盐蛋琼脂致病葡萄球菌介质”病理学杂志，第86卷，第86期1，页217-220,1963年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
17. M. Lehtopolku，P. Kotilainen，P. Puukka等人，“具有用于弯曲杆菌的敏感性试验琼脂稀释法比较了纸片扩散法的不准确性，”临床微生物学杂志，第50卷，第5期。1，第52-56页，2012。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
18. C.卡马乔-费尔南德斯，D.赫尔瓦斯，A.里瓦斯 - SENDRA，M. P.马林，和J. M. SEGUI-Simarro“的六个不同的方法来计算细胞密度比较，”植物方法第14卷第2期1、2018年第30页。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索

版权

版权所有©2020 O. Nadtoka等。这是分布下的开放式访问文章创意公共归因许可证如果正确引用了原始工作，则允许在任何媒体中的不受限制使用，分发和再现。