文摘

壳聚糖(CS),第二个最丰富的多糖在自然界中,广泛开发作为纳米药物输送载体由于其有趣的特征。在这项工作中,带正电的基于cs nanogel设计并合成抑制乳腺癌细胞株的增殖。的模型药物10-hydroxycamptothecin(羟基喜树碱)是压铸的核心通过简单扩散形成CS /羟基喜树碱。CS /羟基喜树碱的特点进行评估,评估粒子大小、药物加载内容,和药物装载效率。此外,细胞内化、细胞毒性和细胞凋亡的CS /羟基喜树碱也被调查在体外。目前的调查表明,带正电的基于cs nanogel可能会作为一个有前途的药物输送系统。

1。介绍

乳腺癌是众所周知的在全球女性最常见的恶性疾病和死亡的第二大原因我们女性(1]。乳腺癌的主要亚型识别基于激素受体的表达(人力资源),即雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR),和人类表皮生长因子受体2 (HER2) [2]。HR-positive乳腺癌是最常见的一种亚型,占大约70 - 75%的情况下(3]。HR-positive乳腺癌的预后优于HR-negative乳腺癌[4]。乳腺癌是成为一个相当大的公共卫生问题,因为它的高发病率和死亡率。有很多可用的治疗乳腺癌的方法,包括手术、放疗、化疗和激素治疗(5]。这是证明,手术是一种有效的治疗原发性乳腺癌。然而,癌细胞可能在体内扩散到其他器官的主要病变是发现并切除前(6]。化疗,作为手术的补充,已成为标准治疗局部晚期或不良预后的早期疾病。此外,新辅助化疗日益管理减少原发性肿瘤的大小(7]。尽管化疗在临床应用中发挥着重要作用,它仍然是阻碍了一些不利的因素,如快速消除系统性、低水溶性,严重的系统性毒性(8]。

为了克服这些缺点,纳米技术已经发展在过去的几十年里,为提高化疗的治疗效果提供了有前途的观点(9]。壳聚糖(CS),一个来自甲壳素的生物聚合物,称为第二个最丰富的多糖在自然界中(10]。CS被广泛开发作为纳米药物输送载体由于其有趣的特性,如生物相容性、生物降解性、抗菌、无毒性,和低成本11- - - - - -13]。除了这些优点外,基本氨基酸(NH的存在₂CS)和羟基(OH)组织链促进其表面化学反应工程(14]。

基于这些考虑,一个带正电的基于cs nanogel设计并合成作为药物输送系统抑制乳腺癌细胞株的增殖。的模型药物10-hydroxycamptothecin(羟基喜树碱)是喜树碱的衍生物(CPT) [15]。羟基喜树碱是一种拓扑异构酶抑制剂,可有效抑制乳腺癌细胞中的DNA复制和RNA转录(16,17]。羟基喜树碱被裹入到CS通过简单扩散形成CS /羟基喜树碱。CS /羟基喜树碱的特点进行评估,评估粒子大小、药物加载内容,和药物装载效率。此外,细胞内化、细胞毒性和细胞凋亡的CS /羟基喜树碱也被调查在体外。

2。实验

2.1。材料

10-Hydroxycamptothecin(羟基喜树碱)是由北京华丰联合科技有限公司(中国,北京)。壳聚糖(CS)是来自浙江金壳制药有限公司(浙江,中国)和作为收到。明确组织culture-treated 96孔聚苯乙烯和6-well板块从康宁合演有限公司购买(美国Cambridge, MA)。培养基胎牛血清的边后卫和杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)由Gibco(美国纽约大岛)。胰蛋白酶、青霉素、链霉素和甲基噻唑基四唑(MTT)从Sigma-Aldrich购买(上海,中国)。Propidium碘(π)和膜联蛋白V-FITC购自北京Dingguo昌盛生物科技有限公司(中国,北京)。醋酸是购自国药控股化学试剂有限公司(上海,中国)。二甲基甲酰胺(DMF)是来自Sigma-Aldrich(中国上海)和氢化钙(CaH干₂真空蒸馏前)在室温下。纯化的去离子水制备Milli-Q +系统(微孔有限Billerica,妈,美国)。

2.2。准备HCPT-Loaded Nanogel

CS /羟基喜树碱制备通过简单扩散和透析方法如前所述18]。简而言之,CS(50.0毫克)溶解在20.0毫升的醋酸溶液pH值(3.0),和羟基喜树碱(25.0毫克)溶解在20.0毫升的DMF涡和声波降解法。然后,20.0毫升的羟基喜树碱溶液被慢慢下降到CS溶液,搅拌。然后混合解决方案是在室温下搅拌30 rpm 12 h,然后对去离子水透析24小时。透析媒介刷新5次完全消除自由羟基喜树碱和DMF。整个过程是在黑暗中进行。最后,解决方案是过滤和冻干法获得CS /羟基喜树碱紧随其后。

2.3。测定药物加载内容和药物装载效率

药物装载内容(DLC)和药物装载效率(DLE)计算如我们之前所述处理轻微的修改(19]。简而言之,冻干CS /羟基喜树碱准确称重和溶解在乙酸溶液pH值(3.0)。在CS /羟基喜树碱,然后化验了羟基喜树碱含量的紫外-可见(紫外分光光度法在365海里。标准曲线法。的DLC和DLE CS /羟基喜树碱计算根据方程(1)和(2),分别。

2.4。粒子大小和电动电势测量

水力半径( )CS /羟基喜树碱测量了动态光散射(DLS)测量WyattQELS仪器垂直偏振他−Ne激光器(黎明EOS,怀亚特科技有限公司,圣芭芭拉分校,美国)。散射角为90°。样本准备在水溶液的浓度为100.0μ克毫升⁻¹。在测量之前,解决方案是通过0.45过滤μ微孔过滤器。CS /羟基喜树碱的电动电势是由一个电动电势/ bi - 90 +粒度分析仪(美国布鲁克海文国家实验室)。样本调整浓度为100.0μ克毫升⁻¹在水溶液中推荐。颗粒大小和电动电势测量进行了一式三份,和结果的意思 偏差(SD)。

2.5。细胞吸收和细胞内药物释放

细胞吸收和胞内羟基喜树碱CS /羟基喜树碱的释放行为4 t1细胞检测到共焦激光扫描显微镜(样品形貌)。简单,4 t1细胞的密度被停职 细胞毫升¹,2.0毫升到6-well板和孵化37°C的5% (/)二氧化碳(有限公司₂)的气氛。孵化24 h后,培养基是取代自由羟基喜树碱或CS /羟基喜树碱在一定的羟基喜树碱浓度为1.25μ克毫升¹。未经处理的细胞孵化与磷酸盐(PBS)作为控制。这些细胞被孵化2 h、6 h,然后用PBS冲洗了三遍。获得的细胞被固定为4%多聚甲醛在室温下15分钟。这些细胞被洗多次与PBS。细胞的吸收和细胞内药物释放行为CS /羟基喜树碱被样品形貌观察。

2.6。在体外细胞毒性试验

在体外CS /羟基喜树碱的细胞毒性,包括自由羟基喜树碱,是由一个标准评估4 t1细胞MTT试验。简单地说, 可行的细胞分散在200.0μL DMEM培养基被播种在一夜之间96 -孔板和孵化37°C。之后,准备自由羟基喜树碱和CS /羟基喜树碱溶液中添加细胞和培养48 h或72 h。羟基喜树碱的浓度范围从0到20.0μ克毫升¹。在预定的时间间隔,20.0μL (MTT的解决方案是添加到每个井和96孔板在37°C孵化大约4 h。肝癌和获得产品测量Bio-Rad 680标仪(美国Bio-Rad实验室、大力神、CA)在490 nm的吸光度。所有实验样品进行了三遍。细胞生存能力(%)计算如下:

在方程(3),和代表样品的吸光度和控制,分别。

2.7。细胞凋亡分析

4 t1细胞诱导的细胞凋亡比例CS /羟基喜树碱被流式细胞术(FCM)检测分析。4 t1细胞孵化6-well板的密度 细胞每24小时。孵化中被替换为2.0毫升的完整包含不同羟基喜树碱的DMEM配方羟基喜树碱浓度为0.1μ克毫升¹。未经处理的细胞被用作控制。额外的细胞被孵化24小时在37°C,然后收获通过胰蛋白酶化,洗,resuspended 0.5毫升1 x膜联蛋白V绑定缓冲。在分析之前,样本沾染了5.0μL的膜联蛋白V-FITC和propidium碘(π)在黑暗中15分钟。最后,使用FCM分析了细胞。

3所示。结果与讨论

3.1。准备和CS /羟基喜树碱的性格特征

羟基喜树碱的疏水性抗癌药物是通过简单扩散封装到CS(计划1)。静电相互作用是药物封装的主要原因20.]。制备方法简单明了。的DLC和DLE CS /羟基喜树碱在高水平的31.7和92.8 wt。分别为%(表1)。由此产生的CS /羟基喜树碱的平均直径展出 ,是由DLS发现(图1)。的CS /羟基喜树碱是不到200海里,显示最大增强渗透性和保留(EPR)的效果,这是重要的肿瘤靶向纳米药物的生物医学应用程序内(21,22]。此外,CS /羟基喜树碱与电动电势的积极的表面电荷 (表1)。电动电势是重要的评价的稳定和分散纳米粒子(23]。此外,带正电的粒子有一个伟大的细胞膜渗透的效率和内化24]。显然,CS /羟基喜树碱药物传输是一个很好的平台。

3.2。细胞吸收和细胞内药物释放

细胞吸收和胞内羟基喜树碱CS /羟基喜树碱的释放行为4 t1细胞监测样品形貌。如图2(一个)治疗2 h后,羟基喜树碱荧光信号在细胞治疗与自由羟基喜树碱或CS /羟基喜树碱。羟基喜树碱荧光有点强的细胞孵化与自由羟基喜树碱比细胞与CS /羟基喜树碱。然而,6 h(孵化后,CS / HCPT-treated细胞表现出更高的羟基喜树碱的荧光强度比自由羟基喜树碱治疗组(图2 (b))。结果表明,CS /羟基喜树碱可以优先内化通过内吞作用通路,温带效率在一开始,然后显示增强的荧光信号有效的药物释放后(25]。相反,自由羟基喜树碱运送到细胞通过被动扩散26,27]。也报道说,纳米颗粒的内吞作用往往比被动扩散更有效的药物分子28]。类似的结果在我们的以前的工作(已报告29日]。在工作中,带正电的多肽合成nanogel主要提高mucoadhesiveness的羟基喜树碱膀胱内的膀胱癌的化疗。在这部作品中,带正电的nanogel是基于CS,这是第二个最丰富的多糖在自然界中具有良好的生物相容性和生物降解性。的结果图2表明CS能增加吸收和羟基喜树碱4 t1细胞的内吞作用。

3.3。在体外CS /羟基喜树碱的细胞毒性研究

4 t1是一位代表在乳腺癌细胞系,及其在BALB / c小鼠生长和转移非常相似的人类乳腺癌。4的动力学t1-induced肿瘤术后和非手术条件相似,可作为术后非手术模型(30.]。探讨增强治疗效果的CS /羟基喜树碱对4 t1细胞,MTT测定标准应用。如图3(一个)48 h后,暴露在CS /羟基喜树碱或自由羟基喜树碱、4 t1细胞的代谢活动降低浓度的方式。CS /羟基喜树碱显示细胞毒性明显高于自由羟基喜树碱在任何给定的当量浓度,表明药物交付平台确实可以增强羟基喜树碱的抗癌效率。增强细胞毒性的CS /羟基喜树碱可能是由于是非细胞内化通过内吞作用、吞噬作用或胞饮积累后表面的细胞,而自由羟基喜树碱是通过被动扩散运输(31日,32]。培养时间时类似的结果扩展到72 h(图3 (b))。此外,一半最大抑制浓度(IC₅₀CS /羟基喜树碱值为8.7μ克毫升⁻¹和4.4μ克毫升⁻¹分别为48 h和72 h。相反,IC₅₀自由羟基喜树碱值为10.3μ克毫升⁻¹和7.5μ克毫升⁻¹分别为48 h和72 h。结果表明,扩散率与时间有关。

3.4。细胞凋亡分析

4 t1细胞诱导的凋亡活动CS /羟基喜树碱被FCM分析评估。这些细胞被孵化与自由羟基喜树碱或CS /羟基喜树碱在一定的羟基喜树碱浓度为0.1μ克毫升¹24 h,然后双标记的可行性和细胞凋亡。如图4CS /羟基喜树碱明显减少正常细胞的比例,显著增加的百分比坏死/晚期凋亡细胞。结果归因于CS /羟基喜树碱的正电荷,CS /羟基喜树碱的吸收增加了4 t1细胞,进一步诱导增强细胞凋亡。

4所示。结论

总之,一个阳离子基于cs nanogel成功合成抑制乳腺癌细胞的增殖。羟基喜树碱的疏水性抗癌药物是压铸的核心通过简单扩散。由此产生的CS /羟基喜树碱的平均直径展出 。积极的表面电荷CS /羟基喜树碱促进细胞内药物内化通过内吞作用途径。细胞毒性试验表明CS /羟基喜树碱和优良的生物相容性也被证明是更好的细胞毒性与自由羟基喜树碱。目前的调查表明,带正电的基于cs nanogel可能会作为一个有前途的药物输送系统。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究是在经济上支持的吉林省科技发展计划(没有。20180101167 jc)。