锰的影响₃O₄纳米粒子在Lipopolysaccharide-Induced人肌腱细胞炎症因素及其机制

文摘

客观的。探讨Mn的效果₃O₄纳米颗粒(Mn₃O₄NPs)炎症因素引起的脂多糖(LPS)在人类肌腱细胞及其机制。方法。锰的₃O₄NPs被水热方法合成。RT-qPCR被用来探测microrna的表达水平与人类肌腱细胞的炎症有关。包含pyrin NLRP1的表达水平(nod样受体域1)被西方墨点法测量。ELISA试验是用来测量肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β、il - 4和il - 10。之间的关系mir - 181 - 5 - p和NLRP1被dual-luciferase记者试验验证。结果。锰₃O₄NPs在本研究生产棕色球形粒子平均尺寸7 - 10纳米。锰₃O₄NP处理显著降低TNF -的水平α和il - 1β但增加了水平的il - 4和il - 10在人类肌腱细胞由有限合伙人。此外,锰₃O₄NP处理显著增加了表达水平mir - 181 - 5 - p。NLRP1之一的目标mir - 181 - 5 - p和mir - 181 - 5 - p下调其表达式。进一步的研究表明,锰₃O₄NPs可以减轻人类肌腱细胞的炎症反应引起的有限合伙人通过上调mir - 181 - 5 - p因此下调NLRP1的表达。结论。锰₃O₄NPs影响炎性细胞因子的表达在人类肌腱细胞诱导由有限合伙人调制的分子轴mir - 181 - a - 5 - p / NLRP1。

1。介绍

肌腱炎的炎症跟腱造成的压力。它经常出现在手中,手腕、肩膀和膝盖。随着越来越多地使用计算机,控制鼠标一直是最常见的手,肌腱炎的影响,近年来其发病率一直在增加1]。最近,纳米材料与新结构、新特性和新功能已被广泛应用于治疗各种疾病包括肿瘤(2)、自身免疫性疾病等。3];研究还表明,纳米颗粒具有良好疗效的治疗炎症性疾病(4]。其中,锰₃O₄纳米颗粒(Mn₃O₄NPs)已经被证明是减轻炎症引起的小鼠耳朵ROS (5]。脂多糖(LPS),革兰氏阴性细菌细胞壁的组成部分,通常被用来刺激细胞产生炎症介质建立细胞模型炎症。然而,没有报告关于锰的影响₃O₄NPs在LPS-induced肌腱炎症因子水平和监管机制。因此,在这项研究中,为肌腱炎的治疗提供一个新的策略,人类肌腱细胞被LPS诱导形成腱炎模型,和锰的影响₃O₄NPs在炎症因子的表达水平。

2。材料和方法

2.1。细胞系和试剂

人工腱细胞HT(猫。不。PR203)从北京购买伏波生物技术有限公司,有限公司胎牛血清、DMEM培养基,青霉素、链霉素和从广州购买Ruite生物技术有限公司有限公司Mn (OAc)₂⋅4 h₂O和试剂盒一步RNA提取试剂购自上海边生物技术有限公司,有限公司反向转录工具包,总蛋白提取设备,和dual-luciferase报告基因检测设备从武汉纯度生物技术有限公司购买,Lipofectamine 2000年装备明明是购自上海生物科技有限公司有限公司TNF -α,il - 1β、il - 4和il - 10 ELISA试剂盒购自上海Kemin生物技术有限公司,有限公司

2.2。准备和Mn的识别₃O₄纳米粒子

低温酯化方法报道李et al。6)被用来准备Mn₃O₄纳米粒子。具体地说,1 g的Mn (OAc)₂⋅4 h₂O在60毫升绝对乙醇溶解,搅拌磁直到完全溶解,加入100毫升的聚四氟乙烯,放置在一个高压灭菌器在120°C进行处理。24小时后,冷却至室温,用去离子水清洗三次获得锰₃O₄NPs。利用透射电子显微镜(TEM)观察颜色,和激光粒度分析仪是用于分析准备锰的形态和粒径₃O₄NPs。准备的锰₃O₄NPs与x射线衍射(XRD)分析。

2.3。细胞培养和转染

人类肌腱细胞在DMEM培养基培养HT是含10%胎牛血清,100 U / l青霉素、和100 mg / l链霉素(含10%胎牛血清),在37°C公司为5%₂。一旦细胞生长稳定,1毫克/毫升脂多糖(LPS)添加到构建人工腱细胞炎症模型。经过24小时的治疗,mir - 181 a - 5 - p模仿,mir - 181 - 5 - p抑制剂,和si-NLRP1转染到细胞根据实验设计。实验组包括NC组(HT细胞没有转染治疗),mir - 181 - 5 - p模仿集团(超表达mir - 181 - 5 - HT细胞p), si-NLRP1集团(HT细胞基因敲除NLRP1)和si-NLRP1 + mir - 181 - 5 - p抑制剂组(同时击倒NLRP1和mir - 181 - 5 - HT细胞p)。Lipofectamine 2000工具包用于转染根据指令。48小时后,转染细胞进行后续实验。

2.4。锰的测定₃O₄Mn的NP细胞毒性和治疗₃O₄NPs

采用MTT法检测Mn的细胞毒性₃O₄NPs HT细胞。HT细胞培养在96 -孔板。孵化后一夜之间,新鲜的培养基是改变,不同浓度(0、2、4、6、8、10μMn的g / ml)₃O₄NPs添加和孵化。孵化48小时后,新鲜的培养基和MTT添加,细胞在570 nm的吸光度检测到标来确定Mn的细胞毒性₃O₄NPs HT细胞。细胞毒性测试后,每个实验组HT细胞治疗10μg / ml Mn₃O₄NPs 48 h。

2.5。RT-qPCR

在每个实验组细胞总RNA提取试剂盒的一步到位的方法。2μl的总RNA是相对地转录成cDNA根据逆转录工具包指令。逆转录产品是放置在一个PCR反应的仪器。20μ系统包含0.5 l反应μl逆转录产品,1μl上游和下游引物,10μ7.5 l SYBR预混料Taq交货,μl RNase-FREE水。反应条件是90°C 10分钟,30年代95°C, 1分钟55°C。共有50个周期进行。

引物序列如下:

mir - 181 a - 5 - p上游引物序列:5 - - - - - -CGGCAACATTCAACGCTGT-3 ;

mir - 181 a - 5 - p下游引物序列:5 - - - - - -GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3 。U6上游引物序列:5 - - - - - -CTTCGGCAGCACATATAC-3 ;U6下游引物序列:5 - - - - - -GAACGCTTCACGAATTTGC-3 。

定量荧光检测结果计算了2^{- - - - - -ΔΔCt}方法。

2.6。西方墨点法

每个实验组的总蛋白提取总蛋白提取工具。变性蛋白质的等值样本加载,和sds - page电泳。2 h后的电泳膜转移在100 V。这部电影是转移后密封在脱脂奶粉5%。2 h后,膜清洗,主要抗体(ani-NLRP1, 1: 1000;ani-GAPDH, 1: 1000)补充说,一夜之间在4°C的环境。第二天,洗膜后,增加了二次抗体(1:1000),在室温下孵化2 h。反应完成后,这部电影是清洗和化学发光为发展和开发的解决方案是添加照片。灰度分析蛋白质的乐队使用ImageJ执行软件。

2.7。ELISA

每个实验组的细胞上清液离心得到的,和TNF -的内容α,il - 1β、il - 4和il - 10测定酶联免疫试剂盒的指示。在特定的,100μl标准样本和测试样本被添加到96孔板和孵化37°C 1小时和冲洗清洗解决方案。100年μl的主要抗体工作的解决方案是添加到每个好,混合,孵化37°C。1小时后,板洗;100年μl enzyme-labeled抗体工作解决方案添加和孵化37°C。30分钟后,板又洗了;100年μl衬底工作的解决方案是添加和反应在37°C在黑暗中。15分钟后,100年μl反应停止的解决方案是添加在37°C和样本进一步孵化10分钟。反应完成后,OD值衡量标,和标准曲线确定的内容吸引TNF -α,il - 1β、il - 4和il - 10在测量样品。

2.8。双荧光素酶报告实验

3 - - - - - -UTR碎片的野生型和突变体NLRP1基因放大并插入到双荧光素酶报告基因质粒。报告基因质粒和mir - 181 - 5 - p模仿cotransfected进T293细胞和培养。48小时后,测定荧光素酶的活动。

2.9。统计分析

本研究中所有实验数据表示为 。数据使用SPSS 22.0进行分析。的 - - - - - -测试是用来比较两组,采用单向方差分析比较多个组。 或 表明,差异具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Mn的识别₃O₄纳米颗粒和细胞毒性的检测

用透射电子显微镜观察,准备的锰₃O₄NPs是球形粒子,如图1(一)。Mn的粒度分布₃O₄NPs激光粒度分析仪分析了约7 - 10海里,如图1 (b)。x射线衍射分析结果表明,锰₃O₄NPs衍射峰与Mn一致性良好₃O₄标准表(JCPDS卡片号24 - 0734)和不含杂质峰,如图1 (c),用于后续实验。MTT试验的结果表明,锰₃O₄NPs没有明显毒性HT细胞在实验范围内,如图1 (d)。

3.2。锰的影响₃O₄纳米粒子在人类肌腱细胞炎症因子引起的有限合伙人

ELISA结果表明TNF的表达水平α和il - 1β在HT细胞显著增加LPS诱导后( ),il - 4和il - 10的表达水平明显下降( )。与LPS组相比,Mn₃O₄NP治疗显著降低TNF的表达水平α和il - 1β在细胞( ),il - 4和il - 10的表达水平显著增加( )(图2)。因此,锰₃O₄NP治疗显著地抑制LPS-induced人类肌腱细胞炎症。

3.3。锰的影响₃O₄纳米粒子在炎症相关的microrna的表达水平在人类腱Cell-Induced有限合伙人

rt - pcr结果表明,锰₃O₄NPs影响炎症相关的microrna的表达水平在HT细胞引起的有限合伙人,和mir - 181 a的表达水平- 5 - p明显高于治疗组,如图3。机制mir - 181 - 5 - p影响LPS-induced人肌腱细胞炎症在后续实验中进一步探讨。

3.4。针对关系mir - 181 a - 5 - p和NLRP1

母星数据库被用来预测NLRP1的结合位点和mir - 181 - 5 - p如图4(一)。双荧光素酶实验的结果表明,mir - 181 - 5 - p模仿的荧光素酶活性显著降低NLRP1野生型向量( ),但没有影响的荧光素酶活性NLRP1变异向量(图4 (b))。此外,免疫印迹结果表明,过度的mir - 181 - 5 - p的表达水平显著降低NLRP1蛋白质LPS-induced HT细胞( )(图4 (c))。从这些结果,似乎有一个针对关系mir - 181 - 5 - p和NLRP1 LPS-induced人肌腱细胞和mir - 181 - 5 - p下调NLRP1表达式。

3.5。锰的机理₃O₄纳米粒子影响LPS-Induced人肌腱细胞炎症因素

ELISA结果显示,淘汰赛的NLRP1 TNF的表达水平显著降低α和il - 1β在HT细胞诱导由有限合伙人( )il - 4和il - 10的表达水平显著增加( )。与NLRP1击倒组相比,治疗与Mn NLRP1击倒₃O₄NPs显著降低TNF的表达水平α和il - 1β( )当时和il - 4和il - 10的表达水平显著提高( )。肿瘤坏死因子的表达水平α和il - 1β在si-NLRP1 +锰₃O₄NPs + mir - 181 a - 5 - p抑制剂组高于si-NLRP1 +锰₃O₄NPs集团( ),和il - 4和il - 10的表达水平低于si-NLRP1 +锰₃O₄NPs集团( )。相比之下,si-NLRP1 +锰₃O₄NPs + mir - 181 a - 5 - p抑制剂组TNF的表达水平α和il - 1β在锰增加₃O₄NPs + mir - 181 a - 5 - p抑制剂组( ),而IL - 4和IL表达水平下降( )(图5)。从上面的实验结果,似乎锰₃O₄NPs调节mir - 181 a LPS引起的p - 5 - HT细胞表达下调NLRP1的表达,从而抑制LPS-induced HT细胞炎症。

4所示。讨论

肌腱炎会导致异常的正常肌腱的生物属性,如增厚的肌腱和滑膜的破坏,并造成的疼痛严重影响患者的日常活动(7]。作为日常劳动的双手是主要的器官,肌腱的手非常容易累积应变;因此,在临床实践(手炎也很常见8]。当地激素注射腱炎的治疗是目前最常用的方法,但研究表明,局部激素注射造成的风险坏死肌腱胶原蛋白(9]。近年来,随着纳米粒子的深入研究,其在治疗炎症性疾病的重要作用也被证实(10]。

锰₃O₄NPs纳米材料与enzyme-like活动,显示良好的治疗炎性疾病的潜在治疗。研究证实,Mn₃O₄NPs功能可以模拟超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX),可以显著清除超氧化物阴离子自由基和过氧化氢和羟基自由基保护细胞免受氧化损伤(11]。ROS失衡包括超氧化物阴离子自由基、过氧化氢、羟自由基通常发生在炎症。因此,锰₃O₄NPs高活性氧的清除活性和高稳定性可以显著减轻ROS-induced老鼠耳朵炎症反应(12]。然而,很少有关于锰的报告₃O₄NPs治疗炎症,并研究其作用机制缺乏。这项研究的结果表明,锰₃O₄NPs显著降低的水平proinflammatory-related LPS引起的蛋白质在人类的肌腱细胞和增加anti-inflammatory-related蛋白质的水平,减轻炎症反应。

小分子核糖核酸(microrna),作为一种非编码单链类小分子rna组成的19到22个核苷酸,可以针对信使rna降解或抑制翻译过程,从而调节细胞的生理过程13]。许多研究已经证实inflammatory-related疾病的发生和发展与microrna[密切相关14]。例如,研究表明,microrna的表达水平- 146 a与炎症反应的严重程度呈正相关,可以作为一个指标的炎症反应疾病活动(15]。研究Marques-Rocha et al。13)表明,不断调节mir - 155也能导致持续的炎症反应。其中,mir - 181 a也被证明与炎症有关。研究表明,mir - 181 a可以显著抑制炎症因子il - 1的表达β、il - 6和TNF -α在巨噬细胞由有限合伙人(16]。此外,mir - 181还会影响子宫肌层的炎症反应,调节ER的表达水平α和c-Fos17]。研究也表明mir - 181 a参与的反应调节炎症刺激的地信号通路(18]。本研究的实验结果也证实,mir - 181 a - 5 - p是参与调节炎症因子的表达在人类的肌腱细胞引起的有限合伙人。

microrna发挥重要作用在炎性疾病的发生和发展通过绑定到目标基因和调控目标蛋白的表达与炎症有关。NLRP1协会和炎症已经证明(19]。NLRP1广泛出现在T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突细胞。不刺激时,NLRP1富亮氨酸repeat-rich域绑定到中央nucleotide-binding寡聚化地区(麦克)self-oligomerization抑制和处于不活跃状态。刺激后,其域的变化,结合蛋白质如apoptosis-related speckle-like蛋白(ASC)和semi-aspartase (caspase-1)形成蛋白质复杂的称为inflammasome,可调节白介素表达水平,激活了NF -κB和MAPK信号通路,参与机体的炎症反应(20.]。证明了促炎因子包括肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)由单核巨噬细胞功能的免疫调节,参与发烧和炎症,可以进一步诱发其他细胞因子的生产21]。Interleukin-1β(il - 1β),多效性的因素,是宿主对感染的反应的主要中介或组织损伤22]。的不平衡和免疫因素,尤其是Th1 / Th2免疫反应,经常发生炎症反应,其中interleukin-4 (il - 4)、白细胞介素- 10”(il - 4)的Th2子集产生的CD4 + T细胞。il - 10可以提高表达水平的炎症反应(23]。研究已经证明,在大鼠肌腱细胞炎症模型,刺激因素的激活可以促进NLRP inflammasomes将f -肌动蛋白细胞骨架,从而增加炎症因子的表达和释放肿瘤坏死因子-α、il - 6和il - 1β加重炎症的发展(24]。这项研究的结果表明,mir - 181 - 5 - p下调NLRP1表达在人类的肌腱细胞由有限合伙人,并敲NLRP1显著缓解人类肌腱细胞诱导的炎症反应有限合伙人。

这项研究的结果表明,锰₃O₄NP处理可以显著减少促炎因子TNF -的水平α和il - 1β在人类的肌腱细胞引起的有限合伙人和增加il - 4和il - 10的水平。进一步研究证实,Mn₃O₄NPs调节mir - 181 a - 5 - p在人类的肌腱细胞由有限合伙人,和通过下调NLRP1的表达从而减轻LPS-induced人类肌腱细胞炎症。

数据可用性

所有可用的数据与手写笔记本记录在我们的实验室。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持的2017义乌一般科研项目(17-1-13)。

引用

1. 国家地震恢复重建局l·帕多瓦,d . Coraci c . et al .,“腕管综合症:临床特征、诊断和管理,“《柳叶刀神经病学,15卷,不。12日,第1284 - 1273页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. l . j .叮,陈、高et al .,“工程与增强肿瘤纳米药物渗透,”纳米今天第100800条,卷。29日,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. 李z, x, w .徐,w .歌曲,j .丁和陈x,“免疫调节纳米系统。”先进的科学》第六卷,没有。17日,1900101条,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. 问:张先生,d . Dehaini y . Zhang et al .,“中性粒细胞membrane-coated纳米颗粒抑制滑膜炎症和缓解类风湿性关节炎关节损伤,”自然纳米技术,13卷,不。12日,第1190 - 1182页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. m . j .姚明,y Cheng周et al .,“ROS清除Mn₃O₄nanozymes为在活的有机体内抗炎。”化学科学,9卷,不。11日,第2933 - 2927页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. x李问:l . p .周j .高h .苗族h .张合成锰和j·徐。₃O₄在碳氢化合物氧化纳米粒子及其催化应用。”粉技术,卷190,不。3、324 - 326年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. l·迪普雷Gaut和d,自己叙说“肌腱发展和疾病,”威利跨学科评论:发育生物学,5卷,不。1,5-23,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. “e·r·瓦格纳和m . b . Gottschalk以及病变的前臂、手腕和手,“诊所整形手术,46卷,不。3、317 - 327年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. j·c·肯尼迪和r·b·威利斯,”在肌腱局部注射类固醇的影响:生物力学和微观相关研究中,“美国运动医学杂志》上,4卷,不。1,乳,1976页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. c . Dianzani f . Foglietta b·费拉拉et al .,“固体脂质纳米粒子提供抗炎药治疗炎症性肠病:效果在一个模型中,“世界胃肠病学杂志》上,23卷,不。23日,第4210 - 4200页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. n·辛格·m·A·Savanur s .斯利瓦斯塔瓦·德席尔瓦和g . Mugesh氧化还原调节锰₃O₄nanozyme工艺等活动提供了有效的cytoprotection人类细胞在帕金森病模型中,“《应用化学》卷,56号45岁,14267 - 14271年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. m . Zendjabil s Favard c .谢霆锋o . Abbou b . Hainque,“小分子核糖核酸的生物标记:前景什么?”政府建筑渲染的生物学,卷340,不。2、114 - 131年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. j·l·Marques-Rocha m . Samblas f i已明显减少,j . Bressan j·a·马丁内斯和a·马蒂“非编码rna、细胞因子和炎症相关的疾病。”美国实验生物学学会联合会杂志卷,29号9日,第3611 - 3595页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. c . l . y . Tan Yu, k . Chen j . Lu和l . Tan microrna - 146 a变弱的炎症在体外脊髓损伤模型通过抑制TLR4信号”实验和医学治疗,16卷,不。4、3703 - 3709年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. 巴拉,t . Csak b萨哈et al .,“mir - 155的促炎效应促进肝纤维化和饮酒导致的肝病,”肝脏病学杂志,卷64,不。6,1378 - 1387年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. x j . Du j . m . Lu和y沙,”米尔- 181抑制血管炎症引起ox-LDL通过针对人类巨噬细胞TLR4、”细胞生理学杂志,卷233,不。10日,6996 - 7003年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. w·n·l·高g . Wang, h .亲属h·l·弗朗哥和c·r·门德尔松”之间的相互反馈mir - 181 a和E2 / ERα在子宫肌层增强炎症导致劳动。”《临床内分泌和代谢杂志》上,卷101,不。10日,3646 - 3656年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. g . h . Li di, y, r·雪j . Zhang和j .梁”microrna微rna - 155和- 181 a,通过HO-1参与调节肾脏的镉暴露的免疫毒性鲤属carpio”,鱼类和贝类免疫学卷,95年,第480 - 473页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. c . h . Yu j . Moecking m·盖尔和s . l .大师”机制NLRP1-mediated autoinflammatory疾病在人类和老鼠,”分子生物学杂志,卷430,不。2、142 - 152年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. 公元Truax r . Liu, l . Chen等人“先天免疫受体的表达谱,NLRs AIM2,在人类大肠癌:与癌症相关阶段和inflammasome组件,”Oncotarget》第六卷,没有。32岁,33456 - 33469年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. d, d . Chen x Zhang et al .,“c-Jun n端激酶和一种蛋白激酶信号通路调节肿瘤坏死因子-α全身interleukin-32表达人类肺成纤维细胞:在气道炎症影响。”免疫学,卷144,不。2、282 - 290年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. d . Gleiznys a . Gleiznys l . Abraškevičiūtėa . Vitkauskienė诉Šaferis和j . Sakalauskienėinterleukin-1和白细胞介素- 10”β细胞因子表达在慢性peri-mucositis患者的白细胞,”医学科学监控25卷,第7479 - 7471页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. g·r·甘地,m . t . s . l .布、r . g . Sathiyabama et al .,“类黄酮Th1 / Th2细胞因子免疫调制剂:系统回顾研究的动物模型,”植物学期刊,44卷,第84 - 74页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. 问:陈,j .周张,z,罗,和g的歌,“循环拉伸加剧炎提高NLRP3 inflammasome活动通过f -肌动蛋白解聚,“炎症第41卷。。5,1731 - 1743年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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