杀菌剂微生物致病性与壳聚糖金属量子点的性质大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,伤寒杆菌

文摘

纳米技术被认为是作为一种工具来克服耐药性感染。本研究的目的是探讨抗菌性能的量子点(量子点)的非盟,Ag)和铜壳聚糖与支持大肠杆菌(写明ATCC 25922),金黄色葡萄球菌(写明ATCC 29213)伤寒沙门氏菌(写明ATCC 9993)压力。量子点的合成方法(化学液相沉积,CLD)使用2-ethoxyethanol溶剂( 近似扩散浓度)。然后,NPs支持利用溶剂化法合成了壳聚糖金属原子分散(SMAD)在两个浓度,称为[一]和[B](0.05和0.1 g / L)为每个金属与壳聚糖导致非盟的平均大小 ,Ag) ,和铜 ,分别。其他几个技术进行如TEM, SEM / EDX、TGA、DSC、红外量子点描述。8的抗菌试验进行代理的文化大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,伤寒杆菌通过磁盘扩散,肉汤macrodilution,确定死亡曲线最敏感的病原体。抗菌效果的纳米粒子相比,使用生长抑菌圈的直径通过磁盘琼脂扩散和最低抑制浓度(MIC)和最小杀菌剂浓度(MBC)通过macrodilution批文化的最初的培养液 。最高的杀菌效果与纳米粒子的盟,Ag)和铜(0.1 g / L)麦克风和MBC的200和400毫克/毫升,分别。最伟大的杀菌作用考虑量子点三个病原体是Ag(0.05和0.1 g / L)。金属纳米粒子的杀菌作用主要由电负性影响,纳米粒子的浓度,和细菌时代文化。

1。介绍

金属纳米粒子的抗微生物剂性质(基于)产生极大的兴趣对他们的应用程序的新抗菌药物(1,2]。这是由于他们的高表面积从而产生更多的接触病原体的细胞表面。这个特性生成倾向于形成团聚体主要是由于范德华和静电的力量。稳定的重要性高表面能避免这种集聚使用一个代理的能力与粒子表面的最终的悬浮稳定和后续改进抗菌活性(3]。保护剂的使用来减少能源表面的NPs是壳聚糖。这是一个天然聚合物的高可用性、生物降解性、无毒性,生物相容性,polycationic结构与抗菌活性[允许形成螯合物4]。这些特征使壳聚糖等天然聚合物,理想材料用作支持金属纳米粒子,具有抗菌特性,为其更换一些常规治疗的潜在使用抗生素(5,6]。与获得性耐抗生素菌株的崛起,近年来一直与这类药物的过度使用7),增加的发病率和死亡率可能需要更大成本不再包括住院治疗(8,9]。此外,它不太可能,NPs可能产生耐药性的细菌与抗生素相比,由于金属影响微生物细胞的多个目标包括细胞膜、DNA,和酶活性10,11,12]。

本研究的目的是开发一种抗菌剂与杀菌剂属性使用不是传统配方的量子点金,银,铜支持使用壳聚糖及其抗菌活性被证明对三种病原体(大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,伤寒沙门氏菌)。

2。实验

2.1。量子点的合成金属(Au、Ag)和铜)在胶态悬浮体

溶剂2-ethoxyethanol(默克年利。),氮和氮气(林德)和超纯金属分析年级(奥尔德里奇)。非盟的胶体,Ag)和铜是由一个方法称为化学液相沉积(CLD)。涉及的方法同时沉积与物理金属蒸汽和有机蒸气在高真空压力下的10⁵酒吧和温度77 K的金属原子反应堆(13]。非盟的金属量子点、Ag)和铜在2-ethoxyethanol合成的浓度 (19.69 mg非盟、10.77毫克Ag)和6.35毫克铜在100毫升溶剂)。特征,这些都是为了确定这个浓度会产生稳定的胶体。最后,描述后,量子点支持金属壳聚糖合成的溶剂化金属原子扩散的方法(SMAD)。这种方法允许准备非常小的粒子的溶解在聚合物极性有机溶剂,并允许将它们在固体或液体阶段。

2.2。表征金属胶体

金属胶体通过紫外和可见光谱(紫外)和透射电子显微镜(TEM)和x射线衍射(XRD)。紫外可见吸收光谱的测量NPs胶体的解决方案从200年到500纳米波长的选择 采用日本岛津公司紫外光谱仪集团、日本京都。胶体分散稀释约0.1毫升分散在3毫升2-ethoxyethanol溶剂,分析之前避免胶粒的过度集中和更高的吸收。透射电子显微镜,一滴胶体分散体系是与各自的溶剂和干放在铜网格150网碳涂层。传输显微图得到使用杰姆JEOL1200显微镜操作加速电压120 keV交货;该设备达到分辨率为4。然后,设备运行x射线衍射(XRD)来确定纳米粒子的化学物种。获得量子点的大小,这些将由光学测量(数字测量像素),在特定的随机粒子直径测量的Mac Biophotonics软件映像j .最后,获得的数据绘制的形式与高斯分布频率直方图。

2.3。金属纳米颗粒的合成壳聚糖的支持

壳聚糖(Qs)与95%脱乙酰作用程度和分子量350.000提供的Da Quitoquimica有限公司(科罗内尔合金、比奥比奥地区、智利),2-ethoxyethanol(默克年利。),液态氮,超纯氮气(Aga)和金属的分析级(Sigma-Aldrich)。量子点的(非盟、银和铜)支持对壳聚糖合成的溶剂化金属原子扩散的方法(SMAD)。合成的溶剂负责打开壳聚糖,并允许的聚合物链的量子点(14]。

SMAD方法包括物理同时沉积有机蒸汽的蒸汽(2-ethoxyethanol)在相同的物理条件下CLD的方法,但是随着壳聚糖在反应堆的引入15]。同时,乙醇,基本上都帮助胶体稳定的高介电常数。每个反应溶剂后恢复。

两种不同浓度的金属量子点(MQDs)是合成标记为[A],在100毫升的浓度为5毫克的溶剂和2 g的壳聚糖(0.05 g / L 2《gq》),和(B) 10毫克100毫升溶剂和2 g的壳聚糖(0.10 g / L 2 g Qs)。物质的量浓度而言,量子点标记(一)如下:非盟 ,Ag) ,和铜 支持2 g的壳聚糖。量子点浓度[B]如下:非盟 ,Ag) ,和铜 同样的支持。

由于浓度的物质的量浓度是不同的,我们进行了量子点合成Ag) 为了获得一个摩尔等效量子点与铜,铜[一]qs和分析了影响细菌敏感性测试。掺杂量子点与壳聚糖和壳聚糖仅为1% (w / v)停牌1%醋酸和存储在冰箱在4°C琥珀瓶为随后的敏感性测试。壳聚糖的MW反应后保持不变。最近出版的还有其他方法获得纳米粒子(16,17]。

2.4。金属纳米粒子的表征壳聚糖中支持

NPs支持对壳聚糖的特点是测量使用扫描电子显微镜(SEM)和x射线能谱(EDX)、热重分析(TGA)、差示扫描量热法(DSC)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)。透射电子显微图得到,将一滴胶态分散体网格,让它干,然后涂上金原子厚度的3分钟150 a。然后,样品干最后在显微镜下观察地产6380年lv-jeol扫描电子显微镜与20 kV加速电压。NPs TGA分析支持了发生在热重分析仪q - 1000热。样品的质量是一般的 。样本被送往一个平衡系统装备,温度从25°C提高到550°C的升温速率下10°C / min氮气气氛。获得温谱图,样品的质量不断记录作为温度的函数。量子点的DSC分析支持发生在梅特勒-托利多DSC分析器,配备822星型模型软件系统。样品的质量范围 和10°C /分钟升温速率下氮气流。傅里叶变换红外(FTIR)光谱的那些时光麦格纳进行Nicolet 5个人电脑分光光度计和KBr颗粒浓度2%准备在室温下使用Omnic 5.2程序。

2.5。紫外和可见光谱

胶体量子点的紫外可见吸收光谱方法测定波长的选择,从200年到500海里25°C,使用UV-Shimadzu集团光谱仪,日本京都。基线相同的溶剂使用的反应是,量子点和每个(金、银、铜)是在不同的时间检查,进行沉降和絮凝效果的研究胶体的大小如何影响它。胶体溶液被稀释在大约0.1毫升的分散在3毫升的纯溶剂之前分析,以避免过度的胶粒的聚集和高吸收。

2.6。热重量分析

TGA分析为支持NPs执行热q - 1000热重分析仪。NPs的质量 他们在哪里带到一个平衡系统配备了加热温度增加从25到550°C的加热速度10°C /分钟气体氮流。获得温谱图,样品的质量不断根据温度记录。

2.7。抗菌活性分析

大肠杆菌(写明ATCC 25922),金黄色葡萄球菌(写明ATCC 29213)伤寒沙门氏菌(写明ATCC 9993)应变被使用,其中股票维持在-20°C在圣塞巴斯蒂安大学实验室。所有试验进行Mueller-Hinton(默克公司)肉汤或琼脂和准备根据制造商的指示和储存在4°C。

进行了三种不同的分析来确定chitosan-supported NPs的抗菌性能。

2.7.1。磁盘扩散试验

阀瓣扩散试验进行确定的敏感性菌株单独壳聚糖和金,银,铜NPs支持壳聚糖(Au-Qs, Ag-Qs, Cu-Qs)。根据执行分析(CLSI) (18]指南使用磁盘(6.3毫米直径)浸满20岁μL每个解决方案的测试。

2.7.2。串行Macrodilution方法

的一个方法用于确定最低抑制浓度(MIC)是肉汤稀释法18]。这是基于代理的抗菌性能的降低浓度,作用于一个标准的微生物的培养液。实现macrodilution测试在肉汤,培养液最初准备大约10点⁶CFU /毫升。然后,一系列管设置每个代理解决方案的研究从0.010%到0.16% w / v(100至1600 ppm)悬浮在1%乙酸+ 2毫升的培养液之前准备好 最终产生的培养液 和允许孵化 18 - 24小时。量子点的等价表所示1。管有更高的浓度并没有显示出增长,表明麦克风。从每个管没有增长,0.1毫升的样品得到条纹Mueller-Hinton琼脂板上和孵化18 - 24小时 。较高的稀释不显示增长板块的殖民地被认为是MBC(最小杀菌浓度)。

2.8。死亡曲线测定大肠杆菌通过直接板计数法

死亡曲线评估、10毫升的接种体调整到0.5麦克法兰加入90毫升新鲜Mueller-Hinton中生成一个最终的培养液 。最后一个400毫克/毫升的壳聚糖浓度掺杂金( )和铜( )使用(Au [B] qs和铜[B] qs);积极的控制制备样品的一样,但是没有壳聚糖/量子点。所有的测试都是一式两份。烧瓶孵化在37°C和150 rpm。每两个小时,样本被送往执行可行的细胞的计数。1毫升每个瓶被添加到9毫升无菌蒸馏水,使连续稀释4倍获得10⁶,10⁵,10⁴,10³CFU /毫升的原培养液。从每个稀释,0.1毫升蔓延到Mueller-Hinton琼脂板和孵化一夜之间在37°C。菌落计数是使用Suntex 570菌落计数器。可行的细菌数量绘制的曝光时间大肠杆菌抗菌药物并与积极的控制。

3所示。结果

3.1。表征金属量子点的非盟、Ag)和铜胶体悬浮液

结果确定,使用2-ethoxyethanol CLD方法,可以获得非盟,Ag)、量子点和铜 , ,和 ,分别;为了简化,我们在显微图中获取的值(Au ,Ag) ,和铜 )。同时,球状的患病率观察三种金属量子点形状。这可以与紫外可见光谱分析的结果,总结在表2。每次运行获得的光谱显示一个对称的表面等离子体共振,达到量子点为非盟的波长范围235 - 505,然后383 Ag)和210 - 305纳米铜、分别。

图1与各自的柱状图显示了TEM图像,量子点共计100。量子点为盟,Ag)和铜在2-ethoxyethanol溶剂化,图2显示了衍射图样。

使用模式(图2),可以确定晶体性质通过密勒指数和非盟,Ag)和铜量子点在nanometric级别。从衍射环平面间的距离,可以索引根据立方结构集中在面临(fcc)的金属。量子点非盟代表cubooctahedral和二十面体系统;量子点Ag)的正方的混合物,六角,立方,三角形;量子点和铜的立方和三方晶系。

3.2。表征金属纳米粒子的非盟、Ag)和铜壳聚糖的支持

通过扫描电子显微镜(SEM),观察不同的形态不同的复合材料获得合成胶体,chitosan-Ag平滑表面。此外,EDX证实了金属表面的存在。

每个组合的元素分析色散x射线能谱(SEM / EDX)提供了非盟量子点[B]是最低的原子百分比(0.06%)在聚合物表面与Ag)和CuNPs相比。这解释了吸收的AuQDs大多是聚合物,CuQDs [B],金属比例(1.59%)最高,导致更大的不稳定性和凝聚和氧化的倾向。得到的结果可以补充与CuQDs的x射线衍射(XRD)。获得绝对的确定性成分的金属聚合物需要原子吸收的元素分析。

图3显示了量子点的扫描电子显微镜照相术和EDX分析支持壳聚糖浓度[B]。TGA测试执行所有混合金属聚合物和聚合物本身。

表3总结的结果质量的百分比和原子的量子点的百分比盟,Ag)和铜浓度[B],读图获得的图形3。

3.3。紫外可见

量子点的光学吸收光谱金属被表面板共振(20.]。这些共振位于较大的波长随着粒径的增加。图4显示了结果的总结分析NPs合成后(30分钟)和3个月后。只有细微差别,两者之间的光谱观测,表明量子点的高稳定性。

3.4。热重和扫描量热法分析

热重量分析法分析高分子金属混合物和聚合物本身。图5显示了壳聚糖的TGA,展示各自的温度的最大分解速率和聚合物加热时的行为超过100°C。有一个轻微的体重约100°C,这是由于水的蒸发,其内容是关于3 - 5%。底线显示大幅减少约200°C,它最终的损失几乎整个样本。

热重法的结果表明MQDs支持的热降解壳聚糖具有分解温度比纯聚合物低(DT)。这是因为金属量子点作为杂质降低后者的分解温度,这就增加了一个复合熵。但在较高的氧化电位的金属如Ag)和铜、Td随量子点金属的数量。参见图6,7,8。

然而,这种区别纯壳聚糖和壳聚糖掺杂NPs低3°C的范围内,因此,NPs破坏了壳聚糖本身固有的物理特性。

DSC结果,表4总结所有的动力学参数的热降解壳聚糖和壳聚糖与MQDs掺杂。DSC挂式或endo显示值低于纯壳聚糖;这些结果证实了影响纳米颗粒的杂质。

3.5。傅里叶转换红外光谱学

傅立叶变换红外光谱分析对溶剂、壳聚糖和金属NPs支持Qs图所示9。吸收光谱分析在中档和远的范围山峰获得的。

表5礼物的分配山峰的溶剂,壳聚糖,NPs盟Ag)和铜两种浓度([一]和[B])。

红外光谱分析溶剂、壳聚糖和MQDs支持进行了中间,光谱范围。中档光谱分析可以澄清,只显示典型的吸收的壳聚糖不出现任何新的量子点聚合物的吸收带。中档光谱分析可以澄清,只显示了典型的吸收的壳聚糖和任何新的量子点聚合物的吸收带不出现。证据显示氨基酸之间的相互作用组的Qs和原子MQDs的表面。也见过在这个光谱150厘米附近的新乐队¹可以分配给-金属相互作用(MM)的量子点。

3.6。抗菌活性分析

3.6.1。琼脂扩散法

正如所料,最好的活动是量子点在所有与更高浓度的测定([B])。如图10被发现的敏感性,这一趋势大肠杆菌尤其是对量子点盟。

然而,对于金黄色葡萄球菌,最好的或类似的活动使用的最低浓度量子点与所有。抗菌活性被认为太不掺杂壳聚糖对三个菌株进行了测试。

操作。串行Macrodilution

表6介绍了麦克风和MBC获得的结果在每个组合研究。如图所示,没有QD浓度之间的相关性,观察CMI-CBM在所有情况下。例如,大肠杆菌呈现相同的麦克风AgQDs虽然[一]浓度(B)浓度的一半。同样的发生与其他微生物和金属表明浓度并不是唯一的变量影响抗菌活性。

3.6.3。死亡曲线大肠杆菌

图11描述了死亡曲线大肠杆菌在金和铜的存在量子点浓度为0.1 g / L 2 g的壳聚糖(浓度[B])。结果表明,大肠杆菌量子点对铜更敏感,产生最佳的杀菌作用与减少16 h的孵化后5日志( 来 )。相反,金纳米粒子已经孵化的主要抗菌效果7小时后略微减少1日志( 来 )。

4所示。讨论

纳米粒子合成的大小介于5到10纳米之间,为此,我们称之为量子点(21,22]。根据沙et al。10量子点)、白银表现出在非常低浓度的抗菌效应由于大活跃的表面积和表面电荷密度高,而银色的金属。

量子点对非盟的ED,通常表示一个立方体的八面体和二十面体结构和NPs Ag)和铜、矩形和立方结构的混合物。当考虑错误率,更大的确定性是发现在非盟的结晶性质和量子点Ag),由于更大的衍射环(图的清晰度2(一个)和2 (b)量子点)对铜(图2 (c)量子点),所以Ag)的立方结晶度最高的,其次是铜的,而非盟完全是二十面体的量子点可能会影响杀菌活性的差异大肠杆菌和金黄色葡萄球菌文化。量子点非盟有二十面体结构有一个更大的接触面积与细胞壁,因为这种结构量子点20面临Ag)和铜相比,具有立方结构(较小的区域)。这将导致量子点盟大金属结构之间的交互和磷酸基呈现在细胞表面,或DNA存在于细胞,这将产生更大的杀生的影响这两种病原体。

当考虑三种病原体在方差分析中,量子点Ag([一]和[B])是最杀生的影响这两种病原体,所以多量子点的晶体结构和电负性23]。看来这些是最有影响力的大小杀生的活动,因为它是显示Ag)有一个直径( )大约两倍小于非盟和铜( 和 ,分别)。

每个组合的元素分析通过色散x射线能谱(SEM / EDX)确定量子点非盟,在[一]和[B],浓度是最低的原子百分比(0%的(一个)和0.06% [B])在聚合物的表面Ag)和CuQDs相比。这可能假设量子点盟由聚合物和吸收往往不容易氧化,与铜[B] QD的比例最高(1.59% [B])导致不稳定和增加倾向于集聚和氧化。但有绝对确定性的金属聚合物的组成,元素分析,原子吸收是必需的。

至于热重方法获得的结果,可以看出支持量子点金属的热降解壳聚糖比纯聚合物的分解温度较低。这是由于覆盖金属纳米粒子作为金属杂质的分解温度降低,从而增加熵,因为它是一个组合。然而,这种区别纯壳聚糖和量子点掺杂壳聚糖是稀疏的,在291 - 296°C,范围内量子点所以不改变壳聚糖本身固有的物理特性。MQDs一般减少Td,因为它们合并,增加系统的熵。此外,DSC表明量子点都接受相同的转换改变壳聚糖时受到加热10°C,即。前,他们经过冷结晶融合的过程。

傅立叶变换红外光谱分析证实了交互的金、银、量子点和铜由于mn (Metal-Amine)壳聚糖的团体。降低m n的吸收波长发生由于氮的成键电子的轨道的金属。由于mm的存在(-金属)交互中远红外,很明显,有一个二元性的金属粒子,呈现两种形式,氧化和nonoxidized量子点的金属。这可能是因为2-ethoxyethanol作为溶剂在反应堆内的激动人心的阶段,可氧化的支持胶体聚合物基质中,即使是干。根据迈尔et al。24],MQDs封装在一个球体的溶解与后续加入量子点,帮助稳定矩阵的合成壳聚糖。也检查了在红外光谱是M-O(氧-溶剂的哦),生成在遥远的范围,这决定了金属颗粒之间的相互作用的电子对2-ethoxyethanol哦官能团,通过M-O债券。此外,结果显示高碳在金属,因此上述的内容Mayer et al。24是满足。

微生物敏感性试验、琼脂扩散和宏观连续稀释显示趋势的量子点最好的抗菌活性浓度[B]对革兰氏阴性细菌(G (-)) (大肠杆菌和伤寒杆菌在革兰氏阳性)和浓度(一)(G (+))金黄色葡萄球菌。这可能是由于细胞壁的结构,G(-)有一个外膜和脂多糖(LPS),这是一个高电负性。另一方面,在场的磷壁酸G(+)细菌表面的电负性较小,这将产生更多的吸附壳聚糖对革兰氏阴性细菌,因此更大的抑制作用,这就是为什么据钟et al。25获得),增加抗菌活性大肠杆菌文化比金黄色葡萄球菌。

所表现出的较低的抑菌圈伤寒杆菌意味着这个微生物是最耐测试化合物。这个结果符合macrodilution肉汤。这可能是由于有限合伙人层的化学成分,这是由糖半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖组成的四个或五个序列的单位,通常分枝。这可能是一个障碍对绑定的壳聚糖脂肪酸存在于有限合伙人的氨基酸酯键(26]。可能影响这个细菌的耐药性的另一个因素是它的生存能力在低pH值媒体和许多有机酸的存在(27),chitosan-QDs在1%乙酸可溶性。

低比例MBC /麦克风(1或2)观察意味着NPs拥有一个主要杀菌行为(28]。Ag NPs显示最好的抗菌效果表示为菌株的低麦克风测试。这可以解释,因为Ag)的NPs是最小的,这将促进他们进入细胞,因此其攻击机制(29日]。

最好的抗菌效果观察到量子点chitosan-supported金属,nondoped相比,壳聚糖为2% (w / v)这意味着量子点结合壳聚糖抗菌效应和协同效应。

也观察到Ag NPs合成在一个浓度7.7米(摩尔浓度等于铜量子点[一])统计上显示不同的结果从麦克风治疗Ag) [a], Ag) [B],和铜(一个),所以包裹金属和浓度影响抑菌活性并不是唯一的变量。

量子点的死亡结果曲线的非盟[B] qs和铜[B] qs反对大肠杆菌表明Cu-QDs 16 h孵化后杀菌活性越高,但两个小时后,效果类似于最大量子点通过非盟。这些差异可以解释不同的行动机制的金属,既干扰膜结构,但铜纳米粒子产生多个其他毒性作用,如活性氧生成,脂质过氧化反应、蛋白质氧化,和DNA降解所以它的杀伤力更大(30.,31日,32]。

5。结论

通过本研究中使用的合成工艺(CLD),量子点可以获得非盟,Ag)和铜的规模相对较小(平均6.0 - -10.0 nm)和均匀分布。

紫外吸收和透射电镜结果确认中存在金属胶态悬浮体。

量子点所支持的金属,SEM和色散x射线能谱(EDX)可以证实壳聚糖金属集群支持,由红外光谱方法获得的结果,在遥远的范围,证明有一个量子点之间的交互支持与壳聚糖聚合物矩阵。

热方法验证nanometals纳入Qs不失固有的热力学性质的聚合物基质,这些复合材料稳定到250°C。

盟的量子点、Ag)和铜CLD方法,获得的支持SMAD Qs的方法,和Qs本身,有抗菌活性和演示了在琼脂扩散试验和macrodilution肉汤E。杆菌,金黄色葡萄球菌,伤寒杆菌浓度的菌株,量子点的大小和晶体结构与细胞表面的结构和文化影响的年龄提到活动。

结果表明,麦克风和磁盘扩散试验必须伴随着一份死亡曲线因为纳米粒子的效应的时间虽然是不同的麦克风是相同的。

数据可用性

支持这项研究的数据和附加材料与相应的作者可以直接获得沟通。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢Conicyt的财政支持,Fondecyt授予1080704和1140025。感谢博士将j . Lisperguer DSC数据。

补充材料

补充1。附件1显示了量子点红外光谱的银和铜,(Ag)[一]qs)和(铜[一]qs)。

补充2。附件2所示的详细统计分析抗菌活性。

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