青钱柳多糖(CPP)对甲状腺癌的体内外抗肿瘤作用

摘要

本研究探讨了青钱柳多糖在甲状腺癌(TC)细胞凋亡中的作用及机制。甲状腺癌细胞的凋亡在体外和肿瘤组织在活的有机体内采用MTT法和流式细胞仪测定。western blotting检测肿瘤组织中磷酸化蛋白激酶B (p-Akt)、Akt、B细胞淋巴瘤2 (Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)等下游分子。MTT及流式细胞术检测在体外结果表明青钱柳多糖对甲状腺癌细胞凋亡具有时间依赖性和剂量依赖性。在活的有机体内化验结果显示50 mg/kg和100 mg/kg青钱柳多糖显著抑制小鼠甲状腺癌的增殖。westernblotting显示p-Akt、Akt和Bcl-2下调，Bax上调。这些结果表明青钱柳多糖可能通过抑制p-Akt、Akt和Bcl-2的激活以及激活Bax而促进甲状腺癌细胞凋亡，这为CPP作为甲状腺癌治疗提供了新的用途。

1.介绍

植物多糖是由十多个单糖单元通过糖苷键连接而成的天然高分子，在维持生命活动中起着重要作用。20世纪40年代以来，人们对多糖的生物活性进行了广泛的研究。植物多糖具有免疫调节、抗癌、抗衰老、降血糖和降脂等生物学作用[1- - - - - -5］．最近，越来越多的研究表明多糖在预防和治疗人类危重或慢性疾病如癌症、心血管疾病和糖尿病方面具有显著优势[6- - - - - -8］．

此外，目前的甲状腺癌治疗也存在一些局限性。不同类型甲状腺癌患者对传统化疗反应较差或中等[9］．到目前为止，目前的目标是确定新的药物，以提高反应和无进展生存。研究表明，大部分植物多糖通过调节宿主细胞分泌的细胞因子水平，增强对癌细胞的免疫功能，从而起到抗癌作用[10］．另一方面，细胞毒多糖具有肿瘤细胞毒性，可与癌细胞直接相互作用[11］．然而，青钱柳多糖对甲状腺癌的作用尚不清楚。

在过去的十年中，人们在理解甲状腺癌的分子机制方面取得了进展。在甲状腺癌发生的遗传和表观遗传学事件方面最具代表性的进展是Akt，据报道它参与了几个主要途径[12］．Akt的过度激活促进多种肿瘤的细胞转化和肿瘤发生。此外，Bcl-2家族蛋白是凋亡信号的主要细胞内调节因子，存在于正常和肿瘤甲状腺组织中[13］．有报道称Bcl-2在甲状腺癌细胞中过表达增加了细胞的致癌依赖性。另一个影响肿瘤组织中凋亡平衡的分子是Bax。假定Bcl-2/Bax的比值决定细胞死亡[14］．

在本研究中，我们研究了青钱柳多糖的作用机制，并确定了其可能的抗癌特性。此外，我们还建立了小鼠模型，以揭示其抗癌作用的潜在机制在体外和在活的有机体内．

2.材料和方法

2．1．试剂

植物材料和青钱柳多糖的制备是以前获得的[15]从中国湖北省恩施市的一个种植基地采集了青钱柳的叶片。在490℃下，以D-葡萄糖为标准，采用苯酚-硫酸比色法测定糖含量 nm.磷酸化Akt1（S246）多克隆抗体购自R&D。AKT抗体购自Rockland。Bcl-2单克隆抗体、Bax多克隆抗体、GAPDH和HRP小鼠单克隆抗体购自MultiSciences。

2．2.细胞系

甲状腺癌细胞株(FRO、ARO、8505C、SW579、K1、FTC133、BCPAP)购于中国上海富恒细胞中心。细胞在rmi -1640培养基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中培养，含有10%胎牛血清(FBS)、100单位/mL青霉素(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)和0.1 mg/mL链霉素(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)。所有细胞保持在含5%湿化CO的湿化培养箱中₂在37°C下。

2.3。动物

所有动物程序都是由该机构的动物护理和使用委员会批准的，符合《实验室动物护理和使用指南》。40只雄性BALB/c裸鼠(18-20 g, 5-6周龄)，购自中国北京华福康生物科技有限公司，许可证号:SCXK-JING 2014-0004。根据实验室动物护理，所有小鼠都被安置在无菌条件下，并允许自由获得无菌食品和水。取FRO细胞后，在右前腿(5 × 10)接种肿瘤⁶细胞/老鼠)。NC组和TC组小鼠灌胃蒸馏水。肿瘤体积用卡尺定量，公式如下:肿瘤体积= 0.5 ×长×宽2。牺牲时，迅速解剖肿瘤组织并称重。

2.4.MTT法

MTT法检测CPP对七种人甲状腺癌细胞系（FRO、ARO、8505C、SW579、K1、FTC133和BCPAP细胞）的体外抑制作用 × 10⁴细胞/孔)，用0.2 mL细胞培养液，37℃，96孔板孵育。细胞粘附24 h后，在含不同浓度CPP(0、30、100)的培养基中培养μg/mL)。CPP暴露后，20μ每孔加入MTT试剂L，继续培养1 h。去除培养基后，50μ每孔加DMSO L，孵育10 min。用酶标仪在570 nm处读取吸光度值。抑制率计算公式为:生长抑制率(%)=(1-实验组吸光度/空白对照组吸光度)× 100%。

2．5．流式细胞术

采用Annexin V-FITC/PI试剂盒(千根，中国)进行流式细胞术检测细胞凋亡，并按照制造商说明进行检测。收集细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，Annexin V-FITC/PI染色。绑定缓冲(150μ五十） 和附录-V-FITC（5） μ五十） 加入每根试管中，在室温下培养15分钟 最小值。随后，绑定缓冲区（100 μL和PI (5μL)，孵育5 min。采用流式细胞仪FC500 (Beckman Coulter, USA)采集每个样品中至少10000个细胞，使用CXP分析软件2.2 (Beckman Coulter, Inc.)进行分析。

2.6。西方墨点法

手术摘取小鼠肿瘤组织后，迅速用液氮冷冻，切片至8μ我用的是切片机(德国柏林徕卡CM1900)。用冰冻的RIPA裂解缓冲液从细胞和肿瘤组织中提取总蛋白(Beyotime，中国上海)。浓度由双氰菊酯酸(BCA)测定试剂盒(Beyotime，中国，上海)计算。30μ使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，美国加利福尼亚州Bio-Rad）分离g蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脱脂乳封闭1小时后 h、 样品与抗p-Akt（1）的一级抗体一起孵育 : 1000）多克隆抗体，Akt（1 : 1000），Bcl-2（1 : 1000），Bax（1 : 1000）和GAPDH（1 : 用Tris缓冲盐水/吐温20（TBST）清洗后，用HRP结合二级抗体（1）孵育膜 : 5000）美元，1美元 用TBST洗涤三次，用增强化学发光（ESL）western blot检测系统（美国马萨诸塞州贝德福德市密理博）检测蛋白质。GAPDH被认为是相对蛋白质表达的反映。

2.7.统计分析

所有值均用均数±标准差(SD)表示。所有实验数据采用SPSS 21.0软件(IBM Corp.， USA)进行分析。组间比较采用配对法t以及。两组比较采用独立样本进行t以及。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行评估。计数资料以百分数表示，并进行卡方检验。的值 具有统计学意义。

3.结果

３．１．CPP的提取及含量测定

本研究采用水提醇沉法分离大花楸多糖。为确定多糖的纯度，进一步采用苯酚-硫酸比色法分析多糖的糖含量。多糖纯度为89.5%。

３.２．CPP对甲状腺癌细胞生长的抑制作用

评价不同水平CPP对7种人甲状腺癌细胞株的生长抑制率，以表征CPP的抗甲状腺癌作用，筛选出对CPP抑制效果最好的细胞株。采用MTT法检测细胞活力。7种甲状腺癌细胞株在30和100孵育后，细胞生长均明显受到抑制μ克/毫升CPP( ，数字1(一)）.CPP的效果μg/mL对甲状腺癌细胞生长的抑制作用强于30μ克/毫升。

当CPP浓度为30时，对未分化甲状腺癌源性FRO细胞的抑制率约为50%μg/mL，仅略低于分化甲状腺癌来源BCPAP细胞(%)。而在浓度为100时，抑菌率高达90%μg/mL，高于包括BCPAP在内的所有甲状腺癌细胞株。因此，我们选择未分化甲状腺癌来源的FRO细胞进行进一步研究。

我们进一步研究了100μg/mL CPP作用24 h、48 h和72 h。如图所示1 (b)，处理72 h的FRO细胞表现出更高的抑制作用，与48 h和24 h相比，无显著性差异。这些结果表明，CPP的抑制作用具有剂量依赖性和时间依赖性。

3．3.CPP诱导肿瘤组织凋亡的实验研究

PBS处理小鼠作为对照。如图所示2(一个)与PBS组比较，50 mg/kg、100 mg/kg处理30 d后肿瘤重量显著降低。在给药期间，小鼠肿瘤体积增加(图2 (b)）.Annexin V-FITC双染色检测小鼠肿瘤组织中肿瘤细胞凋亡情况(图)2 (c)- - - - - -2 (f)）.50 mg/kg和100 mg/kg CPP处理小鼠肿瘤细胞凋亡率分别为17.7±2.3%和21.3±2.6% ( ）.

3．4．CPP调控肿瘤组织中p-Akt、Akt、Bcl-2和Bax蛋白的表达

蛋白质(图3.)检测三组小鼠处死后p-Akt、Akt、Bcl-2和Bax的表达。50 mg/kg和100 mg/kg处理后，p-Akt/Akt蛋白表达显著提高77.6%和48.1%(图)3 (b)， ）.Bcl-2蛋白表达分别下降78.5%和69.2%(图2)3 (c)， ）.Bax蛋白表达分别为1.67倍和2.23倍(图2)3 (d)， ）.CPP对细胞凋亡有较强的促进作用，提示p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax参与了CPP诱导的细胞凋亡。

4.讨论

甲状腺癌中通常可见炎症细胞浸润，包括淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞等。虽然这些细胞在肿瘤中的作用和作用机制尚不完全清楚，但多数实验表明这些细胞促进肿瘤的发生发展。因此，炎症分子可以成为潜在的甲状腺癌治疗靶点，而免疫治疗近年来逐渐成为甲状腺癌治疗的重点。据报道，青千六多糖已被证实具有免疫调节功能，可抑制IL-6、TNF-的释放β由LPS刺激的巨噬细胞[16］．青钱柳多糖是从青钱柳中提取的一种天然植物多糖。由于其特殊的理化效应和小的副作用，已成为一种潜在的活性化合物。目前对多糖抗癌能力的研究主要集中在多糖的凋亡作用上。在人前列腺癌PC3细胞和乳腺癌MCF-7细胞中鉴定了斜叶褐藻成分的细胞毒性[17，18］．在活的有机体内和在体外然而，参与癌细胞凋亡的信号通路复杂，不同类型的肿瘤细胞凋亡的信号机制往往不同。

本研究采用水提醇沉法分离大花楸多糖。为了确定多糖的含量，我们进一步用苯酚-硫酸比色法测定糖的含量。多糖的总含量为89.5%。前期研究表明CPP对多种肿瘤细胞系均有抗增殖作用[17- - - - - -19］．我们观察到，CPP抑制了FRO、ARO、8505C、SW579、K1、FTC133和BCPAP等一对甲状腺癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡。同样，在小鼠模型中也观察到类似的趋势。CPP治疗后小鼠肿瘤重量明显减轻。

在我们之前的研究中，我们探索了CPP诱导人结肠癌细胞HT29凋亡的潜在机制。采用MTT比色法检测青钱柳多糖可显著抑制人结肠癌细胞HT29的增殖。我们之前的研究结果表明，诱导凋亡可能是其作用机制之一CPP抗肿瘤作用的主要机制。流式细胞术结果表明，该多糖可诱导人结肠癌细胞系HT29凋亡，并可观察到凋亡细胞的典型形态学特征。作为癌症治疗的主要策略，Annexin V/PI染色可确定r细胞毒性作用与凋亡过程有关。我们发现，CPP给药后，早期和晚期凋亡肿瘤细胞的百分比显著增加。所有这些数据表明，CPP诱导甲状腺肿瘤细胞凋亡。

为了解甲状腺癌细胞毒性的可能分子机制，我们对相关机制进行了探讨。PI3K/AKT通路是人类癌症中研究最频繁的突变网络[20.］．这种蛋白的过度激活与肿瘤生长、侵袭和耐药性有关。我们的结果证实了CPP显著下调了p-Akt和Akt蛋白水平。考虑到p-Akt是Akt的活性形式，我们的数据表明，CPP直接或间接地抑制了Akt的活性形式。

一般来说，细胞的生存和死亡受Bcl-2家族蛋白以及Bcl-2和Bax之间的平衡调节。Bcl-2和Bax的异常表达有助于肿瘤的生存和生长。此外，Bcl-2和Bax以独立的方式调节细胞凋亡过程[21］．线粒体膜相关的Bcl-2调节一些凋亡因子的表达，这些凋亡因子通常隔离在线粒体膜间隙。Bax在修复细胞凋亡敏感性方面起着至关重要的作用[22]如果Bcl-2不能发挥抗凋亡作用，Bax将在线粒体外膜形成一条促进凋亡的通道[23］．在这里，我们发现CPP显著降低Bcl-2蛋白水平和升高Bax蛋白水平。

综上所述，CPP对甲状腺肿瘤的生长有显著的抑制作用在体外和在活的有机体内，使其在研究中具有重要意义。CPP通过p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax等途径对甲状腺癌细胞产生抗癌作用。我们的数据提示了一种潜在的治疗甲状腺癌的策略。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

伦理批准

本研究获得了上海邮电医院(中国上海)伦理委员会的批准。

同意

所有参与本研究的患者均对参与本研究和发表本数据表示知情同意。

利益冲突

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

TQ负责研究构思和设计，并对手稿进行修改;ZH和FL进行实验并起草手稿;YG和JG分析了数据。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

致谢

上海市卫生和计划生育委员会基金资助项目(No. 201540289)。

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