Cyclocarya成果多糖抑制神经胶质瘤U251细胞增殖、迁移和入侵通过GSK3并促进细胞凋亡β/β连环蛋白信号通路

文摘

客观的。调查的影响Cyclocarya成果多糖(CPP)增殖、迁移、入侵,人类神经胶质瘤U251细胞的凋亡和进一步探索底层机制。方法。U251细胞体外培养和处理各种浓度(25、50、75、100、125和150μ摩尔的CPP / L) 24日,48和72 h。细胞计数kit-8被用来检测细胞增殖的活性。愈合试验、Transwell化验和流式细胞仪是用来测量CPP对迁移的影响,入侵和U251细胞的凋亡。西方墨点法用于确定GSK3中涉及的蛋白表达β/β连环蛋白信号通路及其下游基因与扩散、迁移,入侵,和细胞死亡包括Cyr61 CCND1,波形蛋白和蛞蝓。与此同时,存在被用来检测Cyr61的mRNA水平,CCND1,波形蛋白和蛞蝓。结果。我们发现CPP不仅可以抑制增殖,迁移和入侵U251细胞体外也促进其凋亡。此外,CPP可以显著抑制磷酸化和减少GSK3的蛋白质含量β在ser9网站( ),因此增加的磷酸化β连环蛋白在ser33/37网站( ),导致β连环蛋白退化。此外,我们还发现,CPP可以下调mRNA ( )和蛋白表达( )GSK3的下游基因β/β连环蛋白信号通路包括Cyr61 CCND1、波形蛋白和蛞蝓,与扩散、迁移,入侵和细胞凋亡。结论。CPP可以抑制GSK3的表达β,促进退化βGSK3连环蛋白,表达下调的水平β/β连环蛋白下游基因包括Cyr61 CCND1、波形蛋白和蛞蝓,调节增殖、迁移,入侵和神经胶质瘤细胞的凋亡。

1。介绍

神经胶质瘤是一种最积极的恶性脑癌,占大约36%的原发性脑瘤(1]。神经胶质瘤源于神经胶质细胞恶性肿瘤,约占80%的中枢神经系统(2]。虽然神经胶质瘤发病率低于其他癌症,神经胶质瘤有相对较高的死亡率由于其高度侵袭性生长特性(3]。目前,尽管治疗的进步在过去的十年里,仍然没有有效的治疗(4]。化疗治疗神经胶质瘤是一种重要的方法。它可以杀死残余肿瘤无法切除的手术和放疗。因此,研究antiglioma药物具有重要意义。

Cyclocarya成果属的植物吗菊花(Jugaceae),主要分布在中国南方。树枝和树叶是甜的,冷却效果,可以减少肿胀和疼痛(5]。现代药理研究表明,Cyclocarya成果含有多种营养物质,可以发挥不同的生物学作用[6]。在这些生物活性成分,Cyclocarya成果多糖(CPP)是一种重要的活性成分。CPP及其配合物抗肿瘤中扮演关键的角色,抗炎、抗病毒、抗衰老的,抗凝(7- - - - - -11]。最近的研究CPP主要集中在其抗癌效果。例如,金等人报道,CPP和x射线的组合有明显的增殖抑制和对SW480 proapoptotic影响大肠癌细胞(12];张等人发现CPP可以增加缺氧的敏感人类非小细胞肺癌细胞A549和H520放疗。这些研究表明潜在的CPP作为临床肿瘤治疗的化学治疗剂(13]。然而,目前还没有文章CPP在神经胶质瘤的作用,因此本研究将使用神经胶质瘤细胞株U251首次研究CPP的角色在细胞增殖,迁移和入侵。

2。材料和方法

2.1。CPP的提取和识别

粗多糖提取的叶子Cyclocarya成果水和酒精沉淀方法提取,脱去蛋白质Sevag方法,透析和干水。之后,原油多糖纯化使用D301R列和筛选了0.4的氯化钠水溶液(11]。提取的CPP被紫外光谱和红外光谱。

2.2。单糖的分子量测定和分析组件

CPP的分子量是由高性能液相色谱(美国安捷伦1100)。系统配备SHODEX ks - 802和ks - 804列( ),用示差折光检测器和样例输入是20μl的样本筛选了氯化钠水溶液(0.2)作为流动相的流速0.8 ml / min,和列温度维持在40°C。一系列的标准与已知分子量右旋糖酐值被用作校准曲线,并分析了分子量Agilent-GPC软件。qq7000毛细管柱( ,美国安捷伦)和电离氢火焰检测器(FID)中使用CPP的单糖气相色谱分析。具体来说,干CPP(2.0毫克)溶解在1.0毫升组织(2.0米),水解在90分钟的安瓿在120°C,用甲醇洗净,然后蒸发去除组织。水解是减少NaBH4乙酰化和乙酸乙酯在100°C 60分钟,然后,乙酸酐与冰水被毁。获得的alditol与氯仿提取,并通过气相色谱法分析了合成。气相色谱分析过程如下:注射温度:250°C;检测器温度:250°C;列温度从120°C增加到250°C,以增加3°C /分钟的速度,并最终保持在250°C 5分钟。氮气作为载气,保持在1毫升/分钟。空气和氢速度是400和30毫升/分钟,分别。七个单糖被用作参考资料定量确定CPP的单糖含量。

2.3。细胞培养

美国人神经胶质瘤细胞U251写明ATCC买来。U251细胞经常使用DMEM培养基培养(热费希尔科学有限公司,中国)含10%胎牛血清(美国Gibco), 100 U /毫升青霉素和链霉素100克/毫升(美国Gibco)。湿润孵化器的温度保持在37°C和含有5%的二氧化碳。实验用细胞指数增长阶段。

2.4。细胞计数Kit-8 (CCK-8)检测细胞增殖活性

U251细胞的密度被播种 在96孔板培养过夜。第二天,不同浓度的CPP(25、50、75、100、125和150μmol / L)准备与细胞培养基(14是补充道。对照组,10μL CCK-8试剂(Dojindo、日本)添加/在24日,48和72 h。经过一段时间的潜伏期,吸光度( )在450 nm分光光度计测量。计算相对细胞活性(%) 。

2.5。细胞划痕试验评估细胞迁移能力

U251细胞被播种在12-well板和培养过夜。第二天,细胞在不同浓度处理CPP和培养,直到细胞融合率达到95%。无菌100μL吸管提示被用来画直线的单层细胞,然后用PBS这些细胞被洗。之后,1%的边后卫DMEM培养基和不同浓度的CPP是补充道。24小时后,细胞迁移到受伤部位一个倒置显微镜下观察和拍照。

2.6。细胞试验来检测入侵细胞入侵

对于细胞入侵测试,参议院的Transwell室(美国康宁公司)涂上100年混合物μL(基底膜基质(美国康宁公司)和血清DMEM培养基。基底膜基质凝固后,细胞密度与某些被播种的上院DMEM没有的边后卫,与此同时,含10%胎牛血清的DMEM培养基添加到众议院。24小时孵化后37°C,入侵细胞被固定为20%甲醇结晶紫染色和0.1%。细胞在显微镜下拍摄和计算。

2.7。通过流式细胞仪检测细胞凋亡

U251细胞被播种在一夜之间6-well盘子和孵化。第二天,每个添加不同浓度的CPP和培养72 h的孵化器。离心收集细胞,根据指令的流式细胞术洗装备(Biyuntian,中国)。5μL膜联蛋白V(异硫氰酸荧光素)添加到细胞悬液和孵化15分钟在光下。10μL (propidium碘(π)添加双重染色和在黑暗中孵化5分钟。分析后1小时内进行孵化。

2.8。免疫印迹法来确定细胞蛋白质表达水平

与里帕细胞提取后强烈的溶解产物(Biyuntian,中国),蛋白质是由BCA量化的方法。50μ克的蛋白质样本加载10% sds - page电泳凝胶,并进行免疫印迹PVDF膜(美国表达载体)。膜被阻挡在室温下,用TBST阻塞后,解决方案,包括p-GSK3和初级抗体反应β美国(ab131097 Ser9 Abcam), GSK3β(美国Abcam ab93926), p -β连环蛋白(Ser33/37 Ab11350 Abcam,英国),β连环蛋白(美国Abcam ab16051) Cyr61(美国Abcam ab24448) CCDN1(美国Abcam ab134175)、波形蛋白(美国Abcam ab8978),蛞蝓(美国Abcam ab51772)β肌动蛋白(美国Abcam ab179467)添加和孵化一夜之间在4°C。添加了相应的HRP-conjugated二级抗体和孵化TBST洗脱后在室温下。这张照片然后在ECL发光成像系统的开发。

2.9。检测mRNA表达的实时荧光定量PCR (qPCR)

细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体)。RNA浓度和纯度然后测量spectrophotometrically相对地转录(豆类、日本)的互补。SYBR绿色PCR反应混合液(豆类、日本)是用于PCR扩增(美国应用生物系统公司),β肌动蛋白是用作看家基因,Cyr61的相对表达,CCND1,波形蛋白,蛞蝓信使rna是计算使用2^{- - - - - -ΔΔCt}方法。独立实验重复3次。

引物序列如下:Cyr61 preprimer (5 - - - - - -3 ):AGCAGCCTGAAAAAGGGCAA postprimer (5 - - - - - -3 ):AGCCTGTAGAAGGGAAACGC;CCND1 preprimer (5 - - - - - -3 ):GCTGCGAAGTGGAAACCATC postprimer (5 - - - - - -3 ):CCTCCTTCTGCACACATTTGAA;波形蛋白preprimer (5 - - - - - -3 ):GACGCCATCAACACCGAGTT postprimer (5 - - - - - -3 ):CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT;蛞蝓preprimer (5 - - - - - -3 ):CGAACTGGACACACATACAGTG postprimer (5 - - - - - -3 ):CTGAGGATCTCTGGTTGTGGT;和β肌动蛋白preprimer (5 - - - - - -3 ):CATGTACGTTGCTATCCAGGC postprimer (5 - - - - - -3 ):CTCCTTAATGTCACGCACGAT。

2.10。统计分析

实验数据被表示为 。使用SPSS 18.0软件进行统计分析。学生的 - - - - - -测试是用于两两之间的比较数据组,单变量方差分析是用于组内比较。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。CPP的分离、纯化和结构分析

如图1(一)在260 nm, CPP没有吸收,这表明没有核酸。弱峰高在280纳米是由于蛋白质的存在,但蛋白质是否免费蛋白质或右旋糖酐复杂的还不清楚。CPP的总糖含量由phenol-sulfuric酸法为62.4%。的红外光谱图所示1 (b),广泛的峰值3385.21厘米¹和弱吸收峰在2921.77厘米¹是由于碳氢键CH2的伸展。强吸收峰在1611.47厘米¹是由于C = O不对称拉伸羧酸组和宽的振动吸收峰在1413.49厘米吗¹是由氢键的变形振动造成的。三个乐队在3400、2922和1414厘米¹多糖的特征。C-O-C不对称拉伸振动乐队出现在约1265.17厘米¹,对称拉伸振动出现在约1071.82厘米¹。

如图2(一个)CPP主要是分成两部分,即CPP-1 CPP-2。CPP-1的平均分子量(Mw) ,数量平均分子量(Mn) ,的平均分子量(Mz) ,CPP-2的兆瓦 ,锰是 ,和Mz 。如数据所示2 (b)和2 (c),下面的单糖气相色谱分离:鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,保留时间为15.921,16.383,16.63,17.662,27.687,28.228,和28.72分钟。结果表明,CPP主要是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,和摩尔比为1.00:2.21:0.62:0.50:0.62:4.18,表明CPP是半乳糖的主要成分。

3.2。CPP减少人类神经胶质瘤细胞U251的核扩散活动

如图3,与对照组相比,U251细胞后细胞活性下降存在剂量依赖的相关性24日,48岁和72 h的25岁,50岁,75年,100年、125年和150年μmol / L CPP治疗( )。当治疗24小时与CPP(浓度的范围在25、50、75人μmol / L),与对照组相比,U251细胞生存能力在每个时间点(没有明显变化 )。当CPP浓度达到100μmol / L,细胞生存能力显著降低在所有时间点( )。当处理CPP(集中在25 - 50的范围μmol / L) 48和72 h,与对照组相比,U251细胞生存能力在每个时间点(没有明显变化 )。当CPP浓度达到75μmol / L,细胞生存能力显著降低在所有时间点( )。治疗时间越长,细胞生存能力降低的程度就越高。特定细胞生存能力的数值变化如表所示1。上述结果表明,CPP可以抑制U251细胞的扩散。

3.3。CPP U251细胞的凋亡

如图4U251细胞后,用不同浓度的CPP (75, 100, 125, 150μ摩尔72 h / L),与对照组相比,细胞凋亡率增加与CPP治疗浓度的增加( ),详细表2。结果表明政府CPP U251细胞可以诱导凋亡的发生反应。

3.4。CPP治疗减少U251细胞迁移能力

如图5治疗后,U251细胞与不同浓度的CPP (75, 100, 125, 150μ摩尔72 h / L),与对照组相比,CPP-treated组的细胞迁移能力显著降低( )剂量依赖性的方式( )。

3.5。CPP抑制U251细胞的入侵

如图6,当U251细胞暴露于不同浓度(75,100,125,150μCPP mol / L),它们的入侵能力显著降低( )。与CPP处理浓度的增加,细胞入侵能力拒绝剂量依赖性的方式( )。

3.6。CPP抑制GSK3的激活β/β连环蛋白信号通路

如图7150年,当U251细胞治疗μ摩尔72 h / L CPP,免疫印迹结果显示,与对照组相比,CPP可以显著降低GSK3的蛋白质水平β和磷酸化水平Ser9网站。此外,治疗CPP促进的磷酸化水平β连环蛋白在Ser33/37网站,导致退化β连环蛋白。

3.7。CPP下游的GSK3抑制癌基因的表达β/β连环蛋白信号通路

如图8150年,当U251细胞治疗μ摩尔72 h / L CPP,与对照组相比,Cyr61 mRNA和蛋白水平,CCND1,波形蛋白和蛞蝓(增殖、凋亡、迁移和入侵SK3下游相关基因β/β连环蛋白信号通路)显著降低(所有 )。

4所示。讨论

作为食用和药用植物,Cyclocarya成果广泛应用于各种疾病的治疗15,16]。多糖的主要活性成分Cyclocarya成果(14]。天然生物大分子多糖,有各种各样的生物活性和生物过程的维护密切相关,例如,真菌和灵芝,对肿瘤细胞有抑制作用(17,18]。很少有研究CPP的抗肿瘤效应。本研究发现,CPP可以发挥积极作用在神经胶质瘤的治疗通过抑制GSK3的激活β/β连环蛋白信号通路和抑制下游基因表达与增殖,凋亡,迁移和入侵。

先前的研究已经证实,在结直肠癌细胞,CPP可以结合x射线来抑制PI3K / Akt信号通路,从而发挥作用在抑制肿瘤细胞增殖和促进凋亡反应(12];此外,它已经发现,CPP可以增加人类非小细胞肺癌放疗的敏感性(11),主要通过抑制mTOR的激活/ Akt / PI3K信号通路。由于没有研究报告在神经胶质瘤的CPP,我们发现在这项研究中,首次CPP对神经胶质瘤有显著的抑制作用,表明CPP预计将发挥积极作用在神经胶质瘤的临床治疗。

GSK3β是一个serine-threonine激酶,可以调节信号通路参与细胞增殖和细胞周期19,20.]。此外,GSK3β也通过Wnt /参与肿瘤发生β连环蛋白。研究发现,抑制GSK3β可以会导致神经胶质瘤细胞的死亡21]。GSK3β活动取决于其磷酸化的丝氨酸9。在正常情况下,GSK3βnonphosphorylated和活跃。GSK3β磷酸化可以与β连环蛋白,导致β连环蛋白降解[22]。相反,如果β连环蛋白降解受到抑制时,会发生激活的癌基因。与先前的报道一致,本研究证实了CPP GSK3可以抑制磷酸化和蛋白质水平的β在Ser9,从而促进的磷酸化β在Ser33/37连环蛋白,导致退化βGSK3连环蛋白,从而抑制β/β连环蛋白信号通路激活。

同时,我们发现后CPP可以抑制增殖,迁移,通过CCK-8和入侵神经胶质瘤细胞,细胞划痕,和Transwell实验中,我们进一步研究了致癌基因的mRNA表达和蛋白质含量GSK3下游β/β连环蛋白信号通路包括Cyr61 CCND1、波形蛋白和蛞蝓增殖和迁移。Cyr61 cysteine-rich,分泌,heparin-binding蛋白质,可以参与多种细胞功能如粘附、迁移、增殖(23]。以前,谢等人报道,与正常脑组织相比,Cyr61 66例原发性神经胶质瘤中高度表达,和Cyr61表达肿瘤分级和患者生存显著相关(24];CCND1作为癌基因(25],是高度表达的神经胶质瘤、乳腺癌、膀胱癌;CCND1的表达水平与肿瘤的恶性程度的影响,调节肿瘤细胞的生长和增殖26];波形蛋白可以减少细胞表面粘附因子的表达,从而促进细胞迁移和入侵的发生。它是多种癌症组织中高度表达,特别是在癌症和转移(27];蛞蝓起源于神经嵴和被报道参与调节肿瘤细胞入侵,迁移,细胞周期,和其他活动28]。在这项研究中,qPCR和免疫印迹实验进行证明CPP治疗U251的差别会导致对这些基因的mRNA和蛋白表达水平的Cyr61 CCND1,波形蛋白,和蛞蝓不同程度,表明CPP扮演关键角色在调节增殖,凋亡,迁移,并通过抑制入侵神经胶质瘤GSK3的表达β/β连环蛋白下游致癌基因Cyr61, CCND1、波形蛋白和蛞蝓。

在这项研究中,首次从树叶中提取的粗多糖Cyclocarya成果净化和干燥后,CPP是获得。通过一系列体外实验基于神经胶质瘤细胞U251,发现CPP有一定的细胞毒性效应抑制细胞增殖、凋亡、迁移和入侵。此外,在机理研究中,我们还发现,CPP可以抑制GSK3的激活β/β连环蛋白信号通路。此外,通过抑制GSK3β/β连环蛋白信号通路,CPP的表达水平可以减少增殖,凋亡,迁移和入侵Cyr61和CCND1等相关的基因。这些结果表明,CPP可能在神经胶质瘤的治疗起到防护作用,值得进一步研究。

数据可用性

所有可用的数据与手写笔记本记录在我们的实验室。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是由潍坊科技发展计划项目(批准号2019 yx040)。

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