的抗癌活性枸杞多糖通过抑制自噬在人类皮肤鳞状细胞癌的细胞在体外和体内

文摘

客观的。本研究旨在调查的影响枸杞多糖(LBP)对人类皮肤鳞状细胞癌的增殖和凋亡A431细胞体外和体内通过对自噬的调节。方法。体外实验:A431细胞与不同浓度的枸杞多糖治疗,和细胞生存能力是衡量CCK8方法。使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。Ki67的表达,PCNA、cl-caspase-3 bcl - 2, LC3II和物的磷酸化状态ERK1/2,以及影响SP600125 cotreatment自噬和凋亡蛋白的表达,通过免疫印迹测定。体内实验:移植肿瘤模型建立了裸小鼠皮下注射A431细胞。50毫克/公斤枸杞多糖是注入小鼠腹腔内;小鼠的存活率,肿瘤的体积和重量测定30天。Ki67的表达和MMP-2蛋白免疫组织化学测定。结果。400年枸杞多糖的浓度μ克/毫升以上明显细胞毒性A431细胞,然而,50的剂量范围内μ200克/毫升~μg / ml,枸杞多糖显著地抑制Ki67和PCNA蛋白的表达,促进了cl-caspase-3的表达,抑制bcl - 2蛋白的表达,下调表达的自噬LC3II标志,并降低ERK1/2的磷酸化,而物磷酸化水平调节。同时,Beclin1的规定,LC3II、bcl - 2, cl-caspase-3枸杞多糖有效地扭转了cotreatment SP600125。此外,枸杞多糖增加移植裸体小鼠的存活率,减少肿瘤体积和重量,表达下调Ki67的表达和MMP-2。结论。枸杞多糖可以诱导细胞凋亡A431细胞通过抑制自噬和能抑制体内肿瘤的生长。

1。介绍

皮肤鳞状细胞癌(CSCC)是最常见的皮肤恶性肿瘤之一,仅次于基底细胞癌(BCC),这是发达国家在表皮角化细胞或附件的结构。更常见的男性患者和优先发生在老年人。它经常发生在病人的脸,头,和部分曝光在哪里更频繁;先进的病人容易发生淋巴结转移,构成严重威胁他们的生命(1- - - - - -3]。目前,手术切除是主要治疗早期CSCC病人预后通常为谁好;然而,对于中产阶级和晚期患者来说,他们通常需要接受各种治疗方法,如手术、放疗、化疗,预后通常是不可取的。近年来,靶向治疗对癌症患者(已取得了巨大的进步4,5),找到一个合适的药物结合有针对性的提供是癌症治疗的方法之一。一起,许多植物提取物抗肿瘤活性已经开始被用作癌症治疗的辅助药物。研究表明,枸杞多糖(LBP),中国草药的主要生物活性成分和食品补充剂,有抗氧化作用,抗衰老的,神经保护作用[6]。同样值得注意的是,枸杞多糖已被证明在抑制肿瘤的生长表现出显著的生物活性在体外和体内,包括膀胱颈、结肠、肝脏和肾脏癌症(6- - - - - -10]。自噬是一种进化保守的分解过程,回收蛋白质和受损的细胞器,在平衡中扮演一个重要的监管作用的细胞生存和死亡。它还参与多种疾病的发展,包括癌症(11,12]。然而,主要重点是抑制肿瘤细胞的机制通过枸杞多糖对细胞生长的影响,细胞凋亡、自噬;枸杞多糖之间的关系对人类CSCC A431细胞自噬还没有报道。因此,本研究初步关注的枸杞多糖对A431细胞增殖和凋亡的影响体外和体内及其相关机制。

2。材料和方法

2.1。主要材料

人类皮肤鳞状细胞癌细胞系A431是购自美国模式培养池;从σDMEM;从上海DMSO生物技术;胎牛血清,0.25%胰蛋白酶,从Gibco;从江苏CCK8工具Kaiji生物技术有限公司。膜联蛋白V-FITC /π凋亡检测设备从北京Solarbio科技有限公司有限公司;BCA试剂盒从Biyuntian生物技术有限公司。和Ki67抗体(猫。不。增殖细胞核抗原抗体:ab16667),(猫。 No.: ab92552), cl-caspase-3 antibody (Cat. No.: ab32042), Bcl-2 antibody (Cat. No.: ab32124), JNK antibody (Cat. No.: ab76125), p-JNK antibody (Cat. No.: ab4821), ERK1/2 antibody (Cat. No.: ab17942), p-ERK1/2 antibody (Cat. No.: ab214362), LC3B antibody (Cat. No.: ab51520), Beclin1 antibody (Cat. No.: ab210498), MMP-2 antibody (Cat. No.: ab92536), and goat anti-rabbit IgG-HRP secondary antibody (Cat. No.: ab6721) from Abcam; the immunohistochemistry kit was purchased from Zhongshan Jinqiao, Beijing. Mannose, glucose, galactose, xylose, rhamnose, and arabinose were purchased from the China National Pharmaceutical Group Co., Ltd. (Sinopharm).

2.2。方法

2.2.1。细胞培养

人类CSCC A431细胞接种在含10%胎牛血清的DMEM培养基和1% penicillin-streptomycin和培养在一个孵化器与恒温37°C和CO的浓度₂在5%。使用显微镜观察细胞粘附的增长。当细胞融合率达到80%以上,这与0.25%胰蛋白酶消化和通道。对数生长期细胞被选为后续实验。

2.2.2。枸杞多糖的分离和纯化

的枸杞在室温下干燥。然后,它在75°C和95%乙醇回流5小时,重复3次去除脂质和上层清液,以提取水果干渣。十册的干果残留物被蒸馏水在室温下3小时每次,重复4次。当时在5000转离心10分钟20°C,上层的收集和集中的10倍,其次是降水与95%乙醇体积比为1:在4°C 5 12小时。沉淀然后洗绝对乙醇,丙酮,乙醚,通过粗多糖(CLPB)。CLBP(100毫克)溶解在0.1 M氯化钠(10毫克/毫升)解决方案,这个解决方案和2毫升的被放置在一个DEAE cellulose-52列( )然后逐步筛选了0.1,0.3,和0.5 M氯化钠溶液的流量60毫升/小时。洗出液(5毫升/管)自动收集,碳水化合物是由phenol-sulfuric方法利用葡萄糖作为标准。这些多糖冻干脱水和透析后进行进一步的研究。

2.2.3。细胞增殖与CCK8试验测量

A431细胞悬液的浓度被播种 在96孔板在100μl /好,随机分为10组,枸杞多糖的解决方案不同的最终浓度给每组(0、5、10、20、50、100、200年,400年,800年和1000年μg / ml)。每组6个重复井建立了。文化的24小时后,10μl CCK8的解决方案是添加到每个好,再和孵化持续了4 h。之后,每个好测定的吸光度值标在450 nm,实验重复3次。人类的存活率CSCC A431细胞等于治疗组的平均吸光度值除以平均吸光度值在对照组乘以100%。

2.2.4。通过流式细胞仪检测细胞凋亡

A431细胞(密度, )被播种在6-well盘子,和细胞融合被分为四组:80% Ctrl,枸杞多糖(50μg / ml),枸杞多糖(100μg / ml)组和枸杞多糖(200μg / ml)组,孵化与介质含有枸杞多糖的最终浓度24 h。每组细胞收集和密度的调整 。根据设备指令,100μl细胞增加了5μl的膜联蛋白V-FITC和10μl (PI染色解决方案和孵化在黑暗中在室温下15分钟检测。

2.2.5。自噬,细胞凋亡和Pathway-Related蛋白表达的蛋白质印迹

细胞培养24 h在每个实验中收集,和总蛋白提取的冰箱使用里帕蛋白质溶解产物。在4°C,离心后的上层清液被蛋白质量化。然后进行sds - page和转移到PVDF膜。由此产生的蛋白质被5%的脱脂奶粉在室温下2小时。之后,主要的抗体增加,孵化一夜之间在4°C。主要的抗体被丢弃,和相应的二次抗体用辣根过氧化物酶标记添加和孵化1 h在室温下。ECL然后添加一滴一滴地接触发展在暗室。GAPDH是作为内部控制。

2.2.6款。准备移植肿瘤模型

6-8-week-old BALB / c裸小鼠从北京购买查尔斯河实验室动物科技公司,和实验进行了一个星期后的适应性喂养。A431细胞对数生长期的密度进行调整 ,和0.2毫升的细胞悬液注入颈背皮下注射。裸小鼠随机分为对照组和枸杞多糖(50毫克/公斤)。动物在枸杞多糖(50毫克/公斤)组有10毫克/公斤50毫克/公斤枸杞多糖溶液腹腔内,和对照组给予等量的矩阵的解决方案。药物管理日常连续一个星期。老鼠的生存数据记录,肿瘤体积测量每5天。老鼠牺牲在第30天,肿瘤是分离和体重。 。

2.2.7。Ki67和MMP-2在肿瘤组织的表达通过免疫组织化学方法检测到

节中获得的肿瘤组织2.2。4总是准备和切片,免疫组织化学染色法是根据指令执行。总之,部分是沉浸在3%的H₂O₂解决方案在37°C 30分钟,然后用PBS为3 * 5分钟。后,然后用10% BSA阻塞,主要抗体是添加和孵化一夜之间在4°C。然后用PBS冲洗5分钟,重复3次。之后,增加了二级抗体和孵化37°C 1 h,然后用PBS冲洗5分钟3次。民建联是用于颜色10年代和与自来水充分冲洗与苏木精复染色前30年代。之后,它又与自来水充分冲洗和中性胶添加后,常规脱水,最后盖玻片覆盖。Ki67的表达和MMP-2在显微镜下观察。

2.2.8。统计数据

所有得到的数据用SPSS 17.0进行分析。组间差异符合正态分布被单向方差分析测试。结果被表示为 。时被认为具有统计显著性的差异 。

3所示。结果

3.1。枸杞多糖的分离和纯化

摘要CLBP被乙醇沉淀分离,紫外光谱显示在280海里没有吸收峰,表明没有蛋白质CLBP,如图1。多糖的含量通过柱色谱法纯化用苯酚-硫酸法测定。六个洗脱峰的多糖被指定为LBP-1, LBP-2, LBP-3, LBP-4, LBP-5, LBP6根据洗脱列的顺序。六峰的多糖含量如表所示1。混合单糖溶液含有甘露糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖被用作控制高效液相色谱检测。通过对比单糖溶液混合曲线,每个峰的成分是不同的(见表1)。LBP-5拥有最高的多糖含量由阿拉伯糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、葡萄糖和鼠李糖,其中显示更高的内容比其他单糖。因此,我们选择LBP-5为了后续的实验和研究,这被称为枸杞多糖在接下来的实验。

3.2。枸杞多糖的影响在体外A431细胞的存活率

CCK8方法被用来测量的影响枸杞多糖在体外A431细胞的存活率。结果在图2表明A431细胞的存活率在每个枸杞多糖治疗组逐渐减少。与对照组相比,存活率LBP-treated组的400年,800年和1000年μg / ml显著降低( ),和枸杞多糖的半数抑制浓度为873.7μ克/毫升。换句话说,当枸杞多糖的浓度超过400μg / ml,它造成了重大A431细胞体外细胞毒性,和A431细胞的存活率不到80%。因此,后续实验研究使用三个最大治疗浓度的LBP不会引起明显的细胞毒性,即50,100年和200年μ克/毫升。

3.3。枸杞多糖对细胞凋亡率的影响A431细胞增殖和Apoptosis-Related蛋白的表达在A431细胞体外培养

A431细胞的凋亡率通过流式细胞术,检测结果如图3(一个)表明,凋亡的比例A431细胞增加每个LBP-treated组与对照组相比 ),枸杞多糖剂量依赖性的方式。

A431细胞增殖和apoptosis-related蛋白质的表达是由蛋白质印迹。结果如图所示3 (b)。与对照组相比,扩散蛋白质的表达水平(Ki67和PCNA) A431细胞治疗腰痛的不同浓度明显低于对照组( )。cl-caspase-3 apoptosis-related蛋白质的表达水平显著增加( ),bcl - 2的表达水平明显下降( )。此外,枸杞多糖对这些蛋白的表达的影响存在剂量依赖的相关性。

3.4。枸杞多糖对自噬的表达标记和磷酸化JNK1/2和ERK1/2培养A431细胞

同样,JNK1/2 LC3II和磷酸化状态的表达和ERK1/2 A431细胞被免疫印迹测量。结果如图所示4。与对照组相比,LC3II的表达和p-ERK1/2 / ERK1/2 A431细胞中蛋白质的枸杞多糖治疗组显著降低( ),虽然p-JNK /物蛋白的表达明显调节( )。这些规定枸杞多糖都是剂量依赖性的方式。

3.5。枸杞多糖对自噬标记和细胞凋亡蛋白的表达在培养A431细胞MAPK通路介导的

物抑制剂的影响SP600125自噬和凋亡蛋白标记的表达在A431细胞是由蛋白质印迹。如图5与对照组相比,Beclin1, LC3II和bcl - 2蛋白显著下调A431细胞治疗后50μg / ml枸杞多糖( )和cl-caspase-3蛋白质的表达调节( )。当A431细胞被cotreated枸杞多糖(50μg / ml)和SP600125 (10μ米),相比之下,枸杞多糖(50μg / ml),这些蛋白的表达是相对地监管( )。

3.6。枸杞多糖对小鼠移植肿瘤的生存和肿瘤生长

移植瘤小鼠的存活率,肿瘤的体积和重量两组数据所示6(一)- - - - - -6 (c)。移植瘤小鼠的存活率枸杞多糖治疗组明显高于对照组( ),和肿瘤体积和重量明显低于对照组( )。同时,肿瘤组织的免疫组织化学表现裸体小鼠证明Ki67的表达水平和MMP-2 LBP-treated组明显低于对照组(见图所示6 (d))( )。

4所示。讨论

人类皮肤鳞状细胞癌的发生和发展是一个极其复杂的过程,它是由多种基因和各种因素和控制与异常增殖,分化,细胞凋亡的肿瘤细胞。先前的研究已经表明,枸杞多糖的主要有效成分枸杞,表明在抗肿瘤研究一些功效,它可以抑制多种肿瘤细胞的生长,具有毒性低,副作用少,和可用性(6- - - - - -10]。近年来,自噬是新兴作为癌症预防和治疗的新策略和已被证明是密切相关的肿瘤细胞生长和增殖,以及恶性转移(13]。此外,研究表明,枸杞多糖可以防止细胞损伤通过调节自噬和凋亡14- - - - - -19]。这项研究旨在调查监管枸杞多糖对自噬的影响,及其对扩散的影响,细胞凋亡的鳞状细胞癌体外和体内,和tumor-xenografted裸体小鼠的存活率。

癌症的发生常与肿瘤细胞的异常增殖和凋亡抵抗。因此,在这项研究中,人体皮肤皮肤鳞状细胞癌A431细胞体外培养和处理枸杞多糖浓度为0,5、10、20、50、100、200、400年、800年和1000年μ克/毫升。A431细胞的存活率是由CCK8方法。结果表明,A431细胞的存活率在文化是显著降低枸杞多糖浓度达到400μ克/毫升以上。研究表明,肿瘤细胞的增殖活动是一个重要的肿瘤诊断预后指标。Ki67是一个广泛使用的增殖标记,和PCNA增殖特异性表达的蛋白,这也是一个重要的参与者在DNA复制和修复过程中(20.]。Caspase-3蛋白质降解的主要执行蛋白质在细胞凋亡;细胞异常刺激时,细胞色素酶C procaspase-9一起形成一个apoptosome激活caspase-9,进一步激活caspase-3形成cl-caspase-3(裂解caspase-3),从而引发细胞凋亡(21),而bcl - 2是一个类的抗凋亡蛋白起着关键的作用在促进细胞存活(22]。因此,增殖和凋亡的关键蛋白质的表达水平是衡量蛋白质印迹。发现枸杞多糖治疗诱导cl-caspase-3 A431细胞蛋白表达在50浓度范围内的剂量依赖性的方式μ200克/毫升~μ克/毫升。同时,抑制Ki67、PCNA和bcl - 2表达是在同一时间观察。上述结果表明,枸杞多糖能在体外诱导A431细胞的凋亡。

已经证明,LC3蛋白质是自噬标记,包括LC3I(可溶性、胞质蛋白)和LC3II(脂溶性、膜蛋白),LC3I变换LC3II和定位在自噬激活autophagosomal膜;因此,LC3II表达式可以反映自噬的水平(13]。免疫印迹表明,枸杞多糖调节物磷酸化和表达下调ERK1/2磷酸化和LC3II A431细胞蛋白表达在体外的浓度范围50μ200克/毫升~μ克/毫升剂量依赖性的方式。研究表明,自噬与凋亡不同,自噬是细胞内环境的平衡和扮演着一个重要的角色在细胞的生存。此外,该信号通路参与细胞凋亡和自噬实际上构成一个相互联系的网络,包括Beclin1和bcl - 2 (23]。物密切相关,自噬通过阻止蛋白质的磷酸化bcl - 2家族Beclin1绑定,从而调节自噬的水平,同时激活物的途径通常是由MAPK级联(24]。这项研究还发现,Beclin1的表达水平,LC3II,⊙用途制造和bcl - 2在A431细胞调节细胞被处理物抑制剂SP600125和枸杞多糖,而cl-caspase-3 apoptosis-executing蛋白质的表达下调。综上所述,上述结果表明,抑制A431自噬的枸杞多糖是通过物通路。

最后,我们建立了一个A431细胞异种移植裸鼠模型为进一步研究枸杞多糖对肿瘤移植的存活率的影响模型,体内肿瘤的生长,增殖,以及迁移蛋白表达。结果表明,枸杞多糖显著降低肿瘤组织肿瘤体积和重量,显著增加肿瘤裸体小鼠的存活率,并显著下调Ki67的表达和MMP-2,从而实现A431细胞的体内抑制。结合这些结果,枸杞多糖可以抑制自噬,诱导细胞凋亡,并抑制细胞增殖在体外和体内,和它的机制可能与upregulation物的差别,对这些ERK1/2磷酸化。

总之,400年枸杞多糖的浓度μ克/毫升以上产生显著A431细胞培养中细胞毒性的体外。当浓度范围内的50μ200克/毫升~μg / ml,枸杞多糖剂量依赖性调节增殖,凋亡,autophagy-related蛋白表达以及调节物,表达下调ERK1/2信号通路。此外,枸杞多糖的调节自噬和apoptosis-related蛋白质被物抑制剂SP600125相对地监管。和枸杞多糖可以抑制A431细胞在体内的生长和转移能力。本文首先探讨了枸杞多糖对人类皮肤鳞状细胞癌的增殖和凋亡A431通过抑制自噬;然而,仍有许多地区在未来,探索枸杞多糖的影响等其他人类皮肤鳞状细胞癌的自体吞噬细胞系和其他凋亡信号通路。

数据可用性

本研究中所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81371782)。

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