种植党参多糖对肝细胞癌的增长和运动性HepG2细胞通过调节β连环蛋白/ TCF4通路

文摘

客观的。研究种植党参多糖的影响(CPP)对HepG2细胞的增长和能动性及其可能的机制。方法。细胞随机分为对照组、CPP (5μ米)组,CPP (10μ米)组和CPP (20μ米)。入侵扩散,迁移能力,和表达的蛋白质参与epithelial-mesenchymal过渡(EMT)和HepG2细胞信号通路被CCK8化验检测,BrdU染色,Transwell,划痕试验,分别和免疫印迹。结果。种植党参多糖抑制HepG2细胞的增殖培养体外连同Ki67和PCNA蛋白的表达水平( ),减少侵入性细胞的数量( ),和减少划痕关闭率( )。它还调整血管内皮生长因子(VEGF)的表达,钙和N-cadherin ( )。的差别之外,对这些基因β连环蛋白、TCF4和原癌基因蛋白表达( )也观察到。结论。种植党参多糖可以抑制增殖和运动性HepG2细胞培养在体外,和底层机制提出了相关的抑制β连环蛋白/ TCF4通路。

1。介绍

肝细胞癌(HCC)是全世界癌症相关死亡的主要原因之一。与肝癌相关的主要驱动因素包括慢性感染乙肝和慢性丙型肝炎,酒精性肝病和非酒精性脂肪肝病。尽管新技术进步的预防、筛查、诊断和治疗肝细胞癌的疾病的发病率和死亡率继续上升。全球每年约有600000人死于肝癌。治疗不同考虑不同的肿瘤负荷和转移;此外,治疗晚期肝癌是昂贵的和无效的1- - - - - -3]。因此,有必要扩大研究关于肝细胞癌的治疗并确定更有效的治疗药物。种植党参,也称为党参,属于桔梗科家族。干根从其亚种党参、suhuadangshen或chuandangshen,含有多糖、皂甙、倍半萜类、多酚类、萜类、生物碱、挥发油、和其他成分,通常是准备医学使用。种植党参多糖(CPP),种植党参中有效成分之一,在医学领域引起了广泛关注由于其广泛的生理和生物活性。先前的研究已经表明,种植党参多糖免疫增强的影响,杀毒,肝保护和神经保护4- - - - - -9]。值得注意的是,从种植党参多糖中扮演一个重要的角色在不同的肿瘤细胞生长抑制乳腺癌和宫颈癌等(10,11]。然而,目前很少有报道的党参多糖的效果对人类肝癌HepG2细胞。所有这些在一起,在这项研究中,我们研究了人类肝癌HepG2细胞培养在体外和探索的党参多糖的影响对肝癌细胞的增殖和转移及其可能机制。

2。材料和方法

2.1。试剂和仪器

党参多糖(纯度≥98%)从中国购买食品和药物管理局研究所。DMEM细胞培养基、0.25%胰蛋白酶和胎牛血清从Gibco购买,美国。从罗氏集团购买CCK8工具包。Transwell室购买从北京联通生物技术有限公司单克隆抗体和辣根peroxidase-labeled二级抗体购自Abcam,英国。里帕溶解产物从σ购买,美国。BCA试剂盒购自Biyuntian生物技术。BrdU检测试剂盒是购买从广州Ruibo生物有限公司

电泳仪和半干的电影传输设备是从美国伯乐公司购买的。凝胶视图6000化学发光凝胶成像系统从广州购买Yunxing仪器有限公司普通光学显微镜从日本奥林巴斯公司购买。

2.2。细胞培养

人类肝癌细胞HepG2细胞线从FuHeng购买中心,上海,中国。细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基和1% cyan-streptomycin 37°C的5%的股份有限公司₂孵化器和亚文化,当细胞融合率达到80%。

2.3。实验方法

2.3.1。细胞活性检测CCK8化验

细胞被播种在96孔板的密度 细胞/毫升。细胞附件后,细胞治疗与不同浓度的CPP(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200年和400年μ6米)24 h,复制井/浓度。24小时后,10μL (CCK8试剂添加到每个孵化后,37°C 4 h;活动的每一个被一个enzyme-labeling测量仪器。根据测试结果,导致CPP浓度超过80%的细胞活性被选为后续实验。

2.3.2。BrdU染色细胞增殖

细胞被播种在6-well板1毫升的细胞悬液的密度 细胞/毫升为每个。细胞附件后,细胞培养介质中含0.4%的边后卫为72小时,每组包含3井复制。这些细胞被随机分为4组:对照组、CPP (5μ米)组,CPP (10μ米)组和CPP (20μ米)。相应的治疗后最终浓度的酒,BrdU最终浓度为0.03μg / mL之前添加另一个40分钟的孵化。培养基是丢弃,板与PBS洗了三次,10分钟与多聚甲醛固定,细胞增殖试验严格按照执行指令。BrdU-positive细胞的数量是在显微镜下计数。

2.3.3。Transwell检测细胞入侵的能力

的细胞被播种到参议院Matrigel-coated Transwell钱伯斯的密度 在培养基培养细胞/毫升,不含胎牛血清,在众议院,正常细胞培养基是补充道。根据部分后分组2.3。1并进一步文化48小时,细胞在参议院用无菌棉拭子擦拭,和细胞迁移到众议院和结晶紫染色。随机选择五个字段为每个组计数。每组有6井复制。

2.3.4。细胞迁移能力被划痕试验检测

细胞在12-well无菌播种密度板 细胞/毫升。附件的细胞在墙上后,水平线垂直于标记被吸引的10μL枪顶,盘子与PBS洗3次。根据部分后分组2.3。1和药物管理,板进一步培养24小时。伤口闭合率=(初始宽度,测量宽度)/ %。

2.3.5。免疫印迹检测细胞增殖、EMT和通路蛋白表达

每组的总蛋白提取与里帕蛋白质溶解产物在冰上,和蛋白质的浓度测定,通过为每个组BCA试剂盒被夷为平地。等量的蛋白质组分离12% sds - page和转移到PVDF膜。5%的脱脂牛奶的膜被封锁在室温下2 h。污点是孵化在初级抗体在一夜之间在4°C。第二天,主要抗体是丢弃,buffer-washed PVDF污点在相应的二次孵化抗体室温1小时。成像,它的解决方案是添加在黑暗中一滴一滴地吸干接触和发展的空间。在这项研究中,GAPDH作为内部参考。

2.4。统计方法

所有实验数据与统计软件SPSS 19.0统计分析。组之间的差异进行了测试 , - - - - - -测试,或者单向方差分析。实验结果被表示为 。被认为是显著的区别 。

3所示。结果

3.1。CPP对HepG2细胞体外培养的扩散

不同浓度的影响的CPP HepG2细胞的存活率被CCK8试验测量,如图1。当CPP浓度达到50μ米以上,HepG2细胞的存活率仍不到80%。它表明,CPP 50浓度μ米对HepG2细胞有明显的细胞毒性的影响。因此,我们选择3最大浓度为5,10,20μ为后续实验没有明显的细胞毒性。

细胞的增殖是BrdU染色发现的。结果表明,BrdU-positive细胞的数量CPP-treated组显著低于对照组( ,图2(一个))和CPP的浓度成反比。同时,进一步扩散的蛋白质的表达水平检测到免疫印迹。结果表明,在CPP-treated Ki67和PCNA蛋白的表达水平细胞明显低于对照组( ,图2 (b)),也CPP浓度的差异。

3.2。CPP对HepG2细胞体外培养的入侵能力

细胞入侵能力取决于Transwell试验,结果表明,与对照组相比,CPP-treated组显著降低入侵细胞的数量( ,图3);此外,数量与CPP治疗浓度的增加减少。

3.3。CPP对HepG2细胞的迁移能力培养的体外

细胞迁移能力由划痕试验测试。结果表明,伤口闭合率CPP-treated组明显低于对照组( ,图4)和CPP浓度。

3.4。CPP对HepG2细胞培养中EMT-Related蛋白的表达在体外

在每组细胞的形态学观察显微镜下。对照组的细胞大多呈形状或近方形紧密的安排。当CPP治疗后,细胞逐渐显示长梭形宽松的安排。

免疫印迹结果代表EMT-related蛋白质在细胞的表达水平。结果表明,VEGF的表达水平和N-cadherin CPP-treated组与对照组相比显著减少( ,图5)。相反,钙粘蛋白的表达水平显著调节( ,图4)和CPP浓度。

3.5。CPP对HepG2细胞培养中蛋白质的表达途径在体外

的表达水平β连环蛋白、TCF4 CPP-treated细胞原癌基因蛋白明显低于对照组( ,图6)和中国共产党呈正相关,治疗浓度。

4所示。讨论

肝细胞癌是一种原发性肝癌大多数肝癌所属。来自肝脏的恶性肿瘤上皮细胞或间充质组织,容易发生血管侵犯和转移,主要开发门静脉及其分支,肝静脉或其分支机构,和肝脏的下腔静脉,同型聚集在门静脉是肝细胞癌最常见的转移(2- - - - - -12]。病因和确切分子机制仍不清楚,这是目前被认为是一个多因素、多步骤复杂的过程。治疗方法是专门为每个单独的和综合治疗取决于疾病的不同阶段。类型主要包括手术治疗、肝动脉结扎,射频、冷冻、激光、微波、和化疗。许多研究表明,种植党参多糖具有多种生物功能,包括心血管和脑血管的保护,增强免疫力和抗肿瘤的活动(4- - - - - -11]。基于以上事实,我们研究人类肝癌HepG2细胞和进一步研究党参多糖的影响肝癌细胞的增殖和转移能力在体外及其可能的机制。

首先,种植党参多糖对HepG2细胞的增殖在体外被BrdU染色检测。发现种植党参多糖剂量依赖性降低BrdU-positive细胞HepG2细胞的数量。种植党参多糖的影响扩散Ki67蛋白和PCNA的表达水平在肝细胞癌HepG2细胞被免疫印迹实验进一步检查。这是确认的党参多糖剂量依赖性抑制扩散的蛋白质的表达水平。这些结果符合鑫et al。种植党参多糖的影响的研究对卵巢癌ho - 8910细胞(11]。另一方面,白等的研究(13)表明,这两种水溶性多糖提取党参多糖可以抑制HepG2细胞的生长,和底层机制与诱导细胞周期阻滞和关键蛋白表达抑制。

为了测试的党参多糖的影响肝细胞癌的能动性HepG2细胞体外培养,我们进行了划痕试验和Transwell实验中,这两个证明了党参多糖的抑制作用的能动性HepG2细胞培养在体外。所有这些结果都符合白等的研究(13]。

肿瘤细胞迁移能力的提高是组织浸润和远处转移的基础。上皮间充质转变(EMT)是一个过程的极化上皮细胞失去上皮细胞并获得间质属性,从而增加细胞转移和入侵;它是一个重要的生物过程,促进肿瘤侵袭和转移14,15]。钙作为一种重要的细胞粘附因子,参与介导细胞间粘附和密不可分的各种肿瘤的浸润和转移。其低表达或损失的表达在上皮间充质转变中发挥着关键作用16]。研究表明,(17]超表达的TCF4狗肾上皮细胞可以增加细胞入侵的能力,从而加速肿瘤EMT的发生,这可以表示为上皮标记蛋白质钙粘蛋白差别显著的对这些波形蛋白和间质upregulation标记蛋白质。分子机制的进一步探索运动性的种植党参多糖的影响肝癌细胞培养在体外,我们进行免疫印迹,发现种植党参polysaccharide-treated细胞显示更高的上皮标记蛋白质钙粘蛋白的表达,但低间隙标记蛋白N-cadherin和迁移标记蛋白的表达VEGF。结果表明,种植党参多糖可以抑制人类肝癌之间失去极性HepG2细胞培养在体外缓慢发展的基质细胞,减少细胞的浸润和转移能力,从而延缓EMT HepG2细胞的发生。

Wnt信号途径参与肿瘤的形成。激活后,β连环蛋白把进入细胞核竞争性结合TCF4形成β连环蛋白/ TCF4复杂。TCF4复杂然后激活下游转录因子,如cycD和原癌基因,最终导致细胞异常增殖和肿瘤发生[18,19]。研究表明,目标TCF4基因的异常激活Wnt信号可以促进大肠癌恶性转变20.的差别,对这些Wnt /β连环蛋白信号通路可以抑制epithelial-mesenchymal过渡nonsmall细胞肺癌(21]。因此,为了调查的监管作用浓度的党参多糖治疗信号通路β连环蛋白/ TCF4及其对人类的影响肝癌HepG2细胞培养在体外,我们进行了一系列的实验,发现的表达β连环蛋白、TCF4和下游原癌基因蛋白明显抑制。这些结果表明,种植党参多糖可以抑制增殖,入侵,EMT的人类肝癌HepG2细胞通过表达下调β连环蛋白/ TCF4信号通路。

总之,本文探讨了扩散的党参多糖的作用,入侵,间质转化人类肝癌HepG2细胞培养在体外,这表明抑制β-连环蛋白/ Tcf4种植党参多糖与蛋白表达的人类肝癌的发展和转移HepG2细胞体外培养。本文还提供了实验数据的党参多糖的作用在肝癌的发生和发展,但仍然存在缺乏研究的党参多糖对细胞生长和转移的影响及其在肝癌细胞的生长作用体内的通路抑制剂/激活。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持的怀安科技项目(HAB201723)。

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