文摘

一种新型两亲的壳聚糖衍生物,O-acetyl-chitosan乙酸酯(据),与乙酸反应,合成了壳聚糖在亚硫酰氯的存在。据的物理化学性质的特征红外光谱,1H NMR、TGA、XRD。收益率( )据是79.4%,乙酰化的程度( )据是1.04。与c相比,据可以溶于许多有机溶剂,去离子水和水溶液。我们的研究结果显示,据表现出优越的抗菌活性大肠杆菌,铜绿假单胞菌,金黄色葡萄球菌。这些发现表明,据更为可取用作抗菌药物在伤口愈合,食品防腐剂和组织工程。

1。介绍

如今,抗菌药物源自天然物质吸引了巨大的关注,由于其优良的抗菌效率和良好的生物相容性1]。除了自身的结构特性,天然抗菌药物的稳定性和耐用性是主要因素限制他们的广泛应用2,3]。壳聚糖(CS),第二个最丰富的天然生物聚合物,是来源于甲壳纲动物的甲壳素或蘑菇壳。作为天然抗菌剂,代表CS已广泛应用于包装领域,医学应用,制药学,生物医学,生物技术,纺织4,5]。CS具有广泛的活动(6- - - - - -8)和一个高谋杀率对各种细菌、丝状真菌、酵母(9- - - - - -11),这使得它作为一个理想的预处理材料应用于纺织印染、纺织印刷、纺织加工、羊毛染色,和收缩防12- - - - - -15]。然而,它的线性、刚性和半晶质结构使CS不溶于水溶液pH ~ 6.5以上(pK一个~ 6.3)和有机溶剂。CS溶解度差被认为是主要的障碍限制了其潜在的应用。因此,如何提高计算机科学的溶解度,同时保留其抗菌活性仍然是需要解决的关键问题(16]。

迄今为止,化学修改旨在提高CS的溶解度,carboxymethylation和quaternisation等,通常妥协抗菌活性和/或CS的安全。例如,羧甲基化壳聚糖得到一个更好的水溶性,而其抗菌活性降低。Quaternisation修改增加溶解度和CS的抗菌活性;然而,它还介绍了改性壳聚糖潜在的细胞毒性。因此,为了提高水溶性,同时抗菌活性和生物相容性的关键问题是找出chitosan-based天然抗菌材料(17]。酰化的CS被发现能够有效改善抗菌材料的性能。为了获得壳聚糖衍生物,研究人员通过其羟基化学功能化CS。例如,通过羟基的酯化c在其他位置已经被研究和酯化c展出一些优越的生物属性,如无毒性、良好的溶解性和生物相容性。直到现在,有两种主要的方法来合成壳聚糖酯。方法之一是合成壳聚糖酯与一个强大的酸和CS作为催化剂在高温下脱水剂。另一个是首先保护氨基,因为它比其他组无功。然后,酯化后amino-protecting组中删除。这两种方法都有优点和缺点。前一个是容易,但取代度通常是很低的。 The latter one is more complex and difficult. Therefore, the esterification that can be conducted at room temperature with simplified experimental steps is still in urgent demand.

在这项研究中,一种新型壳聚糖衍生物,O-acetyl-chitosan乙酸酯(据),直接通过CS与乙酸的酯化反应在室温下二氯化硫的存在。这个简单的方法需要温和的反应条件和反应时间。据的化学结构和物理性质的特征红外光谱,热重分析,1H NMR和XRD技术。我们仔细研究过它的水溶性,1%乙酸水溶液,有机溶剂在25±0.5°C以及其抗菌活性大肠杆菌(大肠杆菌),金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌),铜绿假单胞菌(铜绿假单胞菌)。

2。实验

2.1。材料

CS(食品级)从慧朴购买生物技术有限公司(西安,中国)和用作收到没有进一步净化。分子量( )CS 400 kDa,脱乙酰作用的程度( )为90.5% (18]。醋酸、亚硫酰氯和所有其他试剂(AR)用于研究从Haihui购买化学试剂公司(青岛)分析试剂级。金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,铜绿假单胞菌用于抗菌活性试验由海洋生命科学学院微生物实验室。

2.2。据的合成

据准备CS与乙酸反应的亚硫酰氯的存在。短暂,7 g CS(40更易计算为氨基葡萄糖单位)是用35毫升的纯乙酸和彻底混合用在室温下(53 kHz, 260 W) 30分钟。然后,8.85毫升的亚硫酰氯在慢慢添加到上述混合物搅拌下滴液漏斗25°C 90分钟,其次是在酒精沉淀。反应混合物过滤,溶解在蒸馏水中,透析,集中,和讨论。最后,获得了预期的据和存储在一个真空干燥室温为进一步使用。

收益率( )重量分析地决定了应用下列方程(19]。 在哪里 (g)是样品重量, (g)是理论重量, (g)反应产物的重量。166是壳聚糖的分子量单体,和250的分子量是完整的壳聚糖的酰化反应单体。

2.3。特征
2.3.1。红外光谱和1H核磁共振光谱学

傅里叶变换红外光谱(FTIR)被用来检查的峰值变化前后的羟基和胺组反应(美国的那些时光仪器有限公司nexus - 870, Nicolet)。2毫克的示例完全地面和KBr和110毫克。所有光谱扫描一张空白KBr颗粒背景在4000 - 400厘米的范围−1与2.0厘米−1决议。红外光谱归一化,主要振动乐队被分配给主要的化学组。

的1H NMR光谱得到一个清晰的磁共振波谱仪(AV400、力量、德国)。CS是溶解在混合溶剂DCl和D2O,据溶解在D2o .乙酰化作用的程度( )据是计算从核磁共振光谱峰地区不可或缺的方法。

2.3.2。热重分析(TGA)

TGA的样品的特点是Rubotherm DynTHERM热重分析仪(Rubotherm Corp .)、德国)。样本从50到500°C以恒定加热升温速率下10°C /分钟N2保护(20毫升/分钟)的分析。

2.3.3。x射线衍射(XRD)

XRD模式样本,记录在D-8推进衍射仪(力量中心——AXS,德国)与铜Kα辐射( 海里)、操作40 kV和40 mA。2的衍射数据收集θ值5°60°,扫描率4°/分钟。

2.4。溶解性测试

样品的溶解度是评估通过应用Ma方法et al。20.]。粉末状样品(100毫克)准确称重在密封管(内直径16毫米和160毫米长)和0.1毫升的某些溶剂混合,紧随其后的是待遇高强度超声(53 kHz, 260 W) 3 h 25±0.5°C到负担得起一个完全溶解清晰的解决方案。解决方案的透明度被紫外可见光谱观测。溶解度是表达量(mg)测试样品的溶解在1毫升的溶剂。

蒸馏水溶解率和1%醋酸水溶液进行了研究,以开发一个全面的了解样品。解散CS和据(500毫克)检测,分别溶解在蒸馏水和1%的材料(w/v,50毫升)醋酸溶液,室温下搅拌。混合搅拌,直到一个稳定,形成明确的解决方案。溶解性测试进行了一式三份,使用统计方法和结果处理。

2.5。抗菌测试

抗菌活性研究使用大肠杆菌,铜绿假单胞菌(G−),金黄色葡萄球菌(G +)作为测试微生物。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是大自然的代表菌株用于抗菌感受性测试,在吗铜绿假单胞菌是一种常见的细菌可能会导致伤口感染。代表微生物菌落接种针被选掉,放置在25毫升无菌营养肉汤,然后孵化瓶100 rpm的速度在37°C 24 h。细菌悬液是然后用无菌生理盐水稀释至103-10年4CFU /毫升和用于抗菌测试(21,22]。

CS和据的抑制率大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌确定通过使用琼脂板(1]。CS的主要解决方案,据被溶解的材料准备的1% (w/v分别)醋酸水溶液。混合搅拌,直到一个稳定,形成明确的解决方案。处理过滤器文件都沉浸在上面的解决方案是在琼脂板覆盖着细菌,和所有的盘子都孵化24小时37°C。CS,据与不同浓度和醋酸的解决方案是由重复的双重的连续稀释,然后由0.22消毒μm过滤器。准备营养琼脂板的方法描述如下:营养琼脂准备的均匀混合物,由高压灭菌消毒121°C 25分钟。消毒溶液(约25毫升)注入无菌培养皿形成固化营养琼脂板在一个无菌操作环境,其次是增加100μ细菌悬液,然后100 LμL与不同浓度的样品也补充道。他们两个都消毒SS-spreader分布均匀。此外,样品在对照组取而代之的是无菌水。琼脂板上的所有镀样本一式三份,和所有的盘子都孵化24小时37°C。然后,盘子被计数的殖民地。抑制率( )根据计算(2), 数据处理的统计方法。 在哪里 是殖民地的数量在盘子和无菌水吗 是殖民地的数量与测试材料和治疗后在不同浓度醋酸水溶液。

3所示。结果与讨论

3.1。特征

CS的照片和化学结构,据图所示1。不同于白色的CS,据显示淡黄色。据图所示的合成过程1。收益率( )据被计算为79.4%。


图1
照片,CS和据化学结构,合成的示意图说明O-acetyl-chitosan乙酸酯(据)。

红外光谱谱的CS,强劲的宽带在3200 - 3600厘米左右−1应该归功于伸缩振动-哦和国米,extramolecular壳聚糖分子的氢键(图2)。特征峰在1658、1597、1318、1072和1026厘米−1应该对应于酰胺我二胺和酰胺III的CS和切断伸展振动吸收带C3C -哦,6-哦,分别。与c相比,据从1597厘米的吸收带−1(酰胺二世)到1527厘米−1,证明c n - NH功能的形成。一个乐队在1623厘米的外观−1可以分配给nh的伸缩振动3+,这表明北半球2组仍保留据的支柱。据在1371厘米的特征吸收带−1应该对应于ch的伸缩振动3。此外,新的吸收峰在1741和1235厘米−1据应该归因于的红外光谱谱特征峰的饱和脂肪酸酯组(-CO-O)。特征在1072年达到顶峰,1026厘米−1变得软弱,这表明酯化反应发生在乙酸和CS -哦。这些结果表明,据已成功合成。


图2
壳聚糖(CS)和红外光谱光谱O-acetyl-chitosan乙酸酯(据)。

的1H NMR光谱CS和据图所示3。为1CS的H NMR谱峰值为1.93 ppm可以分配给三个质子N乙酰氨基葡萄糖和峰值为3.18 ppm应该对应于氨基葡萄糖残基的质子(2)。山峰从3.25到4.00 ppm应该归因于nonanomeric质子(H-3, 4、5、6),而一个小峰在4.66 ppm代表异头质子(h)的葡萄糖胺残留N乙酰葡萄糖胺,分别。与c相比,1H NMR谱的据有很大差别。在1据H NMR谱,山峰从3.25到4.00 ppm减少和信号在1.93 ppm成为更强大的存在更乙酰基氢。结果表明,据铵集团是由乙酰基,另一个框架。这与红外光谱分析结果是一致的。


图3
的1H NMR谱的壳聚糖(CS)和O-acetyl-chitosan乙酸酯(据)。

据的乙酰化程度(DA)被定义为乙酰基的数目与每糖渣CS -哦。这是计算积分峰面积的方法1H NMR谱据根据以下方程。 在哪里 CS是异头质子的积分( ppm), 乙酰基氢的积分( ppm), 是CS的脱乙酰作用程度(90.5%)。计算的结果 据为1.04。

计算机科学的热稳定性,据TGA研究了(图4(一))。CS和据有两个阶段的体重,和小体重在100°C应该对应的挥发性产品和自由水。进一步的热降解不仅导致脱水和分裂的糖环也导致解聚和侧链的分解。CS,第一阶段大约在100°C表现出0.97%的体重,最大重量损失58.88%开始大约在172°C(图4(一))。CS展出高速271.92和330°C之间的分解,达到最大值307.49°C的峰宽37.95°C(图4(一))。据也显示两个阶段的减肥,如图4(一)。第一阶段始于大约100°C显示约2.93%的减肥。第二阶段开始在150°C显示约66.47%的减肥。分解的高速度之间存在198.91和230°C,达到最大值211.06°C的峰宽24.57°C。上述结果表明,CS比据更好的热稳定性。在图4 (b),第二阶段分解的CS和据表现出一些差异。据有较低的分解速度与CS。这种现象应该归因于酯的分解温度降低和离子键据在CS中羟基和氨基基团。据的最大温度和峰宽变得窄应归因于不同的分子结构,介绍了新团体的领导在CS氢键的断裂。此外,据估计,增加侧链的数量可能会降低分解温度(20.,23]。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
(一)TGA和(b)壳体热分析图的壳聚糖(CS)和O-acetyl-chitosan乙酸酯(据)。

利用x射线衍射研究CS的结晶特性和据。如图5CS的衍射图由两个主要的结晶峰位于约10.8°和20.2°。与c相比,据表现出一些变化的XRD衍射角,峰值强度和峰宽。据,峰值为10.8°和20.2°消失了,一个新的峰值为24.7°观察增加强度和宽度。众所周知,峰值强度和宽度在XRD模式与微晶尺寸(24]。较弱的和更广泛的峰值暗示有更多的无定形相据矩阵和据的结晶度低于CS。这些结果可能归因于分子间相互作用的共同影响,对称和立构规整性。值得注意的是,引入的新团体应该链接到CS骨干和氨基通过共价结合和离子键,分别。除此之外,新引入团体可能导致对称性的变化和CS的立构规整性。因此,不同结晶度将不可避免地产生不同的属性。


图5
XRD的壳聚糖(CS)和O-acetyl-chitosan乙酸酯(据)。
3.2。溶解性测试

评估样品的稳定性和溶解性,CS和据分别在不同的溶剂溶解,。如表所示1,结果表明,CS不溶于普通溶剂除1% (w/v)醋酸水溶液。CS溶解在乙酸水溶液时,溶解时间超过半小时(图6)。另一方面,据表现出良好的溶解在去离子水(240±5.33毫克/毫升),1% (w/v)醋酸水溶液(220±3.19毫克/毫升)(表1)和0.9% (w/v)生理盐水(227±4.23毫克/毫升)。此外,据也可以溶解在有机溶剂乙二醇和异丙醇等。据展出略高溶解在去离子水中比在其他媒体,可能是因为离子强度的增加导致了据的溶解度下降。乙酰基的引入到CS分子骨架有效地削弱了强大的内部,在酯化壳聚糖分子间氢键相互作用。结晶度的变化和相互作用的水溶性壳聚糖导致其相应的衍生品。此外,通过3 c,嫁接上疏水乙酰基6 - - - - - -哦,亲水集团影响壳聚糖的水溶性两性分子的。据时溶解在蒸馏水(图6(一))和1%醋酸水溶液(图6 (b)),解散时间只有6分钟。总之,溶解率之间有巨大差异CS和据解决方案在蒸馏水和1%醋酸水溶液。

表1
溶解性的壳聚糖(CS)和O-acetyl-chitosan乙酸酯(据)在不同溶剂25±0.5°C。一个
(一)
(一)
(b)
(b)
图6
壳聚糖(CS)的溶解率和O-acetyl-chitosan乙酸酯(据)蒸馏水(a)和1%醋酸水溶液(b)。
3.3。抗菌检测

CS的抗菌能力,据票反对大肠杆菌和铜绿假单胞菌(革兰氏阴性菌)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性细菌)评估在不同浓度24 h(图7和表2- - - - - -4)。当CS的浓度和据都是1%,抑菌圈试验表明,据有更明显的抑制效果比CS大肠杆菌,铜绿假单胞菌,金黄色葡萄球菌。据的抗菌率大肠杆菌和铜绿假单胞菌都超过90%,而CS的抑制率分别为83%和88%,表明据有满意的抗菌活性与CS。到目前为止,CS的具体抗菌机理(25,26)及其衍生物还尚不清楚。最可接受的机制是由之间的静电力使质子化氨基组(nh3+CS)和电负性指控在微生物细胞表面和内部的微生物细胞。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图7
壳聚糖(CS)的抑制区和O-acetyl-chitosan乙酸酯(据)在1%醋酸水溶液。(一)铜绿假单胞菌;(b)大肠杆菌;(c)金黄色葡萄球菌。(1)滤纸浸在1% (w/v)醋酸水溶液。(2)滤纸浸在1% (w/v)据水溶液(从溶解1 g据100毫升1%醋酸水溶液)。(3)滤纸浸在1% (w/v)CS溶液(从溶解1 g CS 100毫升1%醋酸水溶液)。
表2
壳聚糖(CS)和抑制O-acetyl-chitosan乙酸酯(据)大肠杆菌。一个
表3
壳聚糖(CS)和抑制O-acetyl-chitosan乙酸酯(据)金黄色葡萄球菌。一个
表4
壳聚糖(CS)和抑制O-acetyl-chitosan乙酸酯(据)铜绿假单胞菌。一个

这种静电相互作用可能有以下两个因素的影响:(i)促进变化的外部影响微生物细胞膜的渗透性质水解肽聚糖的微生物细胞被膜,导致蛋白质的泄漏和其他细胞内成分和CS(2)内部影响渗透进入细胞,结合微生物DNA或带负电荷的细胞质,导致不同的生理紊乱(27]。据施加较高的抗菌活性比CS这可能是由于大量的引入乙酰基的疏水基向壳聚糖骨架与amphiphilicity赋予据。同时,引入乙酰基到CS分子骨架导致有效削弱国际米兰,extramolecular CS分子的氢键。此外,酯键的形成允许据拥有较高的疏水性导致更容易比壳聚糖与细菌细胞的交互。因此,据可以更容易进入微生物和损害的结构和功能微生物通过破坏细胞壁,抑制DNA转录。太阳et al。24),Sajomsang et al。28杨,et al。29日]表明,疏水CS的特点是容易CS和细菌细胞之间的交互。据高疏水性,更容易比CS与细菌细胞。这可以解释为什么据的抗菌活性高于父CS。此外,CS和据比对抗更积极的对革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌。这个结果类似于Sajomsang et al。30.]。当CS和据都是0.25%的浓度,抑制率金黄色葡萄球菌分别为97%和93.4;与此同时,对相应的抑制率大肠杆菌62.1和69.3%,那些反对铜绿假单胞菌分别为73.3%和63.1。这可能是由于不同的细菌细胞壁结构。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖的多孔网络交联相对宽松,使CS和据容易进入细胞。然而,革兰氏阴性细菌的细胞壁的结构非常复杂,有一个外膜构成的脂多糖、脂蛋白、磷脂除了一层肽聚糖层。外膜可以调节和控制外部元素的入口,形成势垒对外国与高分子量分子。因此,CS和它的导数对两种细菌有不同的影响。

4所示。结论

O-Acetyl-chitosan乙酸酯(据),两亲性壳聚糖衍生物,合成了利用壳聚糖(CS)和醋酸的催化下,二氯化硫,收益率为79.4%。红外光谱和1H NMR光谱证实乙酰基被选择性地附在壳聚糖的氨基和羟基。据的DA 1.04计算。TGA和壳体的研究显示,据和CS有类似的热稳定性,而据的分解速度低于CS。XRD研究暗示酰化反应可能导致晶体结构的破坏CS,因为有更多的无定形相据矩阵比CS。据表现出更好的溶解度比CS在蒸馏水和1% (w/v)醋酸水溶液,主要是有关amphipathicity据。此外,据不仅表现出抗菌活性高于CS大肠杆菌,铜绿假单胞菌,金黄色葡萄球菌还扩大了CS的pH值谱在不同的环境中。这些结果表明,据有潜在应用抗菌药物在伤口愈合,食品防腐剂和组织工程。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由中国自然科学基金会(没有。51503110),程序在大学长江学者和创新研究团队(IRT_14R30)和山东省的唐山市学者计划,中国。