文摘

热氨基酸的反应已经调查了纯有机合成、材料准备在工业和生命起源以前的化学。N-t-Butyloxycarbonyl天冬氨酸(Boc-Asp)没有溶剂加热时释放2-butene和二氧化碳。由此产生的混合物的自由熔化的天冬氨酸脱水给肽债券。本研究描述了热的反应N-t-butyloxycarbonyl肽(Boc-Gly-L-Asp Boc-L-Ala-L-Asp、Boc-L-Val-L-Asp Boc-Gly-Gly-L-Asp)有天冬氨酸的羧基末端的残渣。肽是deprotected在加热恒温110至170°C 1到24 h买得起多肽的平均分子量达到7800。

1。介绍

多肽(1)一直在研究蛋白质模型化合物(1- - - - - -8]。众多报告方法的合成多肽已发表(1- - - - - -14]。的N羧基-α氨基酸酸酐(NCA)方法(1)2,3,9,10),使用活性酯的聚合氨基酸(2)(1,4- - - - - -7),固相多肽合成(3)(8,12),和氨基酸的加热(4)(13,14)就是典型的例子。NCA方法(1)适用于制造homopolypeptides和随机copolypeptides但不适合的合成顺序copolyamino酸,哪个更重要的功能性多肽的累积。顺序polyamino酸有重复的氨基酸残基,其中氨基酸残基就像——(Gly-Gly-Asp)-。活性酯法(2)1,4- - - - - -7)和固相合成(3)(8)更适合的合成顺序copolyamino酸。然而,问题的方法(2)和(3)还有很长的反应时间和使用的溶剂。相比之下,合成的聚氨基酸通过加热导数的氨基酸(4)13,14)需要长反应时间和溶剂。

在以前的论文(15,16),我们报告的合成homopolypeptides [15)和随机copolypeptides (16在加热的N-t-butyloxycarbonyl天冬氨酸酐(Boc-Asp酐)和Boc-L-Asp混合物,酸酐,和Boc-Gly Boc-L-Ala或Boc-Val。在本文中,我们报告一个审判的合成顺序copolypeptides Boc-peptides的加热,而不是这些酐。如数据所示1和2Boc-peptides (5模拟)和Boc-L-Asp (5 e)准备加热下的N₂。

2。材料和方法

2.1。仪表

核磁共振(NMR) (JEOL fx - 100核磁共振系统(JEOL、东京、日本))是用于收集¹核磁共振光谱。日立260 - 50红外(IR)分光光度计(日立、东京、日本)用于红外光谱的集合。日立200 - 10分光光度计是用于分光光度法测量。

Jasco浸- 181数字偏振计(Jasco、东京、日本)用于测量旋光性的肽衍生品。日立163气相色谱仪配备一个手性玻璃毛细管柱Chirasil-Val [17,18)是用于对映体的分离氨基酸的衍生品。对热分析中,我们使用一个日本岛津公司DT-40热分析仪(日本岛津公司,京都,日本)。一个Jasco Trirotar-V流泵和一个Jasco uvidec第四- 100分光光度计作为探测器用于高效液相色谱系统配备一个凝胶渗透列g - 3000 PW(啧啧,山口,日本)。进化分析气体的热分析仪进行用日本岛津公司GCMS-QP1000A。

2.2。材料

2.2.1。起始原料和试剂的制备衬底肽衍生品

甘氨酸(1)、丙氨酸(1 b)和L-valine (1 c)是由日本莉香有限公司(日本东京)。Glycylglycine (1 d)和di-t-butyl碳酸氢钠(中行₂O)买来肽研究所有限公司(Minoh-shi,大阪,日本)。天门冬氨酸(1 e),N-hydroxysuccinimide (HONSu)购买Nacalai Tesque(日本京都)。N, N′-Dicyclohexylcarbodiimide渡边(DCC)是由化学工业有限公司(广岛、日本)。钯在木炭从日本购买恩格尔哈德有限公司(现在N.E. CHEMCAT,东京,日本)。三氟醋酸的酐和三乙胺(净₃)从东京购买化学工业有限公司,有限公司(日本东京)。盐酸(6米)的水解肽和醋酸和光纯化学工业,购自kouichi有限公司(日本大阪)。丙胺的解决方案包含2.0氯化氢是由冒泡盐酸丙胺。

2.2.2。底物的制备

(1)N-t-Butyloxycarbonyl氨基酸(2模拟)

Boc-Gly (2)。甘氨酸(7.51克,0.100摩尔)溶解在水溶液中(150毫升)含0.100摩尔氢氧化钠的1,4 -二恶烷溶液(150毫升)包括di-t-butyl碳酸氢钠(24.0克,0.11)是一滴一滴地补充道。2 h后搅拌,反应溶液在真空蒸发的油产品,硫酸氢钾溶解在10%,达到pH值为2.5。最终的解决方案是用乙酸乙酯提取(100毫升,三次)。提取相结合,与无水MgSO用盐水洗净,晒干₄。由此产生的乙酸乙酯溶液在真空蒸发。所得沉淀再结晶乙酸乙酯和石油醚为10.1 g(收益率报57%);熔点(mp)是91°C(点燃。19),它是94 - 95°C)。¹核磁共振(DMSO-D₆):δ7.04 (t) 赫兹,H, NH), 3.57 (d, 赫兹,2 h, CH₂),1.38 ppm(年代,9 h, CH₃);红外(KBr,厘米⁻¹):3410、3350、3116 (NH), 1750(羧基),1671(酰胺I), 1539(酰胺II);元素分析:计算的C₇H₁₃没有₄:C, 47.99;H, 7.48;N, 8.00%。发现:C, 48.09;H, 7.58;N, 7.91%。

其他N-t-butyloxycarbonyl-amino酸准备以类似的方式。他们的物理性质在下面会详细进行介绍。

Boc-L-Ala (2 b)。收益率报76%,议员87 - 88°C(点燃。1983 - 8°C)。¹核磁共振(DMSO-D₆):δ7.07 (d, 赫兹,1 h, NH), 3.97 (q, 赫兹,1 h, CH), 1.22 (d, 赫兹,3 h, CH₃),1.38 ppm(年代,9 h, CH₃)。红外(KBr,厘米⁻¹):3386 (NH), 1742(羧基),1690(酰胺I), 1520(酰胺II)。基本分析:计算的C₈H₁₅没有₄:C, 50.78;H, 7.99;N, 7.40%。发现:C, 50.78;H, 8.10;N, 7.27%。24.2 (1.30 c,醋酸)(点燃。27日(2.26 c,乙酸)19])。

Boc-L-Val (2摄氏度)。收益率报93%,议员78 - 79°C(点燃。80°C (19])。¹核磁共振(DMSO-D₆):δ6.90 (d, 赫兹,1 h, NH), 3.80 (m, 1 h, CH), 1.84 - -2.11 (m, 1 h, CH₃),1.39 (9 h, CH₃),0.87 ppm (d, 赫兹,6 h, CH₃)。红外(KBr,厘米⁻¹):3312 (NH), 1740(羧基),1649(酰胺I), 1500(酰胺II)。基本分析:计算的C₁₀H₁₉没有₄:C, 55.28;H, 8.81;N, 6.45%。发现:C, 55.42;H, 8.86;N, 6.45%。5.1 (0.97 c,醋酸)(点燃。5.8 (1.2 c,醋酸)(19])。

Boc-Gly-Gly (二维)。收益率报73%,议员138 - 139°C。¹核磁共振(DMSO-D₆):δ8.02 (t) 赫兹,1 h, NH), 6.97 (q, 赫兹,1 h, NH), 3.77 (d, 赫兹,3 h, CH₂),3.57 (d, 赫兹,2 h, CH₂),1.38 ppm(年代,9 h, CH₃)。红外(KBr,厘米⁻¹):3362 (NH)、1742、1690(羧基),1618(酰胺I), 1526(酰胺II)。基本分析:计算的C₉H₁₆N₂O₅:C, 46.55;H, 6.94;N, 12.06%。发现:C, 46.70;H, 7.37;N, 12.02%。

(2)N-t-Butyloxycarbonyl-Amino酸N-Hydroxysuccinimide (HONSu)酯(3- - - - - -d)

Boc-Gly-ONSu (3)。N-t-Butyloxycarbonyl-glycine(23.73克,0.135摩尔)N-hydroxysuccinimide (HONSu)(17.26克,0.15摩尔)溶解在乙酸乙酯(410毫升)。N, N′-dicyclohexylcarbodiimide (DCC)(34.05克,0.165摩尔)溶解在乙酸乙酯(60毫升)添加到冷却的乙酸乙酯溶液在0°C。反应混合物搅拌大约36 h在0°C。沉淀过滤后,所得滤液在真空蒸发为无色晶体,这是再结晶与丙胺给一种无色水晶(18.45 g, 50%),国会议员155°C(点燃。168 - 170°C (19])。¹核磁共振(DMSO-D₆):δ7.48 (t) 赫兹,1 h, NH), 4.09 (d, 赫兹,2 h, CH₂),2.81 (s, 4 h, CH₂),1.39 ppm(年代,9 h, CH₃)。红外(KBr,厘米⁻¹):3302 (NH)、1824、1792 (ONSu), 1740(酯)。元素分析:计算的C₁₁H₁₆N₂O₆:C, 48.53;H, 5.92;N, 10.29%。发现:C, 48.05;H, 5.90;N, 10.32%。相似的方式,其他的琥珀酰亚胺酯(3罪犯)准备如下。

Boc-L-Ala-ONSu (3 b)。91%,议员165 - 167°C(点燃。167°C (19])。¹核磁共振(DMSO-D₆):δ7.63 (d, 赫兹,1 h, NH), 4.38 (q, 赫兹,1 h, CH), 3.08 (s, 4 h, CH₂),1.40 (d, 赫兹,3 h, CH₃),1.39 ppm(年代,9 h, CH₃)。红外(KBr,厘米⁻¹):3296 (NH)、1827、1792 (ONSu), 1742(酯)。元素分析:计算的C₁₂H₁₈N₂O₆:C, 50.35;H, 6.34;N, 9.79%。发现:C, 50.52;H, 6.72;N, 9.73%。48.2 (2.16 c, 1,4 -二恶烷)(点燃49 (c 2、1,4 -二恶烷)19])。

Boc-L-Val-ONSu (3 c)。85%,议员131 - 132°C(点燃。19]128 - 129°C)。¹核磁共振(DMSO-D₆):δ7.57 (d, 赫兹,1 h, NH), 4.23 (d, 赫兹,1 h, CH), 2.81 (s, 4 h, CH₂),2.05 - -2.26 (m, 1 h, CH), 1.41(年代,9 h, C CH₃),1.00 ppm (d, 赫兹,6 h, CH₃)。红外(KBr,厘米⁻¹):3354 (NH)、1810、1783 (ONSu), 1742(酯)、1671(酰胺I), 1539(酰胺II)。基本分析:计算的C₁₄H₂₂N₂O₆:C, 53.49;H, 7.05;N, 8.91%。发现:C, 53.56;H, 7.19;N, 8.84%。23.4 (1.81 c, 1,4 -二恶烷)(点燃。37.0 (c 2、1,4 -二恶烷)(19])。

Boc-Gly-Gly-ONSu (3 d)。71%,议员164 - 165°C。¹核磁共振(DMSO-D₆):δ8.45 (t) 赫兹,1 h, NH), 7.19 (t) 赫兹,1 h, NH), 4.26 (d, 赫兹,2 h, CH₂),3.60 (d, 赫兹,2 h, CH₂),2.82 (s, 4 h, CH₂),1.39 ppm(年代,9 h, CH₃)。红外(KBr,厘米⁻¹):3416、3300 (NH) 1825、1792 (ONSu), 1742(酯),1702年,1665年(酰胺),1576年,1516年(二酰胺)。基本分析:计算的C₁₃H₁₉N₃O₇:C, 47.42;H, 5.82;N, 12.76%。发现:C, 47.50;H, 5.88;N, 12.63%。

(3)N-t-Butyloxycarbonyl-Peptides (5- - - - - -d)

TsOH (4)。天门冬氨酸(1 e)(19.97克,0.150摩尔),p亚苄基酸一水1(29.10克,0.153摩尔),苯甲醇(300毫升)和苯(300毫升)涨跌互现的三颈烧瓶与Dean-Stark装置相连。酯化反应是由回流反应混合物和消除水的瓶7天。解决方案是在真空蒸发冷却反应给一种无色固体,再结晶与氯仿和石油醚。产生49.8克(68%)、国会议员157 - 158°C(点燃。159 - 160°C (19])。¹核磁共振(DMSO-D₆):δ8.54(年代,1 h,所以₃H), 7.51 (d, 赫兹,2 h, ArH), 7.36 (s, 10 h, ArH), 7.11 (d, 赫兹,2 h, ArH), 5.14 (d, 赫兹,2 h,在北半球₂),4.50 (t) 赫兹,1 h, CH), 3.40 (s, 4 h, CH₂),3.05 (d, 赫兹,2 h, CH₂),2.28 ppm (3 h, CH₃)。红外(KBr,厘米⁻¹):3042 (NH)₃),1758、1738、1127(酯)、1185 (-SO3), 814, 739, 685。元素分析:计算的C₂₅H₂₇没有₇S: C, 61.84;H, 5.61;N, 2.89%。发现:C, 61.94;H, 5.63;N, 2.85%。1.04 (2.21 c,甲醇)(点燃。1.0 (c 1、甲醇)(19])。

Boc-Gly-L-Asp (5)。天门冬氨酸(1 e)(7.98克,0.060摩尔)和三乙胺(净₃)(12.14克,0.12摩尔)溶解在蒸馏水(250毫升),和Boc-Gly-ONSu(13.61克,0.050摩尔)溶解在1,恶烷(250毫升)4 h添加到解决方案。最终的解决方案,这是酸化KHSO为10%₄给pH值为2.5,与乙酸乙酯提取(100毫升,三次)。合并后的提取与无水MgSO用盐水洗净,晒干₄。过滤溶液在真空蒸发给无色晶体,再结晶与乙酸乙酯和石油醚产生10.17克(70%);mp 130°C;¹核磁共振(DMSO-D₆):δ8.02 (d, 赫兹,1 h, NH), 6.96 (t) 赫兹,1 h, NH), 4.56 (t) 赫兹,1 h, CH), 3.56 (q, 赫兹,2 h, CH₂),2.66 (d, 赫兹,2 h, CH₂),1.38 ppm(年代,9 h, CH₃)。红外(KBr,厘米⁻¹):3432、3340 (NH) 1756、1711(羧基),1659(酰胺I), 1547(酰胺II)。基本分析:计算的C₁₁H₁₈N₂O₇:C, 45.52;H, 6.25;N, 9.65%。发现:C, 45.43;H, 6.35;N, 9.48%。20.7 (1.06 c,乙酸)。

Boc-L-Ala-L-Asp (5 b)。Boc-L-Ala-ONSu (3 b)(0.020摩尔)加上TsOH L-Asp (OBzl (4在二氯甲烷产量Boc-L-Ala-L-Asp (OBzl)₂84%的hydrogenolyzed Pd在木炭产量5%以上Boc-L-Ala-L-Asp。产量:3.21 g, 70%, 85°C(分解)。¹核磁共振(DMSO-D₆):δ7.97 (d, 赫兹,1 h, NH), 6.94 (d, 赫兹,1 h, NH), 4.50 (t) 赫兹,1 h, CH), 3.95 (q, 赫兹,2 h, CH), 2.63 (d, 赫兹,2 h, CH₂),1.37 (9 h, CH₃),1.17 ppm (d, 赫兹,3 h, CH₃)。红外(KBr,厘米⁻¹):3432、3340 (NH) 1756、1711(羧基),1659(酰胺I), 1547(酰胺II)。基本分析:计算的C₁₂H_20.N₂O₇0.45四氢呋喃:C, 49.22;H, 7.06;N, 8.32%。发现:C, 48.98;H, 7.09;N, 8.07%。3.81 (0.972 c,乙酸)。其他基板(5度,5 d)准备以类似的方式。

Boc-L-Val-L-Asp (5度)。72%,议员85°C(分解)。¹核磁共振(DMSO-D₆):δ8.10 (d, 赫兹,1 h, NH), 6.65 (d, 赫兹,1 h, NH), 4.53 (t) 赫兹,1 h, CH), 3.83 (d, 赫兹,1 h, CH), 2.65 (d, 赫兹,2 h, CH₂),1.70 - -1.83 (m, 1 h, CH), 1.38 (9 h, CH₃),0.86 (d, 赫兹,3 h, CH₃),0.80 ppm (d, 赫兹,3 h, CH₃)。红外(KBr,厘米⁻¹):3432、3340 (NH) 1756、1711(羧基),1659(酰胺I), 1547(酰胺II)。基本分析:计算的C₁₄H₂₄N₂O₇0.45四氢呋喃:C, 52.02;H, 7.63;N, 7.68%。发现:C, 52.03;H, 7.60;N, 7.41%。5.67 (1.04 c,乙酸)。

Boc-Gly-Gly-L-Asp (5 d)。97%,议员82 - 92°C。¹核磁共振(DMSO-D₆):δ8.20 (d, 赫兹,1 h, NH), 8.02 (t) 赫兹,1 h, NH), 7.10 (t) 赫兹,1 h, NH), 4.55 (t) 赫兹,1 h, CH), 3.75 (d, 赫兹,2 h, CH₂),3.57 (d, 赫兹,2 h, CH₂),2.64 (d, 赫兹,2 h, CH₂),1.39 ppm(年代,9 h, CH₃)。红外(KBr,厘米⁻¹):3354 (NH), 1725(羧基),1657(酰胺I), 1535(酰胺II)。基本分析:计算的C₁₃H₂₁N₃O₈0.50四氢呋喃:C, 46.99;H, 6.57;N, 10.96%。发现:C, 47.05;H, 6.56;N, 10.85%。16.2 (1.04 c,乙酸)。

Boc-L-Asp (5 e)。60%,议员116 - 118°C(点燃。19]118 - 119°C)。¹核磁共振(DMSO-D₆):δ7.02 (d, 赫兹,1 h, NH), 4.26 (q, 15赫兹1 h, CH), 2.63 (d, 赫兹,2 h, CH₂),1.38 ppm(年代,9 h, C CH₃)。红外(KBr,厘米⁻¹):3358 (NH), 1720(羧基),1694(酰胺I), 1539(酰胺II)。基本分析:计算的C₉H₁₅没有₆:C, 46.35;H, 6.48;N, 6.01%。发现:C, 46.37;H, 6.59;N, 5.85%。4.5 (1.15 c,甲醇)(点燃。6.4 (c 1、甲醇)(19])。

2.3。热分析

小范围的反应进行热分析仪使用一个N下的基质₂流监控热重量分析法(TG)和差热分析(DTA);Boc-Gly-L-Asp(3.30毫克)从50°C加热到175°C的速度每分钟4.7°C。形成的气体混合物在加热的反应是直接导出到一个质谱仪(日本岛津公司qp - 1000 a)。气体是由选择性离子监测有限公司₂( = 44)、异丁烯( = 56),水( = 18)。

2.4。热的反应

N-Boc-dipeptides (5- - - - - -5度0.5更易)和N-Boc-tripeptide (5 d,0.3更易),放入不同的耐热玻璃试管(165毫米×18内部直径(证件),N下保持5分钟₂流,然后在油浴加热控制在一个恒定的温度下N₂流。加热反应后,反应混合物在试管保存在真空下24小时在室温下。导致的体重下降和红外光谱测定样品。

2.5。凝胶过滤

每个反应混合物加热后的整体反应是溶解在乙酸5毫升的0.5米,最终的解决方案是加载到凝胶渗透色谱仪(910毫米×15毫米身份证)。与0.5乙酸在洗脱,洗脱液收集了3毫升分数95年试管。每个收集的紫外线(UV)吸收分数被记录在230海里。3 M醋酸是仅用于使用Boc-L-Val-L-Asp反应混合物(5度)而不是0.5醋酸。

2.6。分子量估计

收集到的分数测试茚三酮使用薄层色谱法在发展中溶剂:1-butanol-acetic酸水(4:1:2 (v / v))。Ninhydrin-negative分数被组合为高分子量分数,和ninhydrin-positive分数总和低分子量分数,显示不是一个点而是一个跟踪区域值的范围从0到0.4。分子量越高分数冻干买得起一个非晶态肽粉,其中一部分(1 - 2毫克)溶解在0.1钠磷酸盐缓冲剂(不₂阿宝₄na₂HPO₄,pH值6.9)。一部分(20μL)与20个样品溶液的混合μL蓝色葡聚糖溶液(1.5毫克/ 0.1毫升磷酸钠缓冲pH值6.9),注入的g - 3000 PW啧啧凝胶高效液相色谱系统。保留的样品色谱图与刻度线,准备和几个已知分子量的蛋白质的保留时间。

2.7。水解多肽和氨基酸分析

2毫克的每个高分子量部分中描述的部分2。5与2毫升的6 M-HCl混合在一个玻璃试管密封在真空中。密封玻璃加热到110°C和举行8 h,这足以让完整的示例肽的水解。分析了由此产生的水解氨基酸自动分析仪的手段。

2.8。D / L比率分析

1毫升每个acid-hydrolysate上面描述的是在一个玻璃小瓶和保存在一个真空。样本的获得恒重酯化和2毫升盐酸丙胺的解决方案包含1.5,然后与三氟醋酸的酸酐N2 -丙基酯-trifluoro-amino酸(N-TFA-AA-O-2-Pr)。

3所示。结果与讨论

3.1。体重下降和离子监测期间Boc-Peptides和Boc-L-Asp加热反应

Boc-Gly-L-Asp DTA、TG的图表(5)如图3。

虽然DTA曲线缓缓行期间助教线持平,两行后会迅速下降的温度达到115°C,这与温度低于议员(130°C)。在DTA热吸收线继续,成为几乎持平在175°C。TG线也变得平坦和总重量下降了40.7%在175°C。这个比例对应的理论重量减少分解后的中银集团(34.5%)和脱水(6.2%)之间自由肽从最初的重量Boc-Gly-L-Asp化合物。监控Boc-Gly-L-Asp的进化反应气体在加热,热分析仪是直接连接到质谱(MS)。记录显示2-butene女士( = 56)有限公司₂( = 44),水( = 18)在温度条件高于110°C(图4)。监测水代线,有两个峰值的水。高峰在较低的温度下似乎是水生成的肽键形成期间deprotected二肽。在更高的温度应该是另一个高峰期间水代酰亚胺的形成。

作为对照实验,Boc-L-Asp的热分析进行了监测过程中生成的气体通过质谱如图5和6。

的助教和DTA曲线Boc-L-Asp图5显示几乎平线(第一个平面)从室温到100°C,然后迅速减少的体重在TA + DTA的能量吸收峰。在更高的温度的范围,DTA曲线再次成为平(第二个平面)在180°C和迅速落下,然后是平(第三个平面)在216°C。重量减少从第一到第二个平面对应Boc-Gly-L-Asp初始重量的49.2%。理论重量减少造成几乎完全由2-butene(50.7%)(24.1%),有限公司₂(18.9%)和水(7.7%)。这些气体监测在较低的温度范围达到180°C(图6)。体重下降(11.5%)从第二到第三个平面可能包括代酰亚胺水(7.7%)的形成和分解。体重下降的温度范围(11.5%)与能量吸收峰在DTA曲线(图5)和水生成图的第二个高峰6。

与热分析Boc-Gly-L-Asp和Boc-L-Asp相比,热的脱水反应Boc-Gly-L-Asp可能进行的热反应温度低于Boc-L-Asp [15,20.没有产生肽),但氨基酸在较低的温度。类似的功能观察Boc-DL-Asp [20.)和Boc-L-asparagine (Boc-L-Asn) [21]。后者的情况下释放氨以及2-butene有限公司₂和水。

3.2。热N-Boc-Peptides反应(5- - - - - -5 d)

表1在加热的反应显示了重量减少N-Boc-peptides在不同条件下。Boc-Gly-L-Asp的加热反应在这些条件下给重量减少37%到46%,几乎相当于2-butene的总释放(41%),有限公司₂和水。Boc-L-Ala-L-Asp、Boc-L-Val-L-Asp Boc-Gly-Gly-L-Asp理论上释放2-butene,有限公司₂和水的比例为39%,34%,和29%,分别。在温度低于130°C,这些化合物表现出减少低于理论减少。在130°C的反应底物4 h足够完整版本的中行和水。

3.3。凝胶过滤反应混合物

热的反应产品装到凝胶渗透色谱仪。体积恒定(ca。3毫升)的洗出液添加到试管中。数据7- - - - - -9显示每个收集洗出液的吸光度试管数量的230海里,这是成正比的总量洗脱后开始装货。

图7显示了反应混合物的色谱Boc-Gly-L-Asp不同反应时间的130°C。两个高峰出现在每个色谱。第一个和第二个峰值越高和低分子量分数,分别。第一个峰值显示速度与反应时间进行,直到8 h反应(d)和披露后8 h反应。结果表明,聚合反应期间主要进行8 h和退化主要8 h后进行。

图8显示加热反应混合物的色谱Boc-Gly-L-Asp (5在不同的温度下。比较第一个峰值的色谱图((a)和(b))在不同的温度下,第一峰值(b) (120°C, 24 h)显示速度比(a) (110°C, 24 h)。结果表明,条件在120°C, 24 h,对聚合比110°C, 24 h。比较第一个峰值的色谱图((c)和(d))在不同的温度下,(c)的第一高峰(150°c, h)显示速度比(a) (170°c, h)。结果表明,在150°C条件,2 h,聚合超过170°C,最好2 h。高温,如170°C,促进退化产生的聚合物基质Boc-Gly-L-Asp (5)。

反应混合物的色谱使用其他基板(5罪犯)如图9。的色谱图5 b和5度显示两座山峰,虽然反应混合物的色谱图5度显示了一个不是那么明确第二高峰。这可能是由于使用的洗出液更高浓度的乙酸(3米),比0.5强吸收乙酸在230海里,但可以使反应混合物溶解。

红外光谱(图10)的高分子量产品显示了典型的吸收酸性多肽:酰胺,酰胺二世,nh,羧基组。

3.4。估计的分子量分子量越高分数

的分子量分子量越高分数估计与校正曲线(图11)显示常用对数之间的关系和比例 洗脱体积和孔隙体积。表2显示的值 分子量越高分数在不同的反应时间和温度。

估计分子量几乎比得上第一的色谱峰的位置数据7- - - - - -9。Boc-Gly-L-Asp 24 h的样本反应给以下值:4400年,7000年,110年和4600年达120,和130°C。合适的反应条件的组合给分子量最高,和温度太高了低分子量的提高退化。反应时间的影响,在相同的温度下可以看到详细的反应在130°C。较短的反应时间给一个低分子量但高反应时间(2800年、4100年和6900年1、2和4 h,职责);中反应时间给分子量最高:7800 8小时;反应时间越长给了低分子量(5400年和4600年达16和24 h,职责)。其他基质导致类似的趋势衬底5。

3.5。氨基酸组成和D / L比值残留物的高分子量分数

氨基酸组成和D / L比值较高分子量的acid-hydrolysate分数表中列出3。

氨基酸成分几乎是即使在理论值的水平与分子量越高获得的玉米胚芽蛋白酶解物的分数Boc-dipeptides在较低的温度和较短的反应时间。然而,玉米胚芽蛋白酶解物的获得高分子量的分数更高的温度和更长的反应时间给更高的成分氨基酸天冬氨酸以外,因为后者更不稳定分解温度升高时比其他氨基酸。产品的玉米胚芽蛋白酶解物形成三肽衍生物:Boc-Gly-Gly-L-Asp给通用电气和Asp的比率2:1。水解后的氨基酸复苏几乎定量的数量从76%。

关于D / L比值,的摩尔比率D-isomer L-isomer的天冬氨酸较高的玉米胚芽蛋白酶解物产品更高的温度和更长的反应。从产品为0.142 D / L比值在130°C 24 h, 0.189在150°C 2 h, 0.596在170°C 2 h。其他氨基酸的D / L值低于天冬氨酸。D-isomers的存在可以解释为外消旋作用[22的天门冬氨酸多肽或L-aspartyl残留的差向异构化作用。天门冬氨酸经历最快的外消旋化和差向异构化作用的蛋白质的氨基酸,因为特别天冬氨酸的残留物形成酰亚胺结构,促进差向异构化作用[23- - - - - -26]。然而,如果选择一些更好的反应条件,这样的外消旋化和差向异构化作用可以最小化低于10%。相比之下,外消旋化和Asp残差向异构化作用可能在1%到2%的范围进行8 h水解在110°C。多肽的实际的D / L值必须低于1%到2%的结果表3。

3.6。低分子量的分析分数

高效液相色谱的结果Boc-dipeptides加热反应混合物(5 a - c)给两个峰的色谱图通过g - 3000点,而Boc-tripeptide (Boc-Gly-Gly-L-Asp:5 d)给只有一个(图12(一)Boc-L-Val-L-Asp (5度)和(b) Boc-Gly-Gly-L-Asp (5 d))。

色谱(a)给只有一个峰值,但(b)给了两座山峰,保留时间越长峰是由低分子量的产品。红外光谱(图12)的低分子量Boc-L-Val-L-Asp分数显示组织的吸收酰胺(1663厘米⁻¹)和羧基(1717厘米⁻¹)或酰亚胺和Boc-Gly-Gly-L-Asp显示二酰胺的红外光谱,以及羧基、酰胺我(1545、1717和1663厘米⁻¹、职责)。从反应混合物低分子量分数Boc-L-Val-L-Asp (5度)羧基和氨基团体而不是线性肽,分数是建议的结构包括2,5-diketopiperazine (DKP) [27)或一种酰亚胺(20.)结构。

3.7。假设热Boc-Peptides反应机制

很多特性的热的反应底物Boc-peptides和上述产品,我们建议热反应的反应机理图中描述14。

可能有三个反应中间体,6,7,8,从基板5罪犯对多肽9。中间6可能产生通过释放2-butene和二氧化碳。中间7可能先释放产生的水。中间8从中间体可能产生6和7或从衬底5模拟直接。实际的反应混合物可以包括三个中间体(6,7,8),因为气体的分析直接从热注入对质谱仪的反应表明,三个气体不断进化,在相同的温度下,虽然订单有限公司₂然后2-butene(数字+水3和4)。因此,中间体6和8可以产生多肽9。中间6将直接脱水氨基和羰基之间产生一个肽键。中间8会受到一种氨基酸组开放酐组和两种肽键连接使用吗α- - -β羧基组;然后完成脱水使得酰亚胺(10在多肽()债券9)。

二肽衍生物的一部分(5 a - c)形成六元环化合物(2,5-diketopiperazine: DKP (11)[27),这可能不再聚合。DKP低分子量的存在分数可以支持的红外光谱(B)(图13),它的吸光度DKP(1663厘米⁻¹羧基)和羧基(1710厘米⁻¹)。另一个估计结构显示吸光度为1710厘米⁻¹可能是一个四肽酰亚胺结构复合吗10( ; ),它可以通过耦合两个二肽的形式,例如,Val-Asp5度在图14。然而,酸酐化合物的结构10会开了部分水解在色谱法。如果四肽酰亚胺环化从头到尾结构,由此产生的产品将有两个五元环胺和十二环肽。因此,低分子量部分可能包括DKP和四肽酰亚胺结构。隔离这些化合物的进一步研究将证明的假说。

本文结果显示,加热反应N-Boc-oligopeptides给更高的分子肽,具有几乎相同的氨基酸成分开始基质。

结果表明多肽产品建立了顺序结构但不是清楚。可能会有一些情况下,收益率支多肽,可以在反应的酰亚胺结构deprotected寡肽,如图15。由于化学结构非常复杂,可能需要进一步的研究来阐明细节在未来的研究。

4所示。结论

这个调查表明第一个简单的连续加热合成copolypeptides通过肽衍生品。热的反应,Boc-peptides融化,释放保护组,多肽和脱水。热分析支持的机制是伴随着质谱。控股氨基酸残基的聚氨基酸结构是由氨基酸分析。D / L比值在较低温度下被压制在10%以下。这些结果表明,使用Boc-peptides热的反应可能是有用的生产顺序多肽。顺序结构,不是证明在未来的研究中应当明确。

信息披露

Takafumi山田目前基本技术研究中心附属,东京都医学科学研究所Setagaya-ku, 156 - 8506年东京,日本。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢已故的名誉教授Kaoru Harada筑波大学的富有成果的讨论。