文摘

本调查旨在制造的核壳微粒组成的聚(lactic-co-glycolic酸)和壳聚糖(PLGA-CS议员)使用电纺。使用电纺的挑战是,它有很多参数,改变产品结果如果任何单一参数改变。然而,这个系统的优势是,我们可以制造微/纳米纤维或微/纳米颗粒。了解液体浓度的影响,电纺参数(电压、针头大小、距离针收集器,和弹射速度)是固定而PLGA或壳聚糖的浓度是不同的。结果表明:PLGA微粒子时可以制作成功的PLGA浓度小于10 wt %。的存在证实了壳聚糖壳电动电势测量,红外光谱,光学观察,荧光观察。壳聚糖壳厚度可以控制通过改变壳聚糖的浓度和衡量fluorescamine标记方法。此外,SEM观察表明,壳聚糖的浓度影响PLGA-CS微粒的大小。5-dimethylthiazol-2-yl MTT (3 - (4) 2, 5-diphenyl溴化四唑)试验测试表明,PLGA-CS微粒具有优良的生物相容性。

1。介绍

保利(lactic-co-glycolic酸)微粒(PLGA MPs)吸引大量治疗药物的兴趣和抗原运载系统(1- - - - - -3),主要是因为他们的持续释放,本地化的版本,和体内稳定(3]。然而,PLGA是疏水性聚合物。因此,它是很难被淹没在水里的。所以,需要亲水表面改性来提高microparticulate运载系统的有效性。修改PLGA议员表面,普朗尼克®(4]或壳聚糖是建议一个合适的材料外套传统PLGA颗粒(5- - - - - -8]。壳聚糖通常是选择外套PLGA议员药物/基因递送系统由于其亲水属性,阳离子电荷,生物降解性和mucoadhesive属性(6- - - - - -10]。有很多方法可以外套PLGA表面与壳聚糖如溶剂乳化法(两倍或三倍11),静态的O / W-dispersion micromixer PLGA和壳聚糖(5,12),液滴微流控溶剂蒸发和提取13),而超临界流体技术(14]。在这些方法中,二重或三重乳化方法是一种传统的方法涂壳聚糖在PLGA微粒子(15]。然而,这种方法有一些缺点,如(1)有机溶剂和剪切应力可以变性或停用PLGA在制备过程中部分;(2)PLGA颗粒也逐步水解后产生酸性内部环境为乳酸和羟基乙酸,这是有害的生物聚合物稳定;和(3)的封装效率PLGA颗粒基本上是低,从而导致消费大量的PLGA的准备。

电喷射控制方法来生成PLGA微粒子(4,16]。疏水表面亲水化的PLGA议员报道了使用电喷射与亲水聚合物混合,普朗尼克(4]。此外,电喷射被称为高技术制造核壳实际上电纺纤维使用核壳喷丝头针(16- - - - - -18]。因此,本研究的目的是采用电纺的机器制造的核壳聚(lactic-co-glycolic酸)壳聚糖微粒(PLGA-CS议员)喷丝头针的协助。与传统方法相比这种方法的优点是容易修改亲水性壳聚糖在疏水性PLGA议员和壳聚糖的厚度通过改变聚合物的浓度。此外,这一过程,与传统的乳液,防止聚合物浪费在洗涤的步骤。溶剂中在操作期间。

这个调查的主要目的是研究PLGA的壳聚糖浓度的影响制造PLGA-CS议员。形态学PLGA-CS议员被扫描电镜观察。傅立叶变换红外光谱、电动电势和荧光观察了评价涂层的成就。PLGA-CS微粒子是由细胞毒性评估测试的生物相容性和细胞生存能力测试。这种方法不仅快速和安全,也有很高的潜在的生物医学应用。

2。材料和方法

2.1。材料

脱去乙酰基壳聚糖(C3646≥75%),聚(lactic-co-glycolic)酸(PLGA) (85: 15), hexamethyldisilazane (hdm),四氢呋喃(四氢呋喃,最低99%)和二甲基甲酰胺(DMF, 99%)从Sigma-Aldrich购买,美国。醋酸(CH₃羧基,99.0%)从Duksan购买纯化工有限公司。戊二醛从DaeJung有限公司购买了韩国。二甲亚砜(DMSO溶液、99.0%,Samchun纯化工有限公司,有限公司,韩国)、乙醇(默克公司、德国),胎牛血清(的边后卫),PS(青霉素和链霉素(抗生素),杜尔贝科的磷酸缓冲盐(D-PBS)没有钙或镁,3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl溴化四唑(MTT)和trypsin-EDTA从GIBCO购买(CA)卡尔斯巴德。l - 929细胞是写明ATCC,来自美国。

2.2。方法

2.2.1。制造PLGA-CS议员

在电纺系统应用聚合物解决方案之前,壳聚糖的解决方案是由溶解壳聚糖在1.5 wt %醋酸PLGA的解决方案准备在四氢呋喃:DMF和比率1:1。然后,PLGA-CS议员被喷射形成壳聚糖溶液的壳核壳喷丝头针在PLGA溶液被驱逐吐丝器如图的核心1。研究聚合物的浓度的影响,电压等参数的电纺,距离针收集器,喷射的速度解决方案是固定的(见表1)。

2.2.2。表征PLGA-CS议员

核壳PLGA-CS议员的形态学检查使用扫描电子显微镜(SEM、sm - 65 f, JEOL,日本)。粒度分布是由指望SEM图像(见表2)。

壳聚糖在PLGA的表面检测到的电动电势测量,红外光谱分析,荧光观察、光学观测,fluorescamine方法。电动电势测量PLGA议员和PLGA-CS议员被使用电动电势分析仪。PLGA-CS议员的红外光谱分析了减反射傅里叶变换光谱(红外光谱)(美国PerkinElmer频谱GX)在一个波长范围4000到500厘米⁻¹和光谱收集从64年扫描分辨率为4厘米⁻¹。光学图像观察到在水中浸泡议员24小时之前使用显微镜拍照。获得荧光壳聚糖,PLGA-CS议员都沉浸在0.1毫克/毫升溶液tetramethylrhodamine (TRITC)在乙醇/水/碳酸氢钠(0.1米),并允许反应24小时。光学图像和共焦图像PLGA-CS议员与倒置显微镜观察(德国徕卡)和共焦显微镜(奥林巴斯阵线1000)。确定数量的壳聚糖表面涂布PLGA-CS议员,fluorescamine(记述有机物;莫里斯平原,NJ)应用19]。短暂,PLGA-CS悬架是通过添加50毫克PLGA-CS议员100人μl蒸馏水。然后,PLGA-CS悬浊液离心,享年16000岁在一个微型离心机(微型离心机,热科学)。100年μL fluorescamine在DMSO溶液(2.0 g / L)添加到20μ在黑色96 - L的浮在表面的荧光检测微型板块。经过三个小时的反应在一个黑暗的房间,荧光测定的激发波长390 nm和发射波长515 nm)使用一个微型板块荧光谱仪的读者。壳聚糖校准曲线与每个实验同时运行。壳聚糖附着在PLGA-CS议员的数量计算乙酸溶解PLGA-CS议员。荧光强度被转化为壳聚糖的浓度与纯壳聚糖的标准曲线进行比较。然后,壳聚糖涂层的质量PLGA-CS议员决心如图5。

2.2.3。在体外实验中

示例灭菌。为了准备样品体外实验流程,微粒被放在一个铝箔和消毒和紫外线照射15分钟。

电池的维护。成纤维细胞(l - 929)亚文化rpmi - 1640年中期和补充10%胎牛血清的边后卫,1% penicillin-streptomycin (P / S),和5%的边后卫。细胞培养在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂(孵化器,ASTEC,日本)。细胞分离与trypsin-DETA (GIBCO),离心,然后resuspended介质。培养基是改变每2天,提供足够的营养来保持细胞健康。

细胞毒性测试。确认微粒子的生物相容性,PLGA的细胞毒性,PLGA-CS1 PLGA-CS2, PLGA-CS3议员是评估使用我们之前的报道中描述MTT试验方法(20.- - - - - -24]。简单,成纤维细胞被播种密度为1×10⁴细胞/毫升96孔细胞培养板和孵化24小时37°C和5%股份有限公司₂。稀释提取解决方案(200μ每在不同浓度l)(100年,50岁,25岁,12.5,0%)然后补充道。成纤维细胞是治疗7天,然后20μl 5毫克/毫升3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)的解决方案是添加到每个。板是培养4 h。中包含MTT方法移除后,DMSO溶液添加到每个好溶解任何不溶性甲瓒晶体。光密度(OD)测量的波长595 nm的酶联免疫吸附试验(ELISA)读者(无限F50, Tecan奥地利GmbH,奥地利)。

细胞增殖试验。为了评估细胞增殖,成纤维细胞L929(10的细胞密度⁴rpmi - 1640细胞/ 1毫升)被播种在PLGA和PLGA-CS议员和培养不同时期在37°C调湿大气中5%的股份有限公司₂。然后,细胞增殖是检查使用MTT测定[23,24]。

3所示。结果与讨论

PLGA-CS微粒应用等生物大分子的交付,因为他们的优势的可持续和可控释放PLGA生物聚合物,合成阳离子电荷,可生物降解和mucoadhesive天然壳聚糖的性质6,25]。到目前为止,有几种方法用于制造PLGA-CS议员;W / O乳状液是一种著名的方法(1]。然而,W / O法是一种消耗品,生物聚合物和药物制造过程中很容易丢失。因此,我们正在努力制造PLGA-CS议员通过电纺。电纺的是一个简单和容易的方法来制造纳米/超细纤维,但有许多参数来控制。因此,在这个调查,电纺参数表所固定1当聚合物的浓度发生了变化。这个调查的目的是获取微粒从电纺的机器。电纺的机器的外加电压改变是由于改变聚合物解决方案。捏造的PLGA议员,27岁kV电压;这么高的电压是适合获得颗粒;否则,纤维形成。制造的核壳PLGA-CS议员,合适的电压是25 kV。

调查的影响PLGA浓度在捏造PLGA议员,以下电纺参数固定如下:电压:27 kV,距离针收集器:15厘米,针尺寸:25计,和喷射速度的解决方案:0.5毫升/小时(见表1),而集中的PLGA的解决方案被选为5 wt %, 7 wt %,分别和10 wt %。结果表明,粒子的大小和形状取决于PLGA浓度。具体地说,与浓度5 wt %和7 wt %,球体是捏造(命名为PLGA1议员和PLGA3议员,职责。);然而,随着浓度的10 wt %,纤维形成(名为PLGA3议员)。整体显示粒子的大小改变改变PLGA浓度。实际上,当浓度的PLGA从5 wt % 7 wt %,增加粒子的大小增加到大约0.2 - 1μ(数据2(a1)和2(a2)) 0.2 - 2μ(数据2(b1)和2(b2))。然而,在10 wt %的PLGA浓度、纳米纤维和微粒形成的混合(数字2(c1)和2(c2))。因此,5 wt %的浓度是用于制造核壳PLGA-CS议员。

制造的核壳PLGA-CS议员5 wt %的PLGA浓度被选中。最初的电纺参数固定和以前一样(距离针收集器:15厘米,针尺寸:25计,和喷射速度的解决方案:0.5毫升/小时)。然而,来自27个kV电压降低到25 kV优化粒子的形成。类似的调查PLGA国会议员,在这里,PLGA-CS议员大小和形状控制完全由壳聚糖的浓度。图3显示扫描电镜形态学PLGA-CS议员5 wt % PLGA为不同的壳聚糖浓度如下:0.01 wt %(数据3(a1)和3(a2)), 0.15 wt %(数据3(b1)和3(b2))和0.3 wt %(数字3(c1)和3(c2)),溶解在1.5 wt %醋酸。5 wt %的PLGA和0.01 wt %的壳聚糖(PLGA-CS1),粒子大小的核壳PLGA-CS1议员在0.2 - 3的范围μm。此外,人物3(a1)和3(a2)表明,chitosan-shells PLGA-CS1议员PLGA-core融化和沉积。然而,当壳聚糖的浓度增加了十五倍的,也就是说,5 wt %的PLGA和0.15 wt %的壳聚糖(PLGA-CS2),粒子大小增加到2 - 10左右μm, PLGA-CS2议员成为多孔的表面。5 wt %的PLGA和0.3 wt %的壳聚糖(PLGA-CS3) PLGA-CS3议员的形态类似于PLGA-CS2议员表面多孔结构和大小的PLGA-CS3议员急剧增加到3μm。

此外,微粒的电动电势增加壳聚糖浓度较高的外部水。它从大约−增加 mV (chitosan-free PLGA颗粒) mV时,壳聚糖浓度的壳核壳喷丝板为0.01 wt %。的电动电势对正电荷的显著增加 mV和 mV时,壳聚糖浓度为0.15 wt % 0.3 wt %,分别(表2)。电动电势的程度越高,粒子的稳定性。这一结果表明,壳聚糖浓度的增加创造了一个稳定的PLGA-CS议员在解决方案26]。

进行调查以确定PLGA-CS议员确实是由PLGA和CS。PLGA和壳聚糖的存在证实了核壳PLGA-CS议员分析特定的山峰的存在的单一纯材料PLGA-CS光谱等强烈的特征吸收带约为1746厘米⁻¹归因于切断键的伸缩振动,和乐队在1130厘米⁻¹和1412厘米⁻¹源自切断债券和甲基碳氢键的PLGA,分别为(27]。也在图4壳聚糖的吸收波段所示:1094厘米⁻¹(o c), 1159厘米⁻¹(bridge-O拉伸),1313 - 1481厘米⁻¹(ch弯曲),1627厘米⁻¹(C = O拉伸),2923 - 2867厘米⁻¹(碳氢键),1598 - 1600厘米⁻¹(h弯),3431厘米⁻¹(地)28,29日]。因此,傅立叶变换红外光谱(图4)证实,壳聚糖在PLGA-CS国会议员的存在,因此PLGA-CS议员成功可能是伪造的。

来确定PLGA-CS议员确实是涂布壳聚糖,壳聚糖的荧光图像,光学图像的PLGA议员和PLGA-CS国会议员,和体重的壳聚糖PLGA-CS议员被观察到,显示在图5。(数据系列荧光图像5(一个)- - - - - -5 (d))证明了PLGA议员被一层薄薄的壳聚糖涂层。光学图像显示PLGA-CS议员的表面是粗糙的(图5 (f))相比,表面光滑的PLGA MP(图5 (e))。图5 (g)壳聚糖的重量变化的图,表明壳聚糖体重增长如果壳聚糖浓度的增加(PLGA-CS3 > PLGA-CS2 > PLGA-CS1)。

新生物材料的细胞毒性测试是非常重要的,以确保他们的生物相容性进行体外测试。尽管PLGA和CS都以优良的生物相容性,在这项研究中,细胞毒性的PLGA, PLGA-CS1 PLGA-CS2, PLGA-CS3微粒检查使用MTT试验,以确保安全的方法。MTT试验是一个测量光密度的比色测定结晶后的紫色甲瓒染料使用DMSO溶液溶解。黄色结晶甲瓒是由麻省理工的解决方案。麻省理工的原则可以简述如下:MTT进入细胞,进入线粒体,它就变成了一个不溶性和颜色(深紫色)甲瓒产品。MTT只能减少以来发生在细胞新陈代谢活跃,活动水平细胞的可行性。根据iso - 10993 - 5, MTT试验指MTT细胞毒性用来评估新的复合材料如前所报道(20.]。在这个调查,MTT试验来检测细胞毒性和细胞增殖在PLGA的PLGA / CS议员。结果表明,所有的样品有极好的生物相容性。事实上,细胞生存能力的100%提取解决方案所有样品(PLGA, PLGA-CS1、PLGA-CS2 PLGA-CS3)超过80%,没有明显不同,如图6。因此,细胞毒性试验表明,所有的样品都有无毒。清洗步骤去除残留溶剂中不必要的这种方法。因此,产品安全用于生物医学应用。

从细胞增殖试验图7显示了紫色的光密度是由DMSO溶液溶解沉积结晶后甲瓒染料样品(23,24]。因为MTT检测活动的细胞,MTT试验的结果在这个检查可以用来评估细胞的健康。因此,细胞在PLGA的可行性,PLGA-CS1, PLGA-CS2, PLGA-CS3议员可以使用MTT测定方法相比(20.]。在这次考试,微粒被放置在铝箔上,培养1、3、7、14天在静态环境中为了观察细胞的生长行为,如图7。总体而言,与PLGA议员组相比,光学密度PLGA-CS议员团体当壳聚糖浓度的增加而减少。因此结果是相似的和几个报告显示壳聚糖等多糖衍生品能够抑制细胞增殖。然而,研究者可以操纵和利用这一让一个稳定载体携带一种抗癌药物(30.]。

4所示。结论

在这项研究中,核壳PLGA-CS议员已经制作成功使用电纺的机器。结果显示,成功的PLGA议员制造是由集中的PLGA溶液(低于10 wt %);壳聚糖壳的厚度可以控制通过壳聚糖的浓度。然而,PLGA-CS议员显示良好的生物相容性和细胞增殖。因此,PLGA议员或PLGA-CS议员由电纺的机器保证宽,高潜在的应用在生物医学领域由于其方便,成本效益和良好的生物相容性。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

越南国立大学,支持的研究机构是胡志明市,在批准号1161 / QĐ-ĐHQG-KHCN。