文摘

Poly-R-hydroxyalkanoates (pha)聚合物产生的应力条件下大量的细菌物种。pha展览不同的热力和机械性能取决于他们的分子结构。在这个工作中,pha生产使用鳄梨油作为碳源。贪铜菌吊钩虫拿H16在三级发酵培养使用果糖在细胞生长阶段和鳄梨油在PHA合成阶段。不同浓度的鳄梨油被使用在第三阶段测试的各种单体的单位到pha。在发酵生物量和PHA生产测量。DSC、红外光谱、气相色谱法分析辅助PHA表征。不同比例3-hydroxybutyrate 3-hydroxyvalerate在场的主链根据鳄梨油的浓度。结果表明,鳄梨油是一种可行的新基质PHA生产。

1。介绍

Poly-R-hydroxyalkanoates (pha)聚合物合成了大量的细菌物种应对不平衡的营养条件(1]。pha的热塑性聚酯R-hydroxy alkanoic酸和颗粒,而积聚于细胞内表现出不同的性质取决于他们的化学成分2,3]。一个单体形成的pha链通常包含从3到15个碳原子4),但pha的最终化学成分与合成器微生物、碳源、文化条件,和PHA-synthase酶的特异性5- - - - - -7]。均聚物、共聚物或可获得pha的三元共聚物;例如,PHA合成共聚物可以结合不同的基质(8]。PHA的热性能,如熔化温度和结晶度,取决于PHA的长度单体的单位。单体含有五个碳原子以上显著减少聚合物熔融温度,以及结晶度(9]。

许多pha主链由单体与不同数量的碳原子。Short-length-chain pha ()由单体从3到5个碳,而medium-length-chain pha ()是由单体形成包含6到14个碳原子(4,8]。一个保利(3-hydroxybutyrate) (PHB)是最常见的PHA和在1926年首次被莫里斯Lemoigne1,4]。PHB生物降解性和生物相容性使得它成为极具吸引力的材料;然而,其脆性和结晶度的匮乏制约了其可能的应用程序。PHB的熔点(≈175°C)也非常接近其分解温度(≈180°C),后者创建挑战热处理由于狭窄的处理窗口(10]。(共聚物聚等)- hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate (PHBV)包含(3)羟基丁酸(3 hb)和(3)-hydroxyvalerate(3高压)链中的单位显示低分子量和更低的融化温度相比,PHB均聚物。巴别塔和Steinbuchel11]报道的融化温度170,162,150,145,和137年3高压在3,9日,14日,20日和25摩尔%的内容,分别。

可再生的碳源,如蔗糖、纤维素和三酰甘油作为PHA合成基质。广泛的研究都是在使用廉价的基质进行的,包括淀粉、甘油、豆油、甘蔗蔗渣、糖蜜,活性污泥,减少生产成本的PHB的5,12- - - - - -14]。同样,从食品和副产品agroalimentary行业,甲烷,矿物油,褐煤被用来合成PHBV共聚物(1,4,15,16]。因此,碳源和微生物消耗关联特定pha的生产具有十分重要的意义。

已广泛应用于生物的合成pha贪铜菌吊钩虫拿(原Ralstonia eutropha),由于其多功能性聚合物积累量高达90%的干电池重量(起重集团)6]。的能力c . necator合成PHB和PHBV以及其他pha,之前已经报道过(6,20.,21]。限制生产成本导致了建议使用便宜的碳源,如有机垃圾、废水,甚至植物油(22]。使用复杂的碳源也可以延长3高压单位主链的公司甚至的合成(8]。

脂肪酸的使用,如存在于植物油,作为碳源驱动β——脂肪酸氧化代谢途径c . necator。PHA合成的c . necator是高度相关的生长条件,由乙酰辅酶a前体(23,24]。在平衡的营养环境中,脂肪酸为前体,自由能,代数余子式对细胞生长和维护和高分子合成。相比之下,非营养限制导致中央三羧基的周期的酶抑制(柠檬酸循环)。因此,乙酰辅酶a是引导到PHA合成23- - - - - -25),如图1。

墨西哥鳄梨(Persea美国)是一种lipid-rich水果,在市场上占有突出地位26]。在2015年,51.4%的全球商业化在墨西哥鳄梨是(26]。在其培养,产生大量的废弃物。例如,在墨西哥,近54%的年度鳄梨生产被认为是浪费。此外,农业、包装、运输和商业化阶段也鳄梨废物的重要来源(27]。此外,果皮和种子,代表12 - 15%和20 - 27%的水果重量,分别目前丢弃。只有果肉注定人类消费(28]。

墨西哥鳄梨中的脂肪酸组成主要包括软脂酸、硬脂,油酸,亚油酸,庚,壬,十七酸(26]。脂肪酸的含量高,其培养所产生的垃圾数量确定鳄梨是一个可能的和可持续的碳源的生物合成pha。第一次尝试,标准化衬底的化学成分,从鳄梨油PHA合成的可行性c . necator进行了测试。不同的生物聚合物合成油热,化学特征内容演示使用这种油的可行性作为PHA生产另一种衬底。

2。材料和方法

2.1。应变、媒体和材料

c . necatorH16(写明ATCC 17699)是生长在矿物中补充了果糖24 h,在30°C和200 rpm,种子文化准备。每升水中含有10 g果糖,3.70 g (NH₄)₂所以₄,0.40 g MgSO₄,6.36 g Na₂HPO₄h·7₂啊,2.70 g KH₂阿宝₄和1.0 g营养肉汤。

增长中包含每公升的水,10 g果糖,1.57 g NH₄所以₄、5.66克不₂阿宝₄h·12₂啊,1.5 g KH₂阿宝₄,0.2 g MgSO₄h·7₂哦,10毫克CaCl₂h·2₂啊,20毫克FeSO₄h·7₂啊,和1毫升的微量元素的解决方案(0.3 g H₃薄₃,0.2 g CoCl₂h·6₂啊,0.1 g ZnSO₄h·7₂O, MnCl 30毫克₂h·4₂O, 30毫克Na₂MoO4·2 h₂啊,20毫克NiCl₂h·6₂啊,和10毫克CuSO₄h·5₂HCl 0.1 O, N的解决方案);pH值调整到7。

商业墨西哥鳄梨油PHA合成是获得从一个批处理(此句生产数量)(Ahuacatlan、墨西哥),以确保均匀衬底的化学成分。

2.2。发酵的研究

2.2.1。剂制备

实验在重复使用200毫升的增长在500毫升玻璃瓶媒体30°C, pH值7.0,与旋转搅拌孵化器在200 rpm(4300年新布伦瑞克英诺华,美国)。10% v / v的种子文化被用来接种生长介质获得0.13 g L⁻¹(初始生物量(±0.1)X在生长介质)。

2.2.2。发酵

发酵过程组成的三个不同阶段进行如下。

阶段1。分批培养在一个初始碳/氮14 (C / N)比使用生长培养基:碳消耗在中(3 g L⁻¹果糖)阶段的长度决定。

阶段2。馈料式阶段增加生物量密度的C / N比6.5:两种添加果糖和铵。之外的时间是确定的时候剩下的果糖在媒体上达到大约3 g L⁻¹。

阶段3。PHA在氮限制的条件下生产:鳄梨油添加到文化的开始阶段,30 h。不同浓度进行了测试:5、10、15、20日和25% (v / v)。

控制实验包括额外的烧瓶准备使用果糖作为三级发酵的碳源。

2.2.3。分析方法

每两个小时发酵采集标本,立即在10000转离心10分钟在4°C。果糖和铵在上层清液进行分析,和底部的颗粒(生物质)用蒸馏水彻底清洗使冻干前的重量估计干电池权重(起重集团)。

果糖摄入发酵媒体使用3是量化,5-dinitrosalicylic酸(DNS)方法(29日]。消费是根据协议分析Weatherburn铵(30.]。

提取胞内聚合物使用氯仿从冻干生物量生物量(1 g每50毫升溶剂)60°C与恒定搅拌30分钟。孵化后,PHA溶解在氯仿相过滤消除细胞碎片,然后用己烷沉淀。残留溶剂的聚合物是被蒸发31日,32]。

无量纲生物质产量()估计生物质生产的数量比底物消耗总量。这是计算的阶段1和2。生产率估计在年底最后PHA作为发酵浓度达到除以总培养所需的时间达到浓度。最后残留的生物量也计算最后的发酵生产生物质(CDW) - PHA浓度。

2.3。PHA表征

2.3.1。气相色谱法

脂肪酸甲基酯来自酸甲醇分解为4 h 100°C的PHA孵化100毫克的PHA, 2毫升氯仿,2毫升的甲醇(20%的盐酸)和苯甲酸(内部标准)硼硅玻璃管与螺旋帽在100°C 4 h。冷却后,添加蒸馏水(1毫升)管涡了60年代,包含产生的甲基酯的低阶段恢复进行分析(33]。脂肪酸甲酯(1μL)分析了气相色谱仪(SRI仪器,型号310,美国)配有火焰离子化检测器(FID)和一个6英尺。×1/8。硅胶柱。氮在30毫升分钟⁻¹作为载气,注入器和检测器是设定在220和170°C,分别。参考标准是聚羟基丁酸)和共聚物聚(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate)[12摩尔% hydroxyvalerate](格拉汉姆·古德费勒、英国)。

2.3.2。傅里叶变换红外(FTIR)光谱

红外光谱波数范围内进行了从600年到4000厘米⁻¹(美国巴克科学,530)。PHA是溶解在氯仿浇注前解决方案到KBr板块形成聚合物薄膜。

2.3.3。差示扫描量热法(DSC)

DSC曲线得到使用差示扫描量热计(梅特勒-托利多DSC 823)根据Lopez-Cuellar et al。6]。大约4毫克的标本在铝锅卷曲。样品在下列条件下进行评估:动态氮气氛50毫升的最小值⁻¹,10°C以上的升温速率⁻¹和一个扩展的温度范围(−40到200°C)。两个运行在相同条件下进行;第一次运行删除样本的热历史。温谱图获得在第二次运行进行分析来确定熔化温度()和熔化焓(pha的)。纯的PHB(格拉汉姆·古德费勒、英国)作为参考标准。

3所示。结果

3.1。发酵的研究

代表pha合成的概要文件c . necatorH16使用果糖和鳄梨油作为碳源是描绘在图2。

阶段1(图2(一)),进行分批培养,持续了17个小时,由添加10 g L⁻¹果糖和0.42 g L⁻¹铵的媒介。10 h的滞后阶段发生。底物的浓度(即。果糖在舞台上1)降低10到3.3 g L⁻¹(±0.10),而生物量密度、重量分析地测量作为起重集团从0.13增加到1.44 g L⁻¹(±0.06)实现增长收益(0.19)。

阶段2(图2(b)),进行馈料式培养细胞密度增加,持续了大约12.5 h。果糖作为底物添加在两个不同的场合:17.5 h和24 h(图2黑色的箭头)。第一个除了包括3 g L⁻¹果糖和0.21 g L⁻¹铵。第二,中补充了2 g L⁻¹果糖和0.12 g L⁻¹铵。在舞台上2,生物量密度从1.44(±0.06)增加到3.79 g L⁻¹(±0.09),消耗约5.63 g L⁻¹果糖(±0.03)。在结束阶段2,平均0.42实现的匹配理论产生单糖作为碳源时0.30 - -0.40)(8]。此外,一个轻微的PHA观察积累,但这只代表了不到30%的起重集团同意平衡营养条件。

合成pha(阶段3)首次观察到30 h(图2(c))。剩下的果糖在中约为1.9 g L⁻¹在这个阶段的开始。鳄梨油添加到烧瓶在单个添加在开始阶段诱导聚合物合成。鳄梨油浓度测试是0(用作控制),5、10、15、20日和25% (v / v)。阶段3持续了20 h。在这段时间里,氮水平保持在0.1 g L⁻¹生成细胞积累压力,促进聚合物(6]。观察果糖的快速消费的开始阶段,年底前阶段,果糖几乎没有检测到在中(< 0.5 g L⁻¹)。

结果50 h,三级发酵在表中做了总结1。大量的PHA观察积累,从59起重集团的70%。积累的结果,一个积极的趋势PHA在烧瓶和鳄梨油浓度的5、10、15,20% v / v。PHA浓度最高时达到了石油在媒体上为20% (v / v)与PHA的值3.48 g L⁻¹(±0.04)实现,代表70.8%的累积PHA起重集团。然而,烧瓶和石油浓度为25% (v / v)显示PHA积累效率下降,达到约3.07 g L⁻¹(±0.02)。实验的总体生产率波动在0.053和0.070之间g L¹h⁻¹。

相反,控制实验(0%的联邦石油)产生77%的聚合物,几乎达到典型的80 - 85% PHA累积应变的报道(34]。

3.2。通过气相色谱pha成分分析

从气相色谱,pha的化学成分决定使用苯甲酸(内部标准)作为评价的基础。代表提出了评价甲基酯的色谱图3。参考标准和样品的保留时间是一致的(5.516分钟3-hydroxybutyrate [3 hb), 7.150分钟3-hydroxyvalerate[3高压])。

最丰富的单体在所有样本中发现3 hb单体从92.8到98.94%,再辅以鳄梨油样品,总结如表2。在所有情况下,3高压单体的单位也承认,从1到7摩尔%。最高hydroxyvalerate数量被发现在PHA合成从20% (v / v)的石油,匹配的生物量配置文件。一个不寻常的观察模式,积累3高压单位高度依赖鳄梨油浓度,达到一个最大值的7%(图2(c))。其他3-hydroxy-acids包含超过五个碳也发现在某些pha,但在最小数量(即。,不到0.16摩尔%)。因此,鳄梨油可以促进pha合成含有3 hb和重要的分数3高压单体。

3.3。官能团红外光谱鉴定(红外光谱)

pha的光谱记录,描绘在图4,类似于PHBV光谱在先前的研究报告(35]。pha的pha表现出特定的化学键和复制样品的吸收光谱。

最突出的峰,位于约1720厘米⁻¹是有关酯羰基(C = O)。乐队位于该地区的2800 - 3000厘米⁻¹与methyl-methylene组。这些山峰的存在是由于CH的对称和非对称拉伸₃和CH₂相关组织和这些山峰侧链中单体的单位。除了C = O组,一个不对称的碳氢键在CH弯曲振动₃在1453 cm组显示了一个吸收带⁻¹债券显示了一个在1378年达到顶峰,而C-O-H [36]。其他山峰被记录在1100到1290厘米⁻¹地区;乐队发现约1176、1221和1270厘米⁻¹归因于聚合物晶体结构,它们的存在是C-O-C相关官能团(24]。

3.4。通过DSC热性能

第二次运行期间获得的记录温谱图的pha的DSC分析如图所示5。合成pha的熔点范围从159到173°C,而测量是51 - 57 J g⁻¹(表2)。观察了一个下降趋势值与增加石油浓度。最低的和v / v值达到20%,在159°C和51.81 g J⁻¹,分别。一个石油浓度超过20% v / v的增加引起的PHA合成。单体更高数量的碳的痕迹被发现在一些美联储石油样品;然而,这些单体没有确定,所表2。

控制的热性能实验(0%的联邦石油)也估计和比较对PHB参考标准。示例美联储0%的石油是175.16°C值为67.05 g J⁻¹。PHB的参考标准为176.3°C值为75.48 g J⁻¹,与之前的报道相一致37,38)和确认生产纯的PHB的控制。

4所示。讨论

不同的pha合成c . necatorH16瓶系统使用果糖和鳄梨油作为底物。发酵进行了使用一个三级流程为了增加生物量密度和聚合物积累,而不会引发果糖的底物抑制报道发生在水平高于10 g L⁻¹(39]。不同石油浓度(5、10、15、20日和25% v / v)进行评估在PHA合成阶段3。控制实验,以果糖为碳源在整个过程中,补充研究。

以前的烧瓶研究通常进行批处理模式(12,17- - - - - -20.),整体生产力从0.025到0.08 g L¹h⁻¹(表3)。在最近的研究中,获得了非凡的生产力,从0.05到0.07 g L¹h⁻¹,评估石油浓度(% v / v)。相似的研究取得了0.025和0.05 g L之间的生产力¹h⁻¹(17,19]。最高的生产力之前报道了使用简单的糖作为碳源(12),就像这里的生产率报告控制样品(0.081 g L¹h⁻¹)。因此,三级发酵的可行性确认并建议一个互连系统的运作模式和应变的亲和基质(34]。

最大生物量收益率达到了20% v / v油在中。烧瓶与25% v / v油细胞密度和减少聚合物积累。这个收益率下降可能与氧转移限制或底物抑制(40]。可能,大型石油大量减少氧转移到细胞,从而延缓高分子合成与积累。然而,进一步的研究需要在更大的尺度上分析氧气传输动力学。

C。necatorH16是众所周知的表现出偏爱合成pha包含3 hb单位最丰富的单体不管碳源,甚至从植物油。一些研究证实了合成PHB的纯C。necator生长在植物油(41]。相反,Du et al。42)实现PHBV的生产利用食物残渣的脂肪酸,而丹尼斯et al。18]证明了c . necator合酶可以接受C6基质(表3)。一些研究也发现了大单体的单位当使用植物油作为碳源(6,21]。

在目前的研究中,pha主要由3 hb单体组成,其次是3高压从1到7摩尔%,和少量的3公顷(超过5个碳)。有趣的是,所有的样品用鳄梨油包含可识别3高压单体和这些单体的存在是与石油浓度介质高度相关。以某种方式、特定的脂肪酸组成的鳄梨油似乎促进3高压前体的形成。尽管Ganzeveld et al。19)使用离心机发酵有机废物和刘et al。20.]使用棕榈油产生相同的共聚物在这项工作(PHBV), 3高压单体的公司并没有得到充分的研究当植物油作为底物(表3)。

pha的热性能增强了3高压单体聚合物的存在。据巴别塔和Steinbuchel11),取决于3高压纳入聚合物的百分比。合成pha的熔化温度范围从159到173°C,按照3高压摩尔%内容(1 - 7摩尔%)。3高压单元聚合物的存在,甚至少量的其他3公顷PHA的一般热性能的改善。因此,鳄梨油作为PHA合成的底物促进了更多功能的生产材料比得到纯的PHB [43,44),证明了DSC、FTIR和GC分析。

5。结论

c . necatorH16能够将少量的3高压单位纳入PHA共聚物,鳄梨油用作PHA合成基质。pha表现出不同的单体的组成和性质,根据增加油的浓度。然而,产量最高,与更大的公司更大的单体单元(高压和更多),获得了20% (v / v)石油时补充道。公司从1到7的摩尔% 3高压单体的单位到高分子主链了。结果证实使用鳄梨油的可行性作为PHA生产过程的可再生碳源。

信息披露

部分结果这手稿被描述成一个抽象的第九次代表大会FEBiotec(生物技术)的年度大会。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

婀瑞思利Flores-Sanchez受补助的支持从CONACyT(不接收。417745)。这项研究部分由CONACyT (CONACyT infr - 2015 - 254437和CONACyT - cb - 2014 - 239553)。作者承认Alba-Flores乔尔(CINVESTAV)技术援助在实验的发展。支持Piliado-Hernandez D.M. (ITESM)和Gonzalez-Bret k在这个手稿的写作也赞赏。