文摘

外源性孕激素在人类健康和多个应用程序在兽医,特别是在定时人工授精协议。孕酮nanoencapsulation在生物相容性的聚合物,如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA),传统上是另一种替代硅树脂释放装置用于控制发情。孕酮浓度在纳米粒子必须精确地知道;出于这个原因,验证方法必须适用于确保可靠的结果,适用于纳米粒子的应用程序。在这项工作中,一个紫外可见分光光度法是测定验证PMMA纳米粒子合成的孕激素miniemulsion聚合。氯仿作为溶剂,选择性封装药物和聚合物基体的组件不影响孕激素恢复。检测和定量限制(DL和QL)分别为0.32和0.96 mg·L−1分别和精度测试(不同分析人员和设备)表示可接受的相对标准偏差(RSD < 5%)。Miniemulsion聚合反应进行了生产两种不同的形态:团簇(NS)和nanocapsules (NC)、平均强度直径(Dz) 150 - 200和240 - 300 nm,分别。聚合重量转换获得了这两种情况下高于95%和封装效率大于69%和90%的团簇和nanocapsules,分别。

1。介绍

孕酮是一种类固醇激素的基本函数来繁殖。与孕激素药物用于人类子宫内膜保护、不正常出血,治疗前或绝经后期,怀孕维护辅助生殖治疗和预防早产的1]。在兽医,外源性孕激素特别是牛用于定时人工授精协议,针对同步发情的雌性受精利率和改进。发情周期控制方法的使用,除了促进畜牧业的管理,允许扩大使用人工授精,加速遗传改良,改善肉和牛奶的产量(2,3]。

孕酮在nanometric矩阵的整合可以促进长期释放和在各种应用程序是有益的4]。提出了生物聚合物微观和纳米颗粒作为一种替代方法来封装黄体酮通过不同的技术,如戊二醛交联壳聚糖或酪蛋白分散在非水相(5,6)包含复杂与β环糊精或2-hydroxypropyl -β环糊精(7),miniemulsification /溶剂蒸发法[8,9),溶剂沉淀(10,11超临界CO),2antisolvent扩张乳剂(12),在水中和水油双乳液(13]。

这种技术在聚合物纳米粒子的合成miniemulsion聚合,合成纳米粒子因为它允许多个应用程序,包括高固体和低粘度乳液的生产,混合聚合物粒子,聚合在非水体系中,一步聚合水分散的媒体,低分了体重聚合物分散媒体的生产,将疏水单体,无机固体的封装,封装的药物(14]。疏水性化合物的封装miniemulsion聚合已经申请药物,如消炎痛(15],紫杉醇[16),和它莫西芬(17]。

直接miniemulsion聚合,分散相包含单体,costabilizer,取决于应用程序,其他化合物的疏水特性(例如,药物封装)。为了产生液滴的单体,用高剪切装置(声波降解器,动静干涉系统Ultra-Turrax或高压均质机)生产miniemulsion平均液滴大小50到500海里,然后聚合(18]。这种技术可以让固体聚合物粒子的合成(团簇,NS)和核壳粒子(nanocapsules、数控),与油性核心。药品注册和发布概要文件在NS和数控可能不同,因为他们依赖于药物理化性质以及与密封剂的交互和释放介质。疏水性药物,如孕激素往往是可溶性的油性核心数控,增加释放时间。

在一项研究中两亲性β环糊精粒子分散在水介质中,Memisoglu-Bilensoy et al。19)发现,在NS疏水类固醇药物的物理化学性质(孕激素、皮质醇和睾酮)发挥关键作用的药物负载和释放。作者确认化合物的疏水性越高,越慢释放的过程。疏水的释放红外- 780碘化染料与生物可降解聚合物封装在NS和数控没有水溶性聚(D, L-lactide) (PLA)或聚已酸内酯(PCL)是评价Bazylińska et al。20.]。他们观察到慢释放率在数控和证实,疏水性染料时可以更有效的封闭的油的核心数控比只在聚合物基体的NS封闭。类似的结果吲哚美辛乙酯在NS和PCL的数控。聚合物的存在长期酯破裂释放,而石油长期酯持续释放的存在(21]。

颗粒大小是由初始液滴分散,表面活性剂覆盖和表面张力不显著改变过程中,使水滴的主要聚合的成核机理(22]。退化现象聚结和单体的扩散(奥斯特瓦尔德成熟)可以使miniemulsion不稳定,导致液滴大小的增加。然而,这种现象可以用乳化剂的使用和控制costabilizer在适当浓度(14]。

聚合物纳米粒子用于药物输送的发展应该考虑组件的生物相容性和生物降解性。因此,生物相容性聚合物和无溶剂的使用,自然,和非离子乳化剂卵磷脂等另外的costabilizers油和脂肪酸,是首选的生物医学应用程序(9,23- - - - - -26]。

PMMA是安全的应用程序在各种生物医学产品的人工晶体,骨水泥、和牙科材料,在一些化妆品注册(27]。毒理学研究使用PMMA纳米粒子与满意的结果由Lekshmi et al。28)在评估在白化大鼠体内毒性。anatomopathological作者没有发现任何变化,血液学的和生化参数。PMMA纳米粒子也证明了低毒性与人类细胞培养(K562[在体外实验中29日],TPH1 e A549 [26])。

技术,如液相色谱(30.- - - - - -32),气相色谱法(33- - - - - -35被用来量化封装和孕激素释放。很少有研究黄体酮进行量化使用紫外分光光度法(4,36- - - - - -38]。然而,没有一个人提出了方法验证按照国际规定,这是必要的,以确保结果的精密度和准确度。

一个频繁的问题,限制了利用分光光度法测定化合物量化与低选择性[30.]。然而,在矩阵的制定组件不显著影响药物吸收光谱,光谱光度测量的方法可以提供精度和准确性,索引类似于色谱方法,达到一定的浓度范围。Maliwal et al。38)相比,孕酮的高效液相色谱法与紫外分光光度法测定在商业配方(平板电脑)。方法显示无显著差异,他们认为适合平板电脑的常规分析。

由于孕激素需要提取纳米颗粒药物复苏和封装效率决定,一个好的溶剂必须适用于保证一个精确的结果。这意味着聚合物纳米颗粒还需要可溶性。酒精甲醇的解决方案(36,38,39和丙醇30.)常用于孕酮测定协议不适合目前的研究,提出了黄体酮封装在PMMA纳米粒子,因为这些溶剂不赞成解散PMMA聚合物链。氯仿溶解PMMA容易,可以适当的溶剂从纳米颗粒孕酮提取。

考虑上述情况,本研究旨在验证孕激素测定的紫外分光光度法测定PMMA纳米颗粒。方法验证根据标准建立的国际协调委员会(特异性、线性精度、准确性、检出限、定量限、和健壮性)和应用来确定孕酮浓度PMMA纳米颗粒。纳米颗粒平均直径等参数和单体重量转换也确定。

2。材料和方法

2.1。材料

单体甲基丙烯酸甲酯(MMA),2,2 -偶氮二异丁腈(AIBN引发剂)、孕酮(P4, 99%)、氯仿、四氢呋喃(四氢呋喃)从Sigma-Aldrich购买。卵磷脂(α蛇丘)作为表面活性剂。Crodamol GTCC®(辛/癸甘油三酯,costabilizer)从αQuimica购买。去离子水是用于实验。所有试剂和溶剂的分析级。AIBN以前在甲醇(Sigma-Aldrich)再结晶,过滤,真空干燥。

2.2。方法验证的孕酮测定PMMA纳米颗粒

分光光度法的验证了考虑以下参数:特异性,线性,精度、准确性,检测极限(DL),定量限制(QL)和鲁棒性,根据建立的标准技术要求的国际协调委员会药品对人类使用(40]。方法验证:两个分光光度计使用( )分光光度计日立模型u - 1900(光谱带宽4海里;波长精度±0.5 nm;波长重复性±0.3 nm;光度准确度±0.002 Abs;光度重复性Abs)和(0.001 )分光光度计瑞利模型uv - 2601(光谱带宽2海里;波长精度±0.3 nm;波长重复性±0.15 nm;光度准确度±0.002 Abs;光度重复性0.001 Abs)。

2.2.1。特异性

特异性的评估是由孕酮的吸收光谱获得的比较,获得纳米粒子(有或没有孕激素)可溶性氯仿。为了获得聚合物纳米粒子的吸收光谱,乳胶样品受到干燥在烤箱60°C,直到他们达到恒重。干样本然后可溶性在氯仿,稀释,扫描从200年到300海里。

2.2.2。线性

为线性的决心,准备三个校正曲线在不同的日子。对于每个校准曲线,一个标准的孕酮溶液制备氯仿和随后在八个不同稀释浓度,从2到50毫克·L−1( 进行了一式三份)和吸光度测量每个浓度在253海里。线性评估使用线性回归和适合的质量模型验证了方差分析(方差分析)。

2.2.3。检出限(DL)和定量限制(QL)

检测和量化限制了基于斜率 和标准偏差 拦截的轴 (吸光度)的线性曲线,根据(40]

2.2.4。精密度和准确度

精度评估是基于测量的相对标准偏差(RSD)系列。这一分析考虑重复性、中间精密度和重现性(40]。重复性是由重复3个浓度水平的分析性程序的最小和最大浓度线性测试。每个浓度分析了7次,同日,同样的分析师和设备。对于中等精度,同样的过程之后,但在不同的日子里,由不同的分析师。再现性与生殖的评估分析集中在第二个中级水平的实验室在两个不同的日子。同样,精度评估是基于经济复苏指数(Rec, (2)),在上面的描述分析, (mg·L−1期间)代表浓度检测分析在253海里 代表的理论浓度进行稀释。

2.2.5。鲁棒性

鲁棒性评估分析方法的能力保持不变,当受到小工艺参数的变化。因此,两个品牌的溶剂(三氯甲烷、分析级)进行评估在P4量化验证可能的干扰。一个标准的孕酮溶液520 mg·L−1是准备。然后,250年整除μ这个解决方案的L被稀释5毫升氯仿的每个品牌(“A”、“B”),导致浓度26 mg·L−1。最后,分析了样品5复制在253海里。

2.3。PMMA纳米粒子合成的孕激素封装

PMMA纳米粒子是由miniemulsion聚合技术和配方定义根据先前的研究在研究小组进行生物相容性的纳米粒子的合成药物传输(23- - - - - -26]。配方中使用的粒子合成展示在表1对团簇(NS)和nanocapsules (NC)。考虑到某些水溶性(MMA单体礼物150更易·L−1),一个疏水引发剂(AIBN)被用来防止二次成核和纯PMMA颗粒在水相的形成(41]。

表1
孕酮的标准miniemulsion配方封装在PMMA团簇(NS)或PMMA nanocapsules (NC)。

miniemulsion的有机相制备与MMA、卵磷脂、Crodamol GTCC, AIBN,药物(P4)时指定。这些组件是均质然后在40分钟的水混合,以形成一个macroemulsion。然后,macroemulsion受到液滴破碎的过程由声波降解法(费舍尔科学、声波Dismembrator型号500、400 W) 4分钟60%幅度(10年代和5 s脉冲脉冲)。miniemulsion准备也同样分为玻璃试管,满心气态氮去除氧从头部空间。最后,试管被关闭,沉浸在恒温槽在70°C开始聚合反应。每个试管中沐浴在指定的时间间隔和冷却获得转换动力学和直径大小的结果。

2.4。纳米粒子特性

整个聚合反应,样本撤销评价纳米颗粒平均直径(Dz)和直径多分散性指数(PDI),这是由动态光散射使用Zetasizer设备(纳米系列、莫尔文仪器)。阅读前,样本稀释大约在1:20 (v / v)与之前准备MMA饱和水。

聚合物纳米粒子的形态特征是由透射电子显微镜(TEM,模型JEOL JEM 1011 100 kV)。这个分析,滴稀释样品(0.05%,v / v)被放置在300 -网格Formvar /碳铜网格(电子显微镜科学)。干燥后,样本sputter-coated薄碳膜,以避免恶化的PMMA在电子束下。

甲基丙烯酸甲酯重量换算 确定所述Bernardy et al。(2010) (25]。因此,乳胶样品(2 g)拍摄在不同的时间间隔从反应介质和转移到先前加权铝胶囊含有0.2克1 wt。%对苯二酚水。之后,胶囊干60°C,直到达到恒重。转换是决定聚合物实验和理论内容之间的比率。部分的非易失性组件(乳化剂,costabilizers、对苯二酚和孕酮)从聚合物中扣除分数。

乳胶样品中残留单体含量测定的聚合反应(280分钟)。分析由顶部空间气相色谱法(GC 2010 af岛津制作所)配有火焰离子化检测器(FID)使用的总蒸发技术的挥发部分样本。校准曲线与标准样品制备包含单体的测量,分析了一式三份。

PMMA分子量分布测定凝胶渗透色谱法(GPC)使用高效液相色谱法(高效液相色谱法,日本岛津公司,模型LC-20A),与三列日本岛津公司垫片包GPC 800系列300×8毫米(807年801年GPC, GPC 804 e GPC)、示差折光检测器(模型RID-10A)和autosampler SIL-20A(模型)。乳胶样品(0.02 g)最初在四氢呋喃(四氢呋喃,4毫升),随着过滤(0.45μ米),最后分析。四氢呋喃作为流动相的流速1毫升·分钟−1和35°C。聚合物分子量测定从校准曲线产生与聚苯乙烯标准分子量在580 g·摩尔−1和9.835×106g·摩尔−1。

2.5。孕酮收率(变化)和封装效率(EE)的PMMA纳米颗粒

为了评估可能的干扰成分的高分子纳米粒子在药物复苏收益率(办法),PMMA纳米颗粒被准备,根据表1,孕激素浓度的1、2和20米 。与确定的目的,乳胶样品(1.5 g)在60°C和可溶性干10毫升氯仿。整除被稀释得到吸光度值在0.3和1.0之间在253海里。每个公式分析计算(一式三份和变化3), (mg·毫升−1)是纳米粒子合成和后恢复孕酮的浓度 (mg·毫升−1)是孕激素浓度添加到纳米粒子合成配方。

确定封装效率(EE),聚合物颗粒与水相分离,离心13.528 g×45分钟。沉淀是干60°C,在10毫升氯仿溶解,稀释,和过滤(聚四氟乙烯,0.2μm)和吸光度决心在253海里。封装效率(EE)然后根据获得的(4), 在沉淀回收孕酮的质量, 是橡胶质量, 乳胶是孕激素比例。每个配方以一式三份和乳胶样品没有孕激素受到同样的待遇,作为参考样本(空白)光度读数。

3所示。结果与讨论

3.1。方法验证的孕酮测定PMMA纳米颗粒
3.1.1。特异性

在量化的测试中,特异性结果应该确保程序不受影响的杂质或辅料42]。图1介绍了纯孕酮的吸收光谱(P4)和PMMA纳米颗粒。在紫外区域,孕激素的礼物只有一个吸收峰位于230至270海里。241年和243年之间的最大吸收纳米(图1(一));然而,溶剂是245海里的切断,使它不可行量化分析物在波长低于这个值。因此,方法验证使用吸光度在253海里,在药物吸收高,大大减少了溶剂的干扰。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
紫外吸收光谱纯P4 (a)和(b) P4-loaded NS(20毫克⋅g−1)和NS参考(P4)补充道。

孕激素自由团簇(空白样品)当可溶性氯仿在测量光谱吸光度为零附近地区(图1 (b))和nanocapsules呈现相同的行为。因此,证明了该方法的选择性之间的孕激素组件PMMA纳米颗粒(聚合物、乳化剂和costabilizer)在253海里。

3.1.2。线性、检测限(DL)和定量限制(QL)

得到的标准曲线”Abs = 0.0277 C + 0.0035”显示调整系数的决心 0.997,表明高比例指数浓度和吸光度之间的范围2和50 mg·L−1。方差分析(方差分析,单边测试)的结果证实,线性回归模型是重要的( ),呈现没有缺乏配合。

DL和QL估计(10.96)0.32 e mg·L−1分别显示,该方法能够检测和量化小浓度P4的样本。考虑一个最佳的工作范围10至40毫克·L−1,QL对应于低价值的10%这个范围因此可接受的方法。

3.1.3。精密度和准确度

重复性和中间结果精度如表所示2,它包含在3个浓度水平,分析由不同的分析师在不同天。在表3计算和关键 通过学生的价值观t以及。

表2
重复性评估精度和中间结果。
表3
学生的t以及平均数据重复性和中间的评估精度。

RSD小于5%的结果评价的中间结果的准确性和重现性,包括最大和最小浓度评估。

在所有可能的比较,意味着发现最大和中间浓度没有影响95%的置信水平。最低浓度的对比手段”第一天/分析师和一天2 /分析师”和“第一天/分析师和一天2 /分析师B”显示统计差异对前面提到的信心水平。然而,预计变化和可接受浓度接近量化的极限。

获得的结果重现性的第二个实验室(实验室。B)如表所示4。比较多个实验室的方式,由学生完成t以及表所示5。

表4
结果该方法的重现性。
表5
学生的t以及平均数据再现性的评价。

方法相对标准偏差小于5%,这是一个可接受的价值。根据数据,没有统计学差异在95%的置信水平对所有可能的比较。的准确性,可以观察到理论的区别和恢复值,中间值和最大浓度,低于7%(表2和4)。因此,在一般情况下,恢复数据是令人满意的和兼容的方法。

3.1.4。鲁棒性

鲁棒性进行了考虑收购的可能性溶剂不同的商标。表6显示了比较的结果与两种不同的溶剂供应商进行分析。

表6
鲁棒性分析的结果与不同品牌的氯仿。

结果表明,使用来自不同供应商的分析级溶剂不干涉分析。意味着显示无统计差异在0.05的显著性水平学生的t以及。另外,关于26.0毫克的标准浓度无统计学差异·L−1被检测到。

3.2。PMMA纳米颗粒特性和黄体酮的决心

的比例1:9和1:1 MMA之间:Crodamol青睐,分别与团簇粒子的形成(NS)和nanocapsules (NC)形态,因为它被其他作者(23,25,43]。图像呈现在图2确认这些形态。在图2(一个)可以观察到球形固体颗粒大小较低色散。另一方面,在图2 (b)可能观察到颗粒形成了一个核心由Crodamol和外层由PMMA nanocapsules的特征。nc(图2 (b))提出了更高的分散粒子大小,确认由DLS获得的数据。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
TEM显微图的PMMA (a)团簇(b) nanocapsules,都使用1 。

聚合反应进行了配方见表1,不同的只是孕酮的浓度。表7显示孕酮的浓度根据质量添加到配方,通过光谱分析浓度恢复产量(一)和封装效率(EE)。

表7
添加和P4计算浓度和封装效率(EE)的PMMA纳米颗粒。

收率(一)由(3)是106%到94,表明该方法的健壮配方成分,不影响药物的量化。封装效率(EE)浓度高时低P4被使用,但它是减少P4浓度最高的使用意味着在P4的数量有限制,可以纳入纳米颗粒。事实上,减少EE的20毫克·g的浓度−1是预期的,因为它是一个相对较高的收费制定固体部分(约10%)。发现nanocapsules封装效率高于团簇,可能由于黄体酮Crodamol比PMMA的溶解度更高。

聚合反应与拟议中的配方(表11)评估 。平均强度结果(Dz)液滴直径/纳米粒子在整个聚合反应如图3。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
平均强度(Dz)的纳米颗粒直径在miniemulsion聚合形成的PMMA空白纳米颗粒(Ref)。(a)和孕酮(P4;1 )(b)。数控(nanocapsules)和NS(簇)。

PMMA nanocapsules (NC)提出了平均直径在240年和290纳米之间,和多分散性指数(PDI)在0.20和0.25之间。另一方面,PMMA nanosphere (NS)提出了降低Dz的结果,在150年和200海里,以及单分散的粒度分布,PDI低于0.13。数据3(一个)和3 (b)表明孕激素的存在并没有显著改变粒子直径,反映的稳定miniemulsion即使在孕激素的存在。最终粒径之间的比例反应(250分钟)和液滴直径1.05(开始反应)数控和1.01 NS。因此,平均尺寸是可以忽略不计的增加,表明没有退化现象,如合并或扩散恶化。粒度稳定也表明,液滴的成核是主要的聚合反应机理22]。

在图4进化的重量转换(a)和反应速率(b)。残余单体的结果如表所示8并在图5摩尔质量分布。

表8
气相色谱法获得的残余单体含量的反应(t= 280分钟)。
(一)
(一)
(b)
(b)
图4
转换(a)和(b)反应速率(Rp) miniemulsion聚合形成的PMMA数控(nanocapsules)和NS(簇)使用1 。

图5
摩尔质量分布在PMMA纳米粒子引用(Ref。药物免费)和20 (NS:团簇;NC: nanocapsules)。

聚合动力学的行为形成的数控和NS 1 是类似的,280分钟后,反应达到转换高达97%。反应速率的降低(Rp)数控观察图4 (b)不破坏聚合物转换。减少Rp是较低的结果为数控系统中粒子数(更高的Dz;参见图3)导致自由基/粒子的数量比例的增加,因此,在激进的终止。乳胶样品残留单体的存在是不可取的,因为它可能会增加毒性。数据表明样品中的单体含量很低,不到0.6%。这些结果同意那些通过Feuser et al。44),没有发现残留在PMMA miniemulsion样品合成的聚合单体,与类似的配方。

除了改变反应速率,小粒度可以提高聚合物的摩尔质量。系统有更高的粒子数和较小的Dp比率越低的激进的/粒子,使聚合物链的增长和摩尔质量的增加。这可以证实重量平均摩尔质量(Mw)的团簇,其价值是510 kDa,而对于nanocapsules接近440 kDa。这些结果符合Tiarks et al。41)观察Dp的增加和摩尔质量与PMMA nanocapsules稳定剂浓度的增加减少。样品与孕激素平均体重445 kDa, 380 kDa,分别对团簇和nanocapsules。尽管如此,摩尔质量分布的分析,如图5指出,该参数的药物效果是微不足道的。

4所示。结论

验证紫外分光光度法测定选择性,精确、准确,且足够健壮的孕酮测定甲基丙烯酸的聚合物纳米粒子。相对标准偏差低于5%,在所有实验条件评估。的准确性,获得最大百分比区别孕激素添加和恢复为中级水平的工作浓度为7% (26 mg·L−1)。孕激素的方法应用于确定封装效率在PMMA nanocapsules和团簇。测试执行与纳米颗粒显示令人满意的结果,表明聚合物矩阵及其组件,当可溶性在氯仿中,没有干涉孕酮的量化。PMMA纳米粒子的生物相容性配方用于合成了稳定和潜力的孕激素。此外,孕激素的存在没有造成大的粒子直径等参数的变化,单体转化率和摩尔质量。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。