文摘

的目标是。合成网格的长期选择腹壁疝的临床治疗:相关的长期并发症激发了新一代bioresorbable假肢的发展。在这工作,聚已酸内酯(PCL)多孔膜由溶剂浇铸/ porogen浸出的PCL /聚(乙二醇)(挂钩)混合不同成分(不同的PCL / PEG重量和PEG分子量)进行了应用。选择一个最优的多孔膜结构基于物理化学的评价,生物力学,在体外生物属性,而商用疝网(CMC)的引用。发现。选择PCL7-2i膜,源自PCL / 70/30挂钩(PCL: 70000 - 90000 Da;挂钩:35000 Da),显示应用程序的合适的孔隙大小,中间表面亲水性、仿生机械性能。在体外cytocompatibility PCL7-2i膜执行单元测试显示,在21天高细胞生长,减少促炎il - 6对CMC的生产,和重要的分泌胶原蛋白I型。结论。PCL7-2i细胞膜仿生生物力学属性和在体外生物学性质相似,甚至比——抗炎行为和胶原蛋白的生产- CMC,商用产品,表明潜在的改进整合在宿主组织。

1。介绍

腹疝最常见的问题之一与主要腹部外科手术的发生率2到20%的患者(1),20 - 25%的复发率(2]。这个副作用产生的高发病率国家卫生保健体系中一个重要的成本,与全世界估计每年数以百万计的疝修补手术(20数百万只治疗腹股沟疝)(3]。

疝治疗方法包括一系列选项缝合修复和假体材料加强筋膜缺陷(4]。最后一个选项显示其潜力,限制复发率对缝合修复(5,6),尤其是延迟这2 - 3年的风险7]。目前,植入的假体,能够支持受损组织的机械和结构功能,代表了护理标准治疗。网格的主要优点是简单的可用性和抵抗患者的相关组织压力(8,9]。

合成网格,通常基于nonresorbable聚合物如聚丙烯(PP)和扩展聚四氟乙烯(ePTFE),是临床实践的长期选择自50年代的介绍(10]。这些材料是有效的疝治疗对外科缝合但能引起长期并发症如粘连形成,移植感染/拒绝,瘘管形成,疝复发(11- - - - - -13]。所有这些原因,研究软组织工程旨在实现新一代的假肢能够模仿宿主组织的机械性能和重建生理环境的细胞成分14]。的一个可能的改进是支架的发展resorbable属性,整合在宿主的能力,促进新组织的形成,和更换后一个定义良好的时期。这些材料的例子有VICRYL™®(美国新泽西州Ethicon Inc .,萨默维尔市)和敌克松™®(Covidien,曼斯菲尔德妈,美国),基于共聚物配方的聚(乙醇酸)和聚(乳酸)(PLGA):虽然能够促进组织集成,他们迅速退化,导致疝复发由于组织力量损失(15- - - - - -17]。

力学性能改善了聚交酯网®(美国Ethicon,圣洛伦佐,公关),基于聚交酯(乙交酯丙交酯95%,5%),然而,表明一个更严重的炎症反应14]。TIGR®(罗福斯科学,乌普萨拉,瑞典),基于fast-degrading PLGA和复丝网状slow-degrading聚(环丙烷碳酸盐)(PTMC)和戈尔BIO-A®(美国戈尔,纽瓦克,德),一个基于聚乙醇酸(PGA)实际上电纺网-PTMC共聚物,显示有限的机械承载属性在应用程序(14]。

Phasix®(美国巴德沃里克,RI),聚(4-hydroxybutyrate) (P4HB)网,还介绍了在降解时间长(> 72周男性尤卡坦猪);然而,其长期在活的有机体内反应是未知的(14]。

此外,bioresorbable聚合物,如聚已酸内酯(PCL) polydioxanone (PDO), PLGA,保利(L-lactic酸)(丙交脂)和PCL /胶原蛋白混合物,在科学文献调查的准备nanofibrous外科网(18]。尽管纳米纤维纹理模拟细胞外基质(ECM)结构和促进细胞依附,nanofibrous膜机械性能不佳,无法支持腹壁的压力,尤其是当聚合物分子量降低在退化(18]。

另一种支架形态典型的灯丝或nanofibrous结构可以提供优越的机械性能允许使用bioresorbable聚合物治疗腹部疝。

成员PCL的聚酯聚α羟基酸)的家庭,是一种很有前途的候选人bioresorbable疝网格。PCL是美国食品和药物管理局批准了聚合物,生物相容性和生物可降解的特性,能够支持附件和增长的不同类型的细胞(成纤维细胞(19,20.],成肌细胞[21),软骨细胞(22],平滑肌细胞(23]),通常被用于不同的生物医学应用程序(24]。特别是,PCL广泛用于制备支架应用于整形外科修复手术治疗的伤口愈合25]。

在这个工作中,聚合物混合与聚(乙二醇)基于PCL(挂钩)两种不同分子量(PEG1: 10000 Da;PEG2: 疝治疗35000 Da)为应用程序开发和测试结构,机械,和生物属性与一个商业产品(CMC、Dipro医疗设备、圣毛罗·Torinese意大利),用作参考系统(26]。CMC是一个nonresorbable复合假肢用于腹疝修补术和由聚丙烯轻量级大孔网状缝在光滑的聚丙烯薄膜。挂钩是一种聚合物经常用于组织工程由于其无毒性属性,低蛋白质粘附,无免疫原性,水溶性和有机溶剂(27,28]。在这项工作,挂钩是用作porogen混合组件。聚合物混合物的物理化学性质进行了分析评估形态、热性能、化学特性、表面润湿性、拉伸力学性能。在体外单元测试使用人类成纤维细胞,直接参与伤口愈合过程(29日,30.),进行评估细胞的生物相容性材料的细胞毒性和细胞生长,炎症,和调制ECM的蛋白质组学分析。

生物力学和生物特征的集成是基本发展的新一代生物工程支架能够复制和模仿宿主组织特征。

2。材料和方法

2.1。材料

PCL ( :70000 - 90000 Da)和挂钩( :10000 Da和35000 Da,编码为PEG1 PEG2,分别从Sigma-Aldrich)提供(意大利米兰),以颗粒形式。所有溶剂均为分析纯,用作收到(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。CMC是轻轻地由Dipro医疗设备(圣毛罗·Torinese、意大利)。

2.2。脚手架制造

多孔膜PCL准备使用溶剂casting-leaching方法。PCL / PEG1和PCL / PEG2 100/0, 70/30, 60/40, 0/100 (wt / wt)混合混合准备使用的解决方案。聚合物溶解在氯仿(wt / v)浓度10%。铸造一个卷膜得到的每个解决方案(10毫升)在玻璃培养皿55毫米直径。通过蒸发溶剂被在一个通风柜在室温下一段48 h,和干膜重( )。每个膜然后在去离子水浸泡48小时:水取代了这一次后,和膜进一步在去离子水浸泡24小时保证浸出挂钩。获得的多孔膜在37°C一段干24小时又重( )。样本代码被发表在表1。淋溶的代码样本是“ ,”, 表明PCL数量在最初的PCL / PEG混合( 或6,这表明PCL内容在最初的混合是70%或60%,分别) 表明挂钩用于混合类型( 或2,表明PEG1或挂钩2,分别)。

表1
前后样品命名挂钩浸出过程。
2.3。盯住淋溶出百分率

的比例挂钩淋滤膜计算根据 在哪里 和 是前后膜浸出的权重。

2.4。扫描电子显微镜

扫描电子显微镜(SEM狮子座1430、蔡司、米兰、意大利)进行表面和断裂部分(液氮)前后膜浸出挂钩。样本sputter-coated SEM分析之前用金子。加速电压是20 kV。

2.5。差示扫描量热法

膜的热性能,研究了浸出前后,差示扫描量热法(DSC)使用助教仪器DSC Q20(意大利米兰)。膜样品(5 - 10毫克)在铝锅,体重和非等温扫描进行−65°C到100°C(第一加热;冷却;第二加热)10°C /分钟的升温速率下氮气氛。熔化温度( )和熔化焓( )从第二个DSC热膜测量扫描而结晶温度( )和焓( )从DSC冷却获得扫描。玻璃化转变温度( )PCL、PEG1 PEG2并没有发现,因为它低于最低温度可采用DSC仪。

淋滤膜也由DSC分析了从室温加热到120°C 10°C /分钟测试干燥过程的效率(24小时孵化在烤箱37°C)。缺乏一个吸热峰在100°C被认为是由于水蒸发的证据有效干燥。

2.6。傅里叶变换红外光谱学

化学分析的样品浸出前后进行了PerkinElmer前沿光光谱仪配备一个衰减全反射取样器(FTIR-ATR、米兰、意大利)。光谱被记录在400 - 4000厘米−1在室温下,用钻石晶体,32为每个样品进行了扫描。

2.7。接触角

样品的静态接触角表面,浸出前后,通过悬滴法测定,使用5μL重蒸馏的水滴。膜的静态接触角测量在室温下在空气中凸轮200 KSV仪器(意大利米兰)配备Attensionθ为数据采集软件。静态接触角值的平均值15措施在每个样本的随机领域膜。

2.8。拉伸试验

浸出前后膜的力学性能进行了评估,对矩形标本使用单轴拉伸试验拉力试验机ZwickRoell Z005(意大利热那亚)。样本提出了一个类似规模的横截面积(0.35±0.05毫米厚度,宽度9.8±0.2毫米)和长度(13.5±0.2毫米)。拉伸力沿长度的样品应用直到断裂,使用预加载的0.05 N / s和变形速度0.05%。至少5标本为每个类型的膜进行了测试。弹性模量( ),压力失败,在失败和变形测量的应力-应变曲线,由力-位移曲线使用特定的样本大小。 被评为第一的斜率线性应力-应变曲线的一部分,和破坏应力和变形计算材料能承受的最大应力和相应的变形,分别。

CMC网格拉伸力学性能也进行了测试干燥矩形标本(50×300毫米)在一个太®qt™/ 10仪器(意大利都灵)。牵引力应用以及样品的长度,以恒定十字头位移速度为100毫米/分钟。至少5标本进行测试。失败的压力和变形测量的应力-应变曲线 没有评估由于样本的非齐次结构,特点是网孔。

2.9。细胞培养

BJ人类皮肤成纤维细胞(写明atcc - crl - 2522、特丁顿、英国)在最低基本培养基培养(MEM)补充10%胎牛血清的边后卫,2毫米谷酰胺,100μU /毫升青霉素的赔率,μU /毫升链霉素和2.5×10 - 1μU /毫升两性霉素b,所有这些产品都购买Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。细胞被放大到达到融合(34000细胞/厘米2),在此期间,每3天中被改变。

2.10。细胞毒性

细胞毒性测试是根据ISO 10993 - 5标准进行。在这项研究中,浸出后的膜材料(18厘米2表面)与70%乙醇消毒和紫外线(UV)放射治疗每一方(20分钟),然后在37°C孵化24小时3毫升的MEM完全培养基。中进一步提取在体外单元测试(提取介质)。积极的控制是一个完全培养基补充5%二甲亚砜(DMSO) (v/v)。消极的控制,细胞培养在标准中使用。

细胞被播种在融合在一个96孔板(~ 10.000细胞/),一旦坚持,200μL与提取介质交换的媒介。细胞被放置在一个孵化器,在暴露于72 h提取介质的37°C,细胞形态的变化进行了评估下AX70 light-reverted显微镜(奥林巴斯、米兰、意大利)和细胞生存能力测试是由使用Promega CellTiter蓝色®(WI麦迪逊,美国)。在每个,100μL的新媒体与10加在一起μL的试剂。150分钟后,相对荧光单元(RFU)值进行评估与分光光度计板读者(579例/ 584 em)。材料的可行性价值至少70%被选为细胞培养生长资料评估。

2.11。细胞培养生长

膜与70%乙醇消毒和紫外线辐射治疗每一方(20分钟),在接触中2小时前细胞播种。细胞融合与磷酸盐(PBS),清洗分离胰蛋白酶(0.25% (w/v)),放置在接触一个全新的完全培养基抑制酶作用。成纤维细胞数与血细胞计数器和播种材料,放置在一个6-well板细胞密度为15%(相当于~ 50.000细胞/)。在定义的时间(3、7、14和21天)细胞生存能力测试执行CellTiter蓝色®。

为了计数细胞,成纤维细胞在文化的标准曲线板。细胞被播种在24-well板块在几个浓度(从5000到70000个细胞/),一式两份。一旦坚持,50μL CellTiter蓝色®是添加到每个,150分钟后,RFU染料发出的评估。

在21天,样本与4%多聚甲醛溶液固定30分钟在室温和保存在PBS在4°C免疫组织化学协议。

2.12。细胞因子的生产

中7、14、21天收集和储存在-80°C到细胞因子分析。il - 6的量化是由使用Elecsys il - 6试验(罗氏诊断、米兰、意大利),一个electrochemioluminescent免疫测定(ECLIA)。

使用酶联免疫试剂盒测定il - 10进行分析(美国博士德生物技术,Fremont, CA)。

2.13。免疫组织化学

Paraformaldehyde-fixed样本治疗评价胶原蛋白I型和III型生产。胶原蛋白类型我是被反COL1A1山羊主要抗体和相对FITC-conjugated二级抗体抗体(驴IgG-FITC);III型胶原被反COL3A1山羊主要抗体和相对rhodamine-conjugated二级抗体(牛anti-rabbit IgG-R)。所有抗体都是购买在圣克鲁斯生物技术(美国达拉斯,TX)。样本清洗三次PBS和PBS Triton 0.1%处理2分钟在室温下permeabilize细胞膜。样本的5% BSA 30分钟,然后处理混合的两个主要抗体,1:100稀释1% BSA, 1小时37°C。然后,混合二次抗体1:200稀释1% BSA添加到样本为1小时37°C。15分钟结束前孵化,DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole)被添加到每个示例1:1000稀释检测细胞核。最后,通过荧光显微镜样品进行了分析(CX40、奥林巴斯、米兰、意大利)。

2.14。ECM提取

细胞被播种在PCL7-2i膜和CMC网和培养7天。细胞被移除和ECM恢复中描述26]。

2.15。样品处理和液体Chromatography-Tandem质谱与片™的蛋白质组学分析(质/女士片)

样品处理和质/ MS分析中描述的相同的协议Vozzi et al。26使用了)。短暂、蛋白质浓度是由bicinchoninic酸测定(皮尔斯,热科学,沃尔瑟姆,妈,美国)。大约40毫克的蛋白质溶解在碳酸氢铵25毫米,减少与二硫苏糖醇5毫米为30分钟80°C,并使用碘乙酰胺烷基化10毫米在37°C为20分钟。消化了孵化隔夜1:100胰蛋白酶(罗氏、巴塞尔、瑞士):衬底在37°C。肽混合物被酸化,然后加载在C18盒为了消除碎片和另外纯化为0.22μm过滤器。肽被稀释到0.1μ克/μL 2%的乙腈(英国Romil ACN) / 0.1%甲酸(FA);5μL注入了库检索和2μL在复制片™方法分析。

色谱分离的多肽进行使用nano-HPLC系统(AB Sciex Eksigent,华盛顿,美国)。肽的筛选了色谱法直接加工使用5600 TripleTOF™质谱仪(AB Sciex)配备DuoSpray™离子源(AB Sciex)。数据获得使用片™猎枪data-independent MRM量化的方法。对于图书馆,MS / MS数据处理ProteinPilot™软件(AB Sciex)。错误发现率(罗斯福)分析设置为95%的置信水平。

2.16。统计分析

所有数据都表示为 偏差得到了至少五个不同的实验。组之间的差异是由单向方差分析和评估学生 - - - - - -测试;棱镜7软件是用于统计分析。值被认为是显著的 值< 0.05。蛋白质组学数据,评估差异表达蛋白质CMC和PCL7-2i之间在7天,MarkerView 1.2软件使用。三个技术复制生物样品。两组进行比较 - - - - - -测试数据:配对 - - - - - -测试是作为一个统计参数之间的连续变量来确定质量的两类光谱数据之间的显著差异。一个 值< 0.05折 被认为是重要的验证类别之间的差异。

3所示。结果

3.1。盯住淋溶出百分率

孵化的PCL / PEG1和PCL / PEG2混合电影在水浴几乎造成了大约完成解散挂钩组件的多孔膜(表2)。淋溶出的百分比对应于膜的孔隙度程度挂钩。一小部分挂钩的初始金额仍出现在混合(表2)。

表2
减肥的比例混合由于盯住解散和比例的不溶解的挂钩的初始数量挂钩。
3.2。通过扫描电子显微镜(SEM)形态特征

图1显示了扫描电镜图像的外表面和断裂部分PCL / PEG1和PCL / PEG2混合。


图1
表面的SEM图像和断裂部分的材料(奇数)之前和之后(偶数)浸出:PCL (1、2), PCL / PEG1 70/30 (3、5), PCL7-1i (4、6), PCL / PEG1 60/40 (7、9), PCL6-1i (8、10), PCL / PEG2 70/30 (11、13), PCL7-2i (12、14), PCL / PEG2 60/40(15、17)和PCL6-2i (16、18)。规模 表面和10μ部分图像。

电影展示了一个紧凑的部分。观察混合组件之间没有明显的相分离的混合成分。

形态学评价也进行PCL-based膜后解散(图挂钩1)。表面几乎没有多孔。相反,断裂的部分与均匀分布高度多孔球形的毛孔。

3.3。热性能通过差示扫描量热法(DSC)

淋溶的第一加热扫描样品确认完全缺乏水的吸热峰与水蒸发不存在(数据没有显示)。因此,使用干燥的效率协议(样本孵化24 h在37°C)证明。

图2收集DSC对PCL第二加热热分析图,PCL / PEG1和PCL / PEG2电影前后样品取消挂钩。分析第二加热扫描允许删除热历史后材料性能的比较。


图2
比较DSC冷却热分析图(a1和a2)和第二加热热分析图(b1和b2) PCL / PEG1(数字1)和PCL / PEG2(数量2)样品,之前和之后的浸出。

挂钩和PCL是半结晶聚合物的特点是熔点( )。挂钩和PCL玻璃化转变温度不能检测到DSC分析,它们都是在-67°C (31日),对应的限制冷却温度DSC仪用于这项工作。对于每一个混合,双熔融峰(表3)发现,由于不同熔化温度的混合组件。在混合, PCL阶段并没有变化,而略有降低熔化峰的观察PEG1和PEG2阶段对纯挂钩(图2,B1和B2)。

表3
结晶温度和焓的PCL和挂钩阶段作为混合组成的函数从DSC测量冷却扫描(在10°C /分钟);熔化温度和焓的PCL和挂钩阶段作为混合组成的函数测量从第二加热DSC扫描(在10°C /分钟)。

PCL的冷却扫描、PEG1 PEG2样本显示结晶事件(图2A1和A2)。相反,PCL / PEG1混合电影被三个特征 (表3):低 有关的均匀成核结晶PEG1 (1.6±0.1°C PCL / PEG1 70/30为2.4±0.2°C PCL / PEG1 60/40),中间吗 是由于PCL结晶(约23°C),和更高的吗 是关联到PEG1异相成核(35.5±0.4°C PCL / PEG1 70/30为39.1±1.4°C PCL / PEG1 60/40) (32]。在混合, PEG1和PCL的值(仅考虑PEG1异构的结晶)下降比纯聚合物。齐次PEG1成核机制的存在是归因于细分散的PEG1 PCL矩阵。

对于包含PEG2的混合,PEG2通过两种不同的结晶成核机制,同构和异构,观察只对PCL / PEG2 60/40混合电影,分别为1.4±0.4°C和40.0±0.7°C。类似于观察PCL / PEG1混合, PCL和PEG2的价值观(考虑结晶异相成核机制PEG2 PCL / PEG2 60/40混合)略有下降对纯聚合物。

另一方面,PCL / PEG2 70/30只显示PEG2混合均匀成核结晶。因此,PCL / PEG2 70/30只显示两个不同的混合样品 大约1.5°C(结晶PEG2的均匀成核)和25°C (PCL)的结晶。存在的一个独特的结晶温度PEG2阶段可能是由于更细分散的PEG2 PCL矩阵(表3)。

只盯住去除后,所有的膜显示特征热事件,第二加热冷却扫描和扫描,分别归功于PCL结晶和融化。在多孔膜,PCL的冷却和熔化焓变高一点的值控制PCL样本,表明多孔膜的结晶程度略高。

后解散(表挂钩3),特征与挂钩相关联的热转移阶段不能检测到。这可能是由于盯住一个完整切除或少量的挂钩的永久热转换不能检测到DSC分析。

3.4。化学分析FTIR-ATR

FTIR-ATR特征吸收带(补充材料图S1)的PCL和挂钩的FTIR-ATR光谱检测到混合的电影。特别是,一把锋利的乐队在1726厘米左右−1PCL carbonyl-stretching对应观察。当挂钩的内容增加,没有观察到明显的转变这个乐队表明贫穷之间的交互阶段。

盯住去除后,吸收带归因于PEG2组件再没有检测到多孔薄膜的FTIR-ATR光谱,如不对称拉伸振动C-O-C债券在1280厘米左右−1。这个结果证实了完整切除porogen PCL / PEG混合电影(补充材料图S1)。

3.5。表面润湿性能的属性

表4收集所有样本的静态接触角,之前和之后的浸出。PCL样品(73.1±2.8°)亲水性显著低于PEG1(41.5±2.9°)和PEG2(44.0±1.9°)样品(两个比较, )。表面的静态接触角PCL / PEG1投电影随着PEG1的数量的增加而减少,这是71.5±2.4°混合包含wt 30%。PEG1和44.7±2.6°wt混合含有40%。PEG1。相反,PCL / PEG2混合样品的静态接触角随着PEG2内容没有明显变化(49.1±3.0°PCL / PEG2 70/30和51.2±2.5°PCL / PEG2 60/40),尽管这低于PCL。

表4
静态浸出前后样品的接触角值。

浸出后,所有样品的表面润湿性能减少。多孔膜与PEG1 porogen显示最高的接触角值(110.0±6.8°PCL7-1i和82.9±7.4°PCL6-1i)而PCL7-2i和PCL6-2i保留表面亲水性接触角为67.8±3.9°和66.8±6.1°。

3.6。机械特性

测试了材料的力学性能包括弹性模量、最大负载,在最大负载变形图3。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图3
比较分析的弹性模量(a),失败压力(b),和失败变形(c)对PCL /混合浸出前后挂钩。 , • , § ,和⚬ 。

弹性模量的增加而增加PCL(图的内容3(一个))。PCL / PEG2混合的弹性模量高于PCL / PEG1混合使用相同的成分。同样的趋势确认后浸出过程:PEG2-derived样本有一个更高的弹性模量比相应的PEG1-derived。在这两种情况下,浸出过程会导致更少的刚性结构对nonleached样本。

同样,破坏应力增加而增加的内容PCL(图3 (b)),高值PCL / PEG2混合,淋溶和nonleached样本。浸出过程降低了失败的压力。CMC的失败压力是2.4±0.3 MPa。

在浸出之前,失败(图的变形3 (c))是类似的混合样品和显著低于纯PCL。浸出后,样本显示更高的可变形性:特别是,PCL / PEG2-based混合有更高的失败变形。CMC变形在失败是49.1±3.5%,明显高于PCL样品。

3.7。体外细胞毒性

细胞毒性测试表明,多孔和无孔的资料后3天同样的可行性(> 95%)对消极的控制(未经处理的细胞,100%)和CMC(> 95%),值高于70%的阈值由ISO 10993 - 5(数据未显示)。

3.8。体外细胞生长测试

测试只进行多孔样品,至于PCL / PEG混合:挂钩将发布在测试期间的培养基,及其弹性模量太高了对参考网格疝假肢(33]。结果表明,只有PCL7-2i呈现良好的细胞生长趋势,持续提高细胞生存能力(图中去4)控制和CMC的重合。


图4
细胞生长曲线( 天)。
3.9。炎症概要

基于cytocompatibility和细胞生长测试的结果,PCL7-2i膜被选中执行分析炎症剖面反(il - 10)和pro - (il - 6)炎症标记物。如图5,最初的抗炎的PCL7-2i(图5(一个)促炎的趋势(图)被替换下场5 (b)最后),il - 6浓度对第七天高出4倍,但对CMC水平降低。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
白细胞介素- 10”(a)和6 (b)趋势PCL7-2i和控制样品。 和° 。
3.10。免疫组织化学

最后,还我型和III型胶原蛋白生产半定量的评价与免疫组织化学和I型胶原/ III型胶原蛋白比量化。在控制条件下,BJ成纤维细胞产生III型胶原蛋白(neo-formed类型),在小数量、I型胶原蛋白(图(稳定)6(一))。PCL7-2i减少III型胶原蛋白的生产支持一个强大和显著增加(±3次, )的I型胶原蛋白。这一趋势也证实了I型胶原蛋白(图/ III型胶原蛋白的比例6 (b)0.8(附近),它显示一个值 )。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
胶原蛋白I型和III型生产((一个); 和 )和胶原蛋白类型I /类型III比率((b); )在PCL7-2i和控制样品。
3.11。ECM蛋白质特性

ECM蛋白质提取CMC和PCL7-2i膜的质谱,允许识别和分析243蛋白质(补充材料表S1)。蛋白质是分类根据其本地化(补充材料图S2),并且有多达125人ECM ECM-associated或膜蛋白。其中,四是差异表达当样本CMC和PCL7-2i比较(表5)。

表5
在ECM蛋白质差异表达蛋白质的分析。

4所示。讨论

这项工作旨在PCL多孔膜的制备和表征作为新一代的resorbable疝网格。特别是多孔PCL膜的物理化学特征,机械,和生物学特性,比较结果与商用CMC网格的性能:这种轻量级的聚丙烯网可以支持细胞殖民,生成一系列的生物化学修改的典型的炎症反应,胶原蛋白生产、ECM表达式(26]。然而,轻量级网格并不合适,防止粘附内部器官(34]。相反,聚丙烯薄膜不引起粘连的形成由于其平面和内脏antiadhesive特性所示Wistar鼠(33和临床研究35,36]。

在我们的工作中,多孔膜具有不对称结构的特点是一个糟糕的多孔皮肤层和内部孔隙度高。溶解的数量挂钩是约等于合并挂钩的数量,孔隙度为29.4±0.7%和28.8±0.6% PCL7-1i和PCL7-2i样本和38.9±0.3%和38.8±0.0% PCL6-1i PCL6-2i,分别。PCL和挂钩有不同的极性(PCL是亲水性差而挂钩是高度亲水接触角测量建议)和顺向弱相互交互:由于这个原因,盯住阶段形成球形分散在PCL矩阵域,导致球形孔约5μm大小挂钩后删除。此外,孔隙表面是光滑的。这些结果表明,挂钩和PCL非混相,这与之前的研究相一致的科学文献[37]。事实上,FTIR-ATR分析表明,PCL的羰基伸展带混合组成的函数没有转变,证实了可怜的混合组件之间的交互。这个结果表明PCL和PEG2弱相互作用,这与DSC数据结论是一致的。然而,这个结果是相反的结果大关et al。38)发现挂钩和carboxyvinyl聚合物之间的相互作用,拥有相同的PCL的羧基官能团。可能,不同极性之间的挂钩和PCL(挂钩高度亲水而PCL不好亲水所显示静态接触角测量)阻碍了足够高的氢键的形成来检测变化的PCL羰基FTIR-ATR乐队。

热特性通过DSC分析表明,混合部分结晶相挂钩的存在降低了PCL阶段结晶率,导致PCL略有减少 。这个结果没有观察到PCL / PEG2 70/30混合PEG2仍在在PCL结晶熔融状态,虽然经历了结晶温度在低于PCL的均匀成核机制。另一方面,PCL结晶程度略增加多孔膜对PCL电影紧凑,建议一些挂钩组件的成核效果。然而, PCL相位保持不变的混合前后挂钩去除,表明PCL晶体的完善程度是所有的样品相似。

重要的是,DSC分析表明不同的混合组件之间的交互,根据PEG的分子量:更高的挂钩倾向于结晶均匀结晶机制在PCL / PEG2混合与PCL / PEG1混合使用相同的成分,所显示相应的结晶焓值。的均匀结晶行为PEG2 PCL / PEG2混合分布,显示PEG2域较小的大小相比PEG1的PCL / PEG1混合。这种差异是由于较高的分子量对PEG1 PEG2:在溶剂蒸发膜形成,PEG2阶段部分聚结现象阻碍了它较高的分子量。因此,PEG2域保留小一号相比,混合在PCL / PEG1 PEG1域。

多孔电影获得使用PEG1 porogen显示表面疏水性(静态接触角为110.0±6.8°PCL7-1i)或亲水性差(静态接触角为82.9±7.4°PCL6-1i)。另一方面,PCL7-2i和PCL6-2i更亲水接触角为67.8±3.9°和66.8±6.1°,分别。不同类型的分散PEG1和PEG2 PCL / PEG混合可能是原因不同组织的表面PCL链:在多孔样本PCL / PEG2混纺、亲水性羧基可能是半个优先分布在样品表面。此外,表面形态的差异也影响了表面润湿性能。

机械分析PCL / PEG膜和多孔PCL电影(图3),为了描述和选择生物力学特性类似于网格的疝修补术目前在诊所使用。网格应该强大到足以抵抗压力的状态中修饰名词的墙,同时不那么僵硬导致不适和疼痛的病人。文献引用值疝网格的弹性模量是20 - 120 MPa (33]。

弹性模量的增加而增加PCL内容,前后浸出过程。PEG的分子量对力学性能的影响:PEG2-derived混合的弹性模量(PEG2: 35000 Da)高于PEG1-derived (PEG1: 10000 Da)。

有趣的是,PCL / PEG2 70/30混合的弹性模量对PCL高,而弹性模量的PCL / PEG1 70/30混合与尊重PCL的显著降低。这种行为可能是由于不同的混合组件之间的交互度和不同的混合形态当使用挂钩有不同的分子量。的确,DSC分析表明PEG2组件精细分布在PCL / PEG2 70/30混合;这可能是原因其优越的力学性能对PCL / PEG1 70/30混合。浸出过程后,获得的多孔样品的弹性模量从PCL / PEG2混合高于样品准备的PCL / PEG1混合,又暗示更细更均匀孔隙形态。在这两种情况下,浸出后,生成的多孔结构提供了一个弹性模量显著低于相应的nonleached样本。

同样,破坏应力增加而增加PCL(图的内容3 (b))由于优越的机械性能nonleached PCL对挂钩的混合物,由于低孔隙度的淋溶样品。的弹性模量、破坏应力的PCL / PEG2高对PCL / PEG1混纺、前后浸出。这种行为,可以向不同的孔隙形态,取决于PEG的分子量。浸出过程增加了变形的破坏(图3 (c)),它提出了显著降低值nonleached样本对纯PCL样本,再次暗示更均匀、细孔结构。

作为结论,更高浓度的盯住了多孔,减少硬膜,但有趣的是盯住最高的分子量(PEG2)导致更精细分散,导致硬结构。浸出后,膜表现出弹性模量在相同的网格范围疝假肢,因此适合在疝修补术中的应用。这是第一次溶液浇铸/ porogen PCL / PEG混合浸出技术是利用制备的支架与适当的属性腹壁疝的治疗和替代实际上电纺支架或filament-based网格14]。

生物特征,BJ人类皮肤成纤维细胞被选为试验材料进行调查,根据他们在伤口愈合过程中的作用。事实上,他们代表一个细胞屏障对假肢,调节修复过程生长因子的分泌,调节细胞周围环境(39]。

所有的样品表现出最佳的细胞生物相容性比消极的控制。细胞生长的分析,进行多孔样本,允许进一步选择材料进行调查。事实上,PCL6-1i PCL6-2i, PCL7-1i nonadhesive nonproliferative细胞属性,当PCL7-2i特点是逐步增加细胞表面殖民。疏水性和机械和结构属性PCL7-2i似乎对它的能力产生积极影响的支持细胞殖民。

基于这些结果,PCL7-2i膜被选作进一步分析。炎症概要文件显示的初始增加抗炎细胞因子il - 10 (40]其次是一个强劲增长的促炎、il - 6 (41),减少了对CMC级。这一趋势是强调在我们以前的工作26]和文献[42]:炎症是典型的身体应对手术植入,可以支持网格殖民和集成(43]。这种类型的反应可能是有关他们的表面和机械性能,这与细胞相互作用,调节chemomechanical信号集成和刚度传感和刺激分泌炎症介质(44,45]。

PCL7-2i预见的生物特征的两个主要组件的免疫组织化学分析ECM由成纤维细胞产生:胶原蛋白和胶原蛋白三世。PCL7-2i刺激生产,在21天,成熟的我对类型III型胶原控制和CMC网格相比,也证实了I / III型胶原的比例(值接近0.8)。这两个蛋白是参与网一体化假肢植入在装修过程中产生一个初始的分泌增加成熟类型III,其次是生产成熟类型的我46- - - - - -48]。文献表明下降的比例能显著重要性疝病理生理学可能导致结构和机械稳定性改变网格的宿主组织(49]。增加胶原蛋白的生产类型我发现在我们的实验和炎症的结果显示一个潜在的稳定体内网植入支持组织整合和当代减少主机拒绝的过程。

有趣的是,蛋白质组学分析验证,同时,证实了组织数据:差异表达的蛋白质(表5),III型胶原产生显著的过表达在第七天在ECM PCL7-2i而CMC网。在我们之前的论文(26),它是强调,主要变化在ECM沉积和调制发生在第一个14天,由于这些原因,我们专注于细胞播种后第七天质谱分析。除了III型胶原,也肌球蛋白轻链监管12 b和78 kDa glucose-regulated蛋白质导致PCL7-2i上过表达,而60 kDa热休克蛋白表达下调。

肌凝蛋白监管轻链的维护是很重要的细胞形态学和动态(50]。78 kDa glucose-regulated蛋白质是endoplasmatic网(ER)伴护蛋白质参与装配和质量控制[51]。它是在细胞膜上表达和释放细胞培养基(52),它的合成是由ER的多肽的积累。有趣的是,这种蛋白质是在癌症和强调细胞,它可以主动分泌和假定的角色在控制细胞信号传导、扩散,入侵,炎症和细胞凋亡53]。它的感应和分泌PCL7-2i可能是一个有用的回答应力状态,导致细胞增殖和侵袭性的膜。此外,60 kDa热休克蛋白是一个chaperonin主要参与线粒体蛋白质折叠和易位,但它也被认为是一个危险的信号压力或受损的细胞54]。这种蛋白质导致PCL7-2i稍微弱势。

这项工作是第一步的发展新一代的resorbable疝支架。特别是,多孔PCL膜(PCL7-2i)被选中在四个不同的PCL多孔膜,根据其物理化学和生物力学属性,cytocompatibility,和细胞生长特性,然后进一步对其详细的生物特征的行为。结果表明,PCL7-2i膜可能会应用于腹壁疝的治疗。事实上,PCL7-2i膜生物反应的分析表明,这种类型的支架能够机械和结构复制参考组织和支持细胞殖民。这是强调通过支架上的细胞生长率高,其最小的炎症反应,可能避免不良的副作用,和ECM合成稳定的支持下的调制形式的胶原蛋白和细胞增殖相关的蛋白质和殖民。所有这些方面可能导致支架集成。

将旨在进一步测试在活的有机体内验证PCL7-2i以评价其外科治疗的有效性。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由MANUNET 2011 ERA-Net项目(软组织MES-STAR-Morphologically工程脚手架应用和再生)。

补充材料

图S1:比较FTIR-ATR PCL的光谱,PEG2和PCL / PEG2 60/40 PEG2删除之前和之后的电影。相同的结果已经观察到样品含有30% (wt) PEG2或PEG1 porogen。图S2:蛋白质的分类提取CMC和PCL7-2i膜对他们的细胞定位。表S1: 243蛋白提取CMC和PCL7-2i膜和被质谱分析。(补充材料)